專利名稱：：改進(jìn)的發(fā)光測定的方法和裝置的制作方法本申請系1991年2月6日提交的題為“電致化學(xué)發(fā)光測定”(申請?zhí)?7/652427，發(fā)明人Massey等)(該申請案又系1988年11月3日提交的申請?zhí)枮?66882的申請案的繼續(xù)部分，現(xiàn)已放棄)的待批專利的繼續(xù)部分，本申請也系1990年6月18日提交的申請?zhí)枮?39389(該申請案又系申請?zhí)枮?66882的繼續(xù)部分)的申請案的繼續(xù)部分。本申請又是Massey等與題為“含有復(fù)合磁體的磁微?；l(fā)光測定的方法和裝置”(CMS登記號370068-3401)的申請案(該申請案又系申請?zhí)枮?7/652427的申請案的繼續(xù)部分)同時提交申請的申請案。上述有關(guān)申請均為本申請案的參考文件。本申請一般涉及進(jìn)行結(jié)合測量的方法和裝置，具體地說涉及通過測量由測量系統(tǒng)中的一個或多個標(biāo)記化合物發(fā)射的發(fā)光測定有意義被分析物，更具體地說，本發(fā)明涉及高靈敏度的準(zhǔn)確、精密和能重現(xiàn)的均相或多相特異性結(jié)合測量，其中在產(chǎn)生電致化學(xué)發(fā)光前，發(fā)光組分富集在測量組合物中并在檢測系統(tǒng)上進(jìn)行收集。關(guān)于檢測和定量分析生化物質(zhì)和生物物質(zhì)中的分析物，已經(jīng)研究和發(fā)展了許多方法和體系。能夠測量痕量微生物、藥物、激素、病毒、抗體、核酸和其他蛋白的方法和體系對研究人員和臨床工作人員則具有重要的意義。采用已知的結(jié)合反應(yīng)方法，已經(jīng)能檢測和分析大量物質(zhì)，例如抗原-抗體反應(yīng)，核酸雜交技術(shù)和蛋白-配位體系統(tǒng)。許多生化和生物結(jié)合體系中的高度特異性產(chǎn)生了對研究和診斷具有重要意義的許多測量方法和系統(tǒng)。具體地說，在一種或多種結(jié)合材料上是否存在可觀察量的標(biāo)記物，即可說明是否存在有意義的分析物。特別有意義的是通過光化學(xué)、化學(xué)和電化學(xué)方法，將標(biāo)記物制成發(fā)光材料。“光致發(fā)光”是一種當(dāng)材料吸收電磁輻射時能誘導(dǎo)發(fā)光的方法。螢光和磷光則是光致發(fā)光的典型例子?！盎瘜W(xué)發(fā)光”方法則是通過能量的化學(xué)轉(zhuǎn)化提供發(fā)光的方法。“電致化學(xué)發(fā)光”是通過電化學(xué)方法提供發(fā)光?，F(xiàn)已發(fā)展起來的化學(xué)發(fā)光測量技術(shù)是將含有意義分析物的樣品與用化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物標(biāo)記的反應(yīng)物相混合，該反應(yīng)混合物經(jīng)誘導(dǎo)后，某些部分的標(biāo)記反應(yīng)物與分析物結(jié)合。誘導(dǎo)后將混合物的結(jié)合部分與未結(jié)合部分分離，這兩部分或其中的一部分中標(biāo)記物的濃度可通過化學(xué)發(fā)光方法進(jìn)行測定。這兩部分或其一部分中所測定的化學(xué)發(fā)光的量可說明生物樣品中有意義的分析物的含量。電致化學(xué)發(fā)光(ECL)測量技術(shù)是對化學(xué)發(fā)光技術(shù)的改進(jìn)。該方法提供了靈敏精密地測量有意義分析物的存在及其濃度。使用這類方法時，將經(jīng)過誘導(dǎo)的樣品通過伏安工作電極激發(fā)發(fā)光。在特定的化學(xué)環(huán)境中，這種電致化學(xué)發(fā)光是在一定的時間和采用一定的方法的條件下施加在工作電極上的電壓激發(fā)的。測量由標(biāo)記物產(chǎn)生的光，從而可說明分析物的存在或其含量。關(guān)于電致化學(xué)發(fā)光的詳細(xì)介紹，可參閱PCT已經(jīng)公開的專利申請文件US85/01253(W086/02734)、US87/00987和US88/03947，上述文獻(xiàn)也系本文的參考文獻(xiàn)。在進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光測量時，最好在測量程序中不需要分離步驟，并且對不同濃度分析物的信號調(diào)制放至最大程度，從而能獲得精確靈敏的測量。在不分離測量的已有方法中，將微顆粒懸浮在測量樣品中，與一種或多種測量結(jié)合組分相結(jié)合。美國專利4305925涉及使用濁度測定法和比濁法檢測和測定與臨床有關(guān)的蛋白和肽，所公開的方法包括將抗原或抗體與具有光散射或光吸收作用的乳膠顆粒相結(jié)合。美國專利4480042涉及使用由殼芯顆粒組成的顆粒試劑的技術(shù)，其顆粒殼層含有有意義生物化合物能與之共價結(jié)合的官能團(tuán);而且殼芯的高反應(yīng)指數(shù)形成了對光散射測量的敏感性。該技術(shù)是以凝集反應(yīng)為基礎(chǔ)，其由二價抗體與多價抗原反應(yīng)產(chǎn)生能用各種方法檢測和/或測量的凝集物。美國專利4419453也涉及可用于檢測是否存在免疫化學(xué)物質(zhì)(例如抗體和免疫原)的帶色乳膠凝集測定方法的應(yīng)用。根據(jù)該項已有技術(shù)，似乎并不可能將微顆粒用于測量發(fā)光現(xiàn)象。但是可望由游離化學(xué)發(fā)光或電致化學(xué)發(fā)光部分產(chǎn)生的發(fā)光可被吸收、散射、甚至還會受到微顆粒物質(zhì)的影響。出乎意料的是美國專利539389(PCT申請?zhí)朥.S.89/04919)公開了發(fā)光現(xiàn)象的靈敏的特異性結(jié)合測定方法，其中惰性微顆粒可與測定體系中的一個結(jié)合反應(yīng)物進(jìn)行特異性結(jié)合。該項測量可在多相(一個或多個分離步驟)中進(jìn)行，而在均相(無分離步驟)中進(jìn)行則更為有利。美國專利89/04919涉及用于測量發(fā)光現(xiàn)象的結(jié)合反應(yīng)的組合物，該組合物包括具有能與測量混合物中的組分相結(jié)合的表面的復(fù)合懸浮顆粒。另一方面，還提供了檢測或定量分析樣品中被分析物的系統(tǒng)，該系統(tǒng)用本發(fā)明的測量組合物能夠?qū)崿F(xiàn)測量方法。該系統(tǒng)包括在測量介質(zhì)中將標(biāo)記化合物誘導(dǎo)發(fā)光的裝置和用于檢測樣品中被分析物的發(fā)光測量裝置?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，測量系統(tǒng)中與電致化學(xué)發(fā)光部分相連接的組分與懸浮微顆粒相結(jié)合，可以大大調(diào)制由與該組分相連接的電致化學(xué)發(fā)光部分產(chǎn)生的發(fā)光信號的強(qiáng)度，從而提供了監(jiān)測測量系統(tǒng)中特異性結(jié)合反應(yīng)的裝置。更令人驚奇的是還發(fā)現(xiàn)，懸浮顆粒對由與該系統(tǒng)中的組分相連接的電致化學(xué)發(fā)光部分所產(chǎn)生的發(fā)光信號強(qiáng)度的影響很小或沒有影響，所述系統(tǒng)中的組分仍未與懸浮微顆粒結(jié)合。因此，美國專利89/04919中所述檢測樣品中被分析物的方法包括如下步驟(1)組成組合物，該組合物含有(a)含有可能存在著所需被分析物的樣品;(b)用于測量的物質(zhì)，選自(ⅰ)需要測量的分析物或類似分析物;(ⅱ)需要測量的分析物或類似分析物的結(jié)合對象;和(ⅲ)能與(ⅰ)或(ⅱ)結(jié)合的反應(yīng)組分，其中所述用于測量的物質(zhì)中的一種物質(zhì)與具有能誘導(dǎo)發(fā)光的化學(xué)部分的標(biāo)記化合物相連接;和(c)能與分析物和/或(b)(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)中所述物質(zhì)特異性結(jié)合的復(fù)合懸浮顆粒;(2)溫育組合物，形成含有顆粒和所述標(biāo)記化合物的復(fù)合物;(3)將標(biāo)記化合物誘導(dǎo)發(fā)光;以及(4)測量由組合物發(fā)射的發(fā)光，檢測存在于樣品中的被分析物。通過將測量組合物的發(fā)光與含有已知量的被分析物的組合物的發(fā)光的對比，上述同類方法都可用于定量分析樣品中被分析物的含量。類似被分析物可以是天然的，也可以是合成的，它們是具有與被分析物可作對比的結(jié)合特異性的化合物，但是也包括結(jié)合能力較高或較低的化合物。適宜用于本發(fā)明的結(jié)合對象均為公眾所熟悉的，例如有抗體、酶、核酸、外源凝集素、輔因子和受體。能與被分析物或其類似物和/或與其結(jié)合對象結(jié)合的反應(yīng)組分可以是次級抗體或諸如蛋白A或蛋白G的蛋白，也可以是抗生物素蛋白或生物素，或本領(lǐng)域已知的能參與結(jié)合反應(yīng)的其他組分。發(fā)光最好是由標(biāo)記化合物(不管其是否已與特異性結(jié)合對象結(jié)合或未結(jié)合)經(jīng)伏安工作電極作用誘導(dǎo)的電致化學(xué)發(fā)光(ECL)產(chǎn)生的發(fā)光。電致化學(xué)發(fā)光反應(yīng)混合物在一定的時間和以一定的方法，在工作電極上施加電壓，使之產(chǎn)生光，從而有控制地發(fā)射出光。雖然發(fā)射可見光較好，但是組合物或系統(tǒng)也可以發(fā)射其他類型的電磁輻射，例如紅外光或紫外光、X射線、微波等。本文所用的術(shù)語“電致化學(xué)發(fā)光”、“電致化學(xué)發(fā)光的”、“發(fā)光”、“發(fā)光的”和“發(fā)射光線”都包括發(fā)射光和其他形式的電磁輻射。美國專利89/04919所介紹的方法，要求在研究和臨床方面進(jìn)行的各種測量中，檢測和定量分析非常少量的被分析物。研究人員和臨床人員的需要使之成為非常迫切地減少采用這些方法進(jìn)行測量的種種檢測限制，提高這些測量的靈敏度以及他們能夠進(jìn)行測量的速度。在將各種標(biāo)記物進(jìn)行測量前，先將它們富集，從而增強(qiáng)由它們產(chǎn)生的信號，關(guān)于這方面的各種方法均為公眾所知。在美國專利4652333中，用熒光、磷光或原子熒光標(biāo)記物標(biāo)記的顆?？稍跍y量前通過微過濾進(jìn)行濃縮。在測量前富集標(biāo)記免疫化學(xué)物質(zhì)的方法也已為本領(lǐng)域的公眾所了解，例如可將磁性感應(yīng)標(biāo)記顆粒移近測量容器的表面。在美國專利4731337、4777145和4115535中，就是先將顆粒移近容器壁，然后發(fā)射激發(fā)光的熒光。在美國專利4945045中，顆粒富集在磁性電極上。電化學(xué)反應(yīng)發(fā)生在通過標(biāo)記化學(xué)介體改進(jìn)的電極上。發(fā)生結(jié)合時，免疫化學(xué)結(jié)合反應(yīng)改變了產(chǎn)生調(diào)制信號的介體的效率。已有方法均不涉及本發(fā)明的表面選擇性激發(fā)的方法。盡管表面激發(fā)(例如電致化學(xué)發(fā)光)不受任何機(jī)械學(xué)上解釋的限制，但是可以認(rèn)為固相復(fù)合物上的標(biāo)記物必然在電極上被氧化，這就需要電子由標(biāo)記物向電極移動。還可以認(rèn)為，電子的這種“躍變”是由于已知的隧道現(xiàn)象產(chǎn)生的，即電子不必“越過”勢壘就能通過空間(勢能很高的區(qū)域，例如溶液)。電子能夠通過勢壘無需另外輸入能量，即能夠由一個分子向另一個分子移動，或由一個分子向電極移動。但是這種隧道現(xiàn)象僅能發(fā)生在非常短的距離內(nèi)，隧道現(xiàn)象的概率以兩種增加之間距離的指數(shù)下降。如果距離小于25A(2.5nm)，則發(fā)生在兩者之間的隧道現(xiàn)象的概率非常高;如果距離很大，則概率很低。25A的距離是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員使用的經(jīng)驗法則，并非絕對限制。因此，只有具有25A電極表面的那些電致化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物才能可望參與電致化學(xué)發(fā)光的過程。一般說來，在25A電極表面范圍內(nèi)的顆粒面積是非常小的。因此，不能期望由顆粒表面產(chǎn)生的電致化學(xué)發(fā)光能測出任何有意義的量。但是由電致化學(xué)發(fā)光方法產(chǎn)生的光必須通過顆粒才能到達(dá)光電倍增器。由于顆粒基本上是不透明的(顆粒的濃縮懸浮液呈黑色)，即使由電致化學(xué)發(fā)光能夠產(chǎn)生大量的光，也不能期望光能通過顆粒并且用光電倍增器測量。本發(fā)明的目的之一在于提供進(jìn)行結(jié)合測量的均相(不分離)和多相(分離)的方法、試劑和裝置。本發(fā)明的目的之二在于以測量由含微顆粒物質(zhì)的測量組合物發(fā)射的電致化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)，提供不分離特異性結(jié)合測量、試劑和裝置。本發(fā)明的目的之三在于與已有技術(shù)相比提供靈敏度和精確度高、測量迅速、特異性強(qiáng)和檢測限制性低的測量、試劑和裝置。本申請中所用術(shù)語的定義為“電致化學(xué)發(fā)光部分”、“含金屬的電致化學(xué)發(fā)光部分”、“標(biāo)記物”、“標(biāo)記化合物”和“標(biāo)記物質(zhì)”均可交換使用?！半娭禄瘜W(xué)發(fā)光部分”、“含金屬電致化學(xué)發(fā)光部分”、“有機(jī)金屬化合物”、“金屬螯合物”、“過渡金屬螯合物”、“稀土金屬螯合物”、“標(biāo)記化合物”、“標(biāo)記物質(zhì)”和“標(biāo)記物”都與分子相連接，例如分析物或其類似物，分析物或其類似物的結(jié)合對象，以及所述結(jié)合對象的結(jié)合對象，或能與所述分析物或其類似物或結(jié)合對象結(jié)合的反應(yīng)組分，以上所述均屬本發(fā)明的范圍。上述各類還能與一種或多種結(jié)合對象和/或一種或多種反應(yīng)組分的組合物相連接。此外，上述各類還能與已與結(jié)合對象、反應(yīng)組分或一種或多種結(jié)合對象和/或一種或多種反應(yīng)組分的組合物結(jié)合的分析物或其類似物連接。屬于本發(fā)明范圍的還有上述各類直接或通過以上討論的其他分子與分析物或其類似物相結(jié)合。簡言之，這些配位體都可用作測量物質(zhì)。術(shù)語“檢測”和“定量分析”均表示測量，可以理解為定量分析可以要求制備有關(guān)的組合物和進(jìn)行校準(zhǔn)。術(shù)語“收集和富集復(fù)合物”可以相互交換地用于描述測量組合物中復(fù)合物的富集和在電極表面上復(fù)合物的收集。圖1表示實施本發(fā)明微顆粒無分離和分離測量的測量室。圖2表示用圖1的測量室在測量時的電壓控制裝置的簡圖。圖3表示采用電致化學(xué)發(fā)光標(biāo)記寡核苷酸和生物素電致化學(xué)發(fā)光標(biāo)記寡核苷酸作為引物直接結(jié)合PCR。圖4表示使用含生物素引物產(chǎn)生含生物素PCR產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)PCR。圖5表示所產(chǎn)生的用于以后與電致化學(xué)發(fā)光標(biāo)記寡核苷酸雜交的含生物素單鏈DNA的不對稱PRC測量。圖6表示直接將電致化學(xué)發(fā)光標(biāo)記寡核苷酸結(jié)合到含生物素PCR產(chǎn)品的特異性研究。圖7表示直接將電致化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物和含生物素寡核苷酸結(jié)合到HPV16PCR產(chǎn)物中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖8表示Ha-ras致癌基因點突變。圖9表示Aa-ras致癌基因的32P電致化學(xué)發(fā)光標(biāo)記探針鑒別電致化學(xué)發(fā)光標(biāo)記探針的特異性。圖10表示在測定Ha-ras致癌基因點突變的32P電致化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物中電致化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物相對值的測定。圖11表示HPV18快速“不洗滌”雜交測量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖12表示測量重力沉淀復(fù)合物的測量室。圖13表示重力作用下復(fù)合物沉淀距離與時間的函數(shù)關(guān)系，即Dynal顆粒的沉淀速率(Y＝-0.28+0.48X;速度＝0.5mm/min)。圖14表示在對電極不同高度測量組合物的重力室中電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與時間的函數(shù)關(guān)系，即兩墊片厚度的強(qiáng)度-時間關(guān)系的對比，其中白點表示0.015″墊片的值，黑點表示0.075″墊片的值。圖15表示在對電極表面不同高度測量組合物的重力室中測量α胎兒蛋白的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，即AFP測量室的對比，其中白點表示0.015″墊片的值，黑點表示0.075″墊片的值。圖16表示采用電磁體使復(fù)合物沉淀在電極表面上的沉淀測量室。圖17表示在磁場和重力作用下微顆粒復(fù)合物沉淀的相對速率，即磁場沉淀和重力沉淀之間微顆粒沉淀時間的對比，其中白點表示磁場沉淀值，黑點表示重力沉淀值。圖18表示裝有永久磁體的收集室。圖19表示ECL強(qiáng)度的增高與用圖18收集室進(jìn)行測量的時間的函數(shù)關(guān)系，即收集時間對ECL強(qiáng)度的作用。圖20表示在電極表面的磁力線與在電極表面下磁體取向的函數(shù)關(guān)系。圖21表示復(fù)合物離心沉淀在電極表面的旋轉(zhuǎn)液流室、本發(fā)明俘獲顆粒的離心方法和裝置以及本發(fā)明的離心液流室。圖22表示漸消波熒光的檢測。圖23和圖24表示進(jìn)行本發(fā)明的磁性微顆粒基分離或不分離測量方法的測量室和復(fù)合磁體以及磁體系統(tǒng)的復(fù)合磁體產(chǎn)生大致與電極表面相平行的磁力線。圖25表示進(jìn)行本發(fā)明微顆?；环蛛x和分離測量的測量室，該測量室采用圖23和圖24的工作電極和復(fù)合磁體。在本發(fā)明的一個最寬的實施例中，是結(jié)合測量樣品中被分析物的方法，其測量步驟包括(a)組成組合物，其含有(ⅰ)所述樣品;(ⅱ)測量用物質(zhì)，其含有與能誘導(dǎo)發(fā)光的標(biāo)記化合物連接的組分，和(ⅲ)能與被分析物或所述測量用物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合的復(fù)合顆粒;(b)溫育所述組合物，組成含有顆粒和所述標(biāo)記化合物的復(fù)合物;(c)在測量區(qū)收集所述復(fù)合物;(d)通過表面選擇性激發(fā)將所述復(fù)合物中的標(biāo)記化合物誘導(dǎo)發(fā)光;以及(e)測量受射發(fā)光，從而測量樣品中的被分析物。復(fù)合物可以通過在電極上施加電壓，在受激和誘導(dǎo)電致化學(xué)發(fā)光的電極表面上進(jìn)行收集，也可以在表面上進(jìn)行收集，然后按以下所述的表面激發(fā)誘導(dǎo)產(chǎn)生熒光。激發(fā)和檢測熒光標(biāo)記物的表面敏感技術(shù)已經(jīng)描述了總內(nèi)部反射熒光發(fā)光(TIRF)，測量標(biāo)記物的另一項表面敏感技術(shù)則采用喇曼和紅外吸收的總內(nèi)部反射。表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振是一項根據(jù)本發(fā)明可用于測量表面標(biāo)記物的光學(xué)技術(shù)。因此，本發(fā)明是采用表面激發(fā)技術(shù)激發(fā)發(fā)光的方法。然而本發(fā)明最好在測量區(qū)收集復(fù)合物，即在能夠產(chǎn)生發(fā)光的表面上收集復(fù)合物，本發(fā)明所用的另一個方法，是在測量區(qū)外收集復(fù)合物，然后將其置于測量區(qū)內(nèi)或采用其他步驟誘導(dǎo)和測量發(fā)光。復(fù)合物的收集也可采用一些不同的方法，包括重力沉淀、過濾、離心和形成部分復(fù)合物的磁性感應(yīng)顆粒的磁性吸引等方法。下面將進(jìn)一步詳述若干實施方案。采用重力在電極表面測量電致化學(xué)發(fā)光包括(a)組成組合物，其含有(ⅰ)所述樣品;(ⅱ)測量用物質(zhì)，其含有與能誘導(dǎo)電致化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記化合物連接的組分，和(ⅲ)密度大于所述組合物平衡量并能與被分析物或所述測量用物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合的復(fù)合懸浮顆粒;(b)溫育所述組合物，組成含有顆粒和所述標(biāo)記化合物的復(fù)合物;(c)將所述組合物導(dǎo)入測量室;(d)使所述組合物在所述測量室中滯留足夠的時間，從而通過重力使顆粒沉淀在所述電極表面，至少在位于該測量室容器主要部分下面的電極表面收集所述復(fù)合物;(e)通過將電壓施加在所述電極上，將所收集的復(fù)合物中的標(biāo)記化合物誘導(dǎo)發(fā)光;以及(f)在電極表面測量受射發(fā)光，從而測量樣品中的被分析物。在液流室中可以進(jìn)行連續(xù)或半連續(xù)測量，同時可以進(jìn)行分批測量。在液流室中，固相保留在測量室內(nèi)，而液體流經(jīng)和流出測量室。如果固相(例如顆粒)密度大于水(大于1.0g/ml)，則作用在顆粒上的重力使其落到室的底部。該室可以構(gòu)建成使顆粒沉向底部，而液體流經(jīng)該室，該室也可以構(gòu)建成使室中的大部分樣品都保持在ECL系統(tǒng)工作電極上的柱室中。在室中的足夠停留時間則可在誘導(dǎo)ECL前使顆粒沉淀在電極表面上。在本發(fā)明的第二個實施例中，含有密度大于測量組合物平衡量的懸浮顆粒的測量組合物可以通過離心，使顆粒移至測量區(qū)與電極接觸，誘導(dǎo)電致化學(xué)發(fā)光，也可在離心步驟中直接與電極接觸。在這個實施例中，測量室可以配置使樣品迅速轉(zhuǎn)動和包封的裝置。離心力使樣品中的顆粒由樣品外殼轉(zhuǎn)動軸向外移動，并在樣品外殼的外表面上進(jìn)行收集。這類樣品外殼的外表面可以構(gòu)成ECL測量系統(tǒng)的工作電極。在第三個實施例中，顆粒可以通過過濾從測量組合物中除去。在這個實施例中，顆粒的密度不需要大于測量組合物的平衡量。根據(jù)本發(fā)明，通過過濾溶液，可將顆粒與溶液分離和濃縮，例如在濾器表面泵集顆粒。濾器的表面可以涂上能用作ECL檢測系統(tǒng)中的工作電極的金屬薄膜。在一個較佳實施例中，懸浮顆粒是一種磁性感應(yīng)顆粒，例如可以是順磁體顆粒，也可以是鐵磁體顆粒，并且通過向顆粒施加磁場，在測量區(qū)中收集，最好直接在電極表面上進(jìn)行收集。測量室裝有磁體，當(dāng)顆粒殘留在分批室中或流經(jīng)液流室時，磁體的磁場將磁力施加在顆粒上，使它們與最靠近磁體的室的表面上的大量溶液分離。如果磁體配置在固有的方向并且緊靠ECL檢測系統(tǒng)的工作電極，顆粒則集中在工作電極的表面上。采用上述方法，在電極表面收集和濃縮復(fù)合物，可以實施對各種不同多相和均相形成物進(jìn)行結(jié)合測量。在多相結(jié)合測量中，在測量由標(biāo)記物產(chǎn)生的發(fā)光前，應(yīng)先將復(fù)合物與組合物分離。在均相測量中，對結(jié)合(固相)和未結(jié)合的標(biāo)記試劑不必進(jìn)行分離。在多相測量中，當(dāng)復(fù)合物在工作電極表面上集中時，由標(biāo)記物產(chǎn)生的測量信號遠(yuǎn)大于未進(jìn)行收集步驟的信號。與此相反，由未經(jīng)復(fù)合的標(biāo)記試劑產(chǎn)生的信號卻并無變化。因此，盡管在測量室中存在著未復(fù)合的標(biāo)記試劑，由收集到的復(fù)合物產(chǎn)生的信號強(qiáng)于測量時未收集復(fù)合物的信號。收集步驟的結(jié)果，顯著提高了結(jié)合測量的檢測極限。在本發(fā)明的較佳實施例中，均相結(jié)合測量可以包括就地分離步驟。在將測量組合物(即樣品、測量用物質(zhì)和顆粒)泵入測量室并通過工作電極截獲復(fù)合物后，將另一個液體泵入不含標(biāo)記物或標(biāo)記試劑的測量室內(nèi)，從而進(jìn)行就地洗滌或?qū)?fù)合物與測量組合物中的未結(jié)合組分進(jìn)行分離。該測量程序從技術(shù)角度上說系多相結(jié)合測量，但是在測量室內(nèi)進(jìn)行分離的優(yōu)點在于其不需要附加分離裝置，而且一般說來，處理也比在外部進(jìn)行分離迅速。采用本發(fā)明方法，將測量組合物的各組分互相混合并將它們反應(yīng)預(yù)定的時間即可進(jìn)行多相結(jié)合測量。然后將測量組合物進(jìn)行分離，其中包括溶液與顆粒的分離。接著測量復(fù)合物或溶液中的電致化學(xué)發(fā)光。與未經(jīng)濃縮的相比在濃縮后測量復(fù)合物的電致化學(xué)發(fā)光可能使測量分析物具有更高的精度和較低的檢測極限。從以下對若干優(yōu)選實施例的介紹，將會對本發(fā)明及其目的和性質(zhì)更清楚全面地理解。本發(fā)明可廣泛應(yīng)用于能參與結(jié)合反應(yīng)的各種分析物。這些反應(yīng)包括抗原-抗體，配位體受體，DNA和RNA的相互反應(yīng)和其他已知反應(yīng)。本發(fā)明涉及定性和定量檢測多組分樣品中這類被分析物的方法和裝置。樣品含有被分析物的樣品可以是固體、乳濁液、懸浮液、液體或氣體，可以是由細(xì)胞和細(xì)胞衍生物、水、食物、血液、血清、發(fā)毛、汗水、尿、糞便、組織、唾液、油類、有機(jī)溶劑或空氣衍生的。樣品還可以是水、乙腈、二甲亞砜、二甲基甲酰胺、n-甲基吡咯烷酮或醇類，以及它們的混合物。分析物樣品中典型的被分析物是完整細(xì)胞或表面抗原、亞細(xì)胞顆粒、病毒、Prion、類病毒、抗體、抗原、半抗原、脂肪酸、核酸、蛋白質(zhì)、脂蛋白、多糖、脂多糖、糖蛋白、肽、多肽、細(xì)胞代謝產(chǎn)物、激素、藥物、合成有機(jī)分子、有機(jī)金屬分子、安神藥、巴比妥酸、生物堿、甾類化合物、維生素、氨基酸、糖、外源凝集素、重組體或衍生蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素或無機(jī)分子。一般說來，被分析物的濃度為10-3摩爾或低于10-3摩爾，例如10-12摩爾或更低。測量用物質(zhì)與含有被分析物的樣品相結(jié)合的測量用物質(zhì)至少含有一種選自下列的物質(zhì)(ⅰ)加入以上所述的被分析物或其類似物，(ⅱ)被分析物或其類似物的結(jié)合對象，和(ⅲ)能與(ⅰ)或(ⅱ)結(jié)合的上述反應(yīng)組分，所述測量用物質(zhì)中的一種物質(zhì)與化合物或部分(例如能夠誘導(dǎo)發(fā)光的電致化學(xué)發(fā)光部分)相連接。經(jīng)過標(biāo)記的物質(zhì)可以是完整細(xì)胞或表面抗原、亞細(xì)胞顆粒、病毒、Prion、類病毒、抗體、抗原、半抗原、脂類、脂肪酸、核酸、蛋白質(zhì)、脂蛋白、多糖、脂多糖、糖蛋白、肽、多肽、細(xì)胞代謝產(chǎn)物、激素、藥物、合成有機(jī)分子、有機(jī)金屬分子、安神藥、巴比妥酸、生物堿、甾類化合物、維生素、氨基酸、糖、非生物聚合物(優(yōu)選可溶性)、外源凝集素、重組體或衍生蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素或無機(jī)分子。在一個實施例中，試劑是一種電致化學(xué)發(fā)光部分，其與抗體、抗原、核酸、半抗原、短核苷酸順序、寡聚體、配位體、酶、或生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G，或它們的復(fù)合物，或通過蛋白質(zhì)相互反應(yīng)能與最初結(jié)合對象結(jié)合的其他次生結(jié)合對象。被分析物的類似物可以是天然的，也可以是合成的。一般說來，這類化合物的結(jié)合性能應(yīng)與被分析物相當(dāng)，但也可以是具有較高或較低結(jié)合能力的化合物。能夠與被分析物或其類似物和/或其結(jié)合對象以及通過它們能與被分析物連接的電致化學(xué)發(fā)光部分的反應(yīng)組分，最好是次級抗體或蛋白，例如蛋白A或蛋白G，或抗生物素蛋白或生物素，或本領(lǐng)域已知的能參與結(jié)合反應(yīng)的其他組分。標(biāo)記物電致化學(xué)發(fā)光部分是金屬螯合物，該螯合物的金屬可以使用任何金屬，例如在電化學(xué)條件下即施加在所討論的反應(yīng)系統(tǒng)上的電學(xué)條件下，能發(fā)光的金屬螯合物。這類金屬螯合物的金屬，例如有過渡金屬或稀土金屬。所述金屬優(yōu)先使用釕、鋨、錸、銥、銠、鉑、銦、鈀、鉬、锝、銅、鉻或鎢，最好使用釕和鋨。與螯合物中的金屬相連接的配位體通常為天然的雜環(huán)或有機(jī)化合物，它們在決定金屬螯合物是否溶于水、有機(jī)溶劑或其他非水溶劑中起著重要作用。配位體可以是多齒化合物，并且可以被取代。有齒化合物配位體包括芳族和脂族配位體。適合的芳族多齒化合物配位體包括芳族雜環(huán)配位體。較佳的芳族雜環(huán)配位體都是含氮的，例如聯(lián)吡啶，聯(lián)吡唑、三聯(lián)吡啶和菲酚。適宜的取代基包括烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧化物、甲醛、甲酰胺、氰基、氨基、羥基、亞胺基、羥羰基、氨基羰基、脒、胍鹽、酰脲、含硫基、含磷基和N-羥基琥珀酰亞胺羧酸酯。螯合物可以含有一種或多種單齒化合物配位體，其中大量的配位體都是已知的。適宜的單齒化合物配位體包括一氧化碳、氰化物、異氰化物、囟化物和脂族、芳族和雜環(huán)的膦、胺、芪和胂。適宜的螯合物可以包括二〔(4，4′-甲酯基)-2，2′-聯(lián)吡啶2-〔3-(4-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶-4-基)丙基〕-1，3-二氧戊環(huán)釕(Ⅱ);二(2，2′-聯(lián)吡啶)〔4-(丁-1-醛)-4′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶〕釕(Ⅱ);二(2，2′-聯(lián)吡啶)〔4-(4′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶-4′-基)-丁酸〕釕(Ⅱ);三(2，2′-聯(lián)吡啶)釕(Ⅱ);(2，2′-聯(lián)吡啶)〔二-二(1，2-二苯基膦基)乙烯〕2-〔3-(4-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶-4′-基)丙基〕-1，3-二氧戊環(huán)鋨(Ⅱ);二(2，2′-聯(lián)吡啶)〔4-(4′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶)-丁胺〕釕(Ⅱ);二(2，2′-聯(lián)吡啶)〔1-溴-4(4′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶-4-基〕丁烷〕釕(Ⅱ);二(2，2′-聯(lián)吡啶)馬來酰亞胺基己酸，4-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶-4′-丁酰胺釕(Ⅱ)。其他的電致光學(xué)發(fā)光部分可參閱PCT申請US87/00987和88/0394，這些文獻(xiàn)也為本申請的參考文獻(xiàn)。電致化學(xué)發(fā)光部分的作用在于發(fā)射電磁輻射，從而將其導(dǎo)入電化學(xué)能反應(yīng)系統(tǒng)。為此，它們必須能被激發(fā)成為受激能狀態(tài)并且還能發(fā)射從受激態(tài)轉(zhuǎn)變成的電磁輻射，例如光中的光子。并不希望受電致化學(xué)發(fā)光部分參與電致化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的機(jī)理理論分析的約束，我們認(rèn)為通過將電化學(xué)能導(dǎo)入反應(yīng)系統(tǒng)而氧化，然后通過與反應(yīng)系統(tǒng)中的反應(yīng)物相反應(yīng)轉(zhuǎn)化為受激態(tài)。這種狀態(tài)相對來說并不穩(wěn)定，而金屬螯合物則迅速轉(zhuǎn)化為較為穩(wěn)定的狀態(tài)。于是螯合物發(fā)出能被檢測的電磁輻射，例如光中的光子。本發(fā)明所用金屬螯合物或其他含金屬電致化學(xué)發(fā)光部分的量隨著不同系統(tǒng)而改變。一般說來，該部分的用量能有效地使由上述組合物或系統(tǒng)中產(chǎn)生能檢測到(需要時可進(jìn)行定量測量)的電磁能的發(fā)射。一般說來，被分析物的檢測和/或定量測量是將含被分析物和電致化學(xué)發(fā)光部分的樣品的發(fā)光與用已知量的被分析物和電致化學(xué)發(fā)光部分標(biāo)定的發(fā)光進(jìn)行對比得到的。這是進(jìn)行均相測量。至于多相測量，則按如前所述，在進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光分析前先進(jìn)行分離后再測量。本領(lǐng)域的專業(yè)人員可以理解，合金屬電致化學(xué)發(fā)光部分的同一性和用量在不同系統(tǒng)中隨具體條件而改變。本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本文提供的信息，無需過多的試驗，即能根據(jù)經(jīng)驗確定獲得所需結(jié)果的適宜含金屬電致化學(xué)發(fā)光部分及其足夠的用量。顆粒顆粒具有直徑為0.001-200μm(例如0.05μm-200μm)的微顆粒物質(zhì)，優(yōu)選直徑為0.1μm-100μm，尤以0.5μm-10μm為最佳，其表面組分能夠與被分析物和/或上述一種或多種其他物質(zhì)相結(jié)合。微顆粒物質(zhì)可以是交聯(lián)淀粉、葡聚糖、纖維素、蛋白質(zhì)、有機(jī)聚合物、苯乙烯共聚物、例如苯乙烯/丁二烯共聚物、丙烯腈/丁二烯/苯乙烯共聚物、丙烯酸乙烯乙酸酸共聚物或氯乙烯/丙烯酸共聚物，惰性無機(jī)顆粒，二氧化鉻，鐵、硅和硅混合物的氧化物，以及蛋白類物質(zhì)，或它們的混合物。最好將顆粒懸浮在電致化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中。顆?？梢允腔蚩梢园ù判愿袘?yīng)顆粒。測量介質(zhì)為了使由電極導(dǎo)入電化學(xué)能的系統(tǒng)能夠運作，需要提供能浸入電極并含有電致化學(xué)發(fā)光部分的電介質(zhì)。電介質(zhì)通過離子攜帶電荷。一般說來，電介質(zhì)呈液相，是由一種或多種鹽或其他類物質(zhì)與水、有機(jī)液體或有機(jī)液體混合物或水和一種或多種有機(jī)液體混合物組成的溶液。但是，在本發(fā)明的若干實施例中也可使用其他形式的電介質(zhì)。例如電介質(zhì)可以是一種或多種物質(zhì)在流體(如液體、蒸汽或超臨界流體)中的分散體，也可以是一種或多種物質(zhì)在固體、蒸汽或超臨界流體中的溶液。適宜的電介質(zhì)是鹽的水溶液。鹽可優(yōu)選使用鈉鹽或鉀鹽，但在若干實施例中加入其他陽離子也是適宜的，只要該陽離子不影響電致化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的順序。陰離子鹽可以是磷酸鹽，但在本發(fā)明的若干實施例中也可使用其他陰離子，只要所選用的陰離子不影響電致化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的順序。組合物也可是非水組合物。然而在若干實施例中可以使用超臨界流體，更具體地說，可以使用含有有機(jī)液體的非水組合物的電介質(zhì)。與水電介質(zhì)一樣，非水電介質(zhì)也是由離子攜帶電荷。一般說來，這意味著鹽溶解在有機(jī)液體介質(zhì)中。適宜的有機(jī)液體有乙腈，二甲亞砜(DMSO)，二甲基甲酰胺(DMF)，甲醇，乙醇，或上述兩種或多種的混合物。需要說明的是使用可溶于有機(jī)溶體的四烷基銨鹽(例如四氟硼酸四丁銨)，其與以上所述一起組成非水電介質(zhì)。在本發(fā)明的若干實施例中，電介質(zhì)是一個緩沖系統(tǒng)，常用的磷酸鹽緩沖液則是符合理想的。磷酸鈉-氯化鈉水溶液和磷酸鈉-氟化鈉水溶液則是這方面的例子。其他的測量組分如已公開的PCT申請US89/04859(發(fā)明名稱利用胺衍生的還原劑進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光反應(yīng))所述，合乎需要的還原劑，一般說來為(較大分子的)胺或含胺部分，能夠被氧化并且經(jīng)自然分解后轉(zhuǎn)化為高還原劑。該文也作為本文的參考文獻(xiàn)?？梢哉J(rèn)為，胺或含胺部分還可通過將電化學(xué)能導(dǎo)入反應(yīng)系統(tǒng)而被氧化。胺或含胺部分失去一個電子，然后脫質(zhì)子化或進(jìn)行重新排列，轉(zhuǎn)化為強(qiáng)還原劑。該還原劑與經(jīng)過氧化的含金屬電致化學(xué)發(fā)光部分反應(yīng)，使其成為如上所述的受激態(tài)。為此，胺或含胺部分最好具有碳原子中心的殘基，在形成還原劑的脫質(zhì)子化過程中，其含有一個由該碳原子供給的電子和能夠起質(zhì)子供體作用的α-碳原子。胺衍生的還原劑提供了將含金屬電致化學(xué)發(fā)光部分轉(zhuǎn)化為其受激態(tài)所需的激發(fā)源，由此發(fā)射出可檢測到的電磁輻射。許多胺或相應(yīng)的含胺部分均可用于實施本發(fā)明。一般說來，胺或含胺部分的選擇應(yīng)適合于進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光分析的系統(tǒng)的pH值。另一個有關(guān)的因素是胺或含胺部分應(yīng)與進(jìn)行分析時必須產(chǎn)生的作用的環(huán)境相適應(yīng)，即與可能的水或非水環(huán)境相適應(yīng)。需要考慮的另一個因素則是胺或含胺部分的選擇應(yīng)該在具體的條件下形成的胺衍生的還原劑，其足以在該系統(tǒng)中還原經(jīng)過氧化的含金屬電致化學(xué)發(fā)光部分。用于本發(fā)明的胺(及由其衍生的相應(yīng)部分)是脂族胺和取代的脂族胺，例如伯烷基胺、仲烷基胺和叔烷基烷，其中烷基各含有1-3個碳原子。相比而言，三丙胺是特別優(yōu)選的胺，因其能發(fā)射特別高強(qiáng)度的電磁輻射，如在若干實施例中所示，能提高檢測和定量測量的靈敏度和精確度。適用的還有二胺(如肼)和聚胺(如聚乙烯亞胺)。適合于實施本發(fā)明的其他胺的例子有三乙醇胺、三乙胺、1，4-二氮二環(huán)(2.2.2)-辛烷、1-哌啶乙醇、1，4-哌嗪-二(乙烷磺酸)、三異丙胺和聚乙烯亞胺。一般地說，用于本發(fā)明的含金屬電致化學(xué)發(fā)光部分是限制反應(yīng)的組分。因此，更具體地說，提供的胺或含胺部分應(yīng)該過量的化學(xué)量。使用胺或胺部分的濃度為50-150mM，為了能在pH7左右時使用，濃度為100mM常常是有利的。在若干實施例中，胺或含胺部分的上限濃度由胺或含胺部分在使用環(huán)境中(例如在水中)的最大溶解度決定。一般說來，胺和含胺部分的用量應(yīng)足以使經(jīng)過氧化的含金屬電致化學(xué)發(fā)光部分轉(zhuǎn)化為其受激態(tài)，從而產(chǎn)生發(fā)光。本領(lǐng)域的專業(yè)人員根據(jù)自己的經(jīng)驗，按照本文提供的信息，無需過多的試驗，就能決定在具體分析系統(tǒng)中胺或含胺部分的用量。如題為增加電致化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的PCT申請US89/04915所述(該文的內(nèi)容作為本申請的參考文獻(xiàn))，本發(fā)明的測量最好在促進(jìn)劑存在下進(jìn)行，具體地說為下式的化合物式中R表示氫或CnHn2+1，R′表示CnH2n，X表示0-70，n表示1-20，其中n最好為1-4。舉例來說，可通過商業(yè)途徑得到的商品名為TritonX-100的下式化合物(式中X表示9-10)和商品名為TritonN-401(NPE-40)的下式化合物(式中X表示40)一般說來，促進(jìn)劑的用量應(yīng)足以使發(fā)射的電磁輻射增加到合乎需要。具體地說，用量為0.01%-5.0%，更具體地為0.1%-1.0%(V/V)。用于本發(fā)明的電致化學(xué)發(fā)光部分通過將其激發(fā)為受激態(tài)而誘導(dǎo)發(fā)射出電磁輻射，這是通過作用于該系統(tǒng)完成的，在該系統(tǒng)中電致化學(xué)發(fā)光部分與電化學(xué)能相結(jié)合。能夠發(fā)生電致化學(xué)發(fā)光部分和形成強(qiáng)還原劑的化合物的氧化作用的可能性取決于它們精確的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及諸如系統(tǒng)的pH值和用于導(dǎo)入電化學(xué)能的電極的性質(zhì)等因素。本領(lǐng)域的專業(yè)人員都知道，如何確定最佳可能性和電致化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的發(fā)射波長。在已公開的PCT專利申請US89/01814中，公開了激發(fā)電致化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的若干較佳方法，其內(nèi)容作為本文的參考。測量電致化學(xué)發(fā)光的裝置實施本發(fā)明測量的裝置示于圖1和圖2。圖1公開了優(yōu)選的電致化學(xué)發(fā)光裝置，但本發(fā)明方法并不限于裝置10的應(yīng)用，而可使用其他類型電致化學(xué)發(fā)光裝置，該裝置應(yīng)包括工作電極或其他觸發(fā)表面，使提供的電化學(xué)能將電致化學(xué)發(fā)光部分觸發(fā)為電致化學(xué)發(fā)光。當(dāng)本發(fā)明的方法以靜態(tài)方式或流動方式實施時，裝置10包括流通室，其為許多種樣品(包括結(jié)合測量樣品)提供了顯著的優(yōu)點。實施本發(fā)明電致化學(xué)發(fā)光測量的裝置詳細(xì)情況已在PCT申請的US89/04854和US90/01370中公開。裝置10包括電化學(xué)室12，光檢測測量裝置14(可以是一個光電倍增管)，光電二極管，電荷耦合裝置，照相感光片或乳劑等類似物和泵16(可以是一個蠕動泵)，其通過并由室12輸送液體。另外，也可使用正位移泵。在室12和光電倍增管14之間配置一個開閉機(jī)制18，僅在電致化學(xué)發(fā)光測量時光電倍增管14受到室12作用情況下控制開啟操作。開閉機(jī)制可以關(guān)閉(例如運轉(zhuǎn)時)。裝置10還可包括防光室(圖1中未標(biāo)出)，其由各種組件組成，在進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光測量時，使光電倍增管14不受任何外來光的影響。室12本身還包括第一組裝塊20，進(jìn)料管22和排料管24貫穿該組裝塊，最好由不銹鋼構(gòu)成。組裝塊20具有第一外表面26和第二內(nèi)表面28，以限定室12保持樣品的容積30的一側(cè)。在裝置10進(jìn)行運轉(zhuǎn)時，室12可以凈化和/或檢查和/或測量溶液。進(jìn)料管和排料管22，24由外表面26向內(nèi)表面28穿過組裝塊20，并且通向樣品室30。由不銹鋼制成的第二組裝塊32也具有第一外表面34和第二內(nèi)表面36。第二組裝塊32由一個特氟隆或其他非可污染的材料制成的環(huán)隙38與第一組裝塊20隔開。因此，組裝塊32的外表面34限定樣品室30另一側(cè)的部分。環(huán)隙38具有外圍部分40和中心孔42，其內(nèi)緣44限定樣品室30的側(cè)壁。外圍部分40將第一組裝塊20的內(nèi)表面28與第二組裝塊32的外表面34隔開，以防止溶液由兩表面28和34之間的樣品室30中流出。組裝塊32還具有中心孔46，其中觀測窗48被密封，以限定樣品室30另一側(cè)的剩余部分(即外表面34的繼續(xù)部分)。構(gòu)成觀測窗48的材料應(yīng)在由電致化學(xué)發(fā)光部分發(fā)射的電致化學(xué)發(fā)光的光波長處基本呈透明狀。因此，觀測窗48應(yīng)由玻璃、塑料、石英等材料制成。進(jìn)料管22在鄰近環(huán)隙38的樣品室30的一端50與樣品室30相交，排料管24在鄰近環(huán)隙38的樣品室30的另一端52與樣品室30相交。因此，進(jìn)料管22、樣品室30和排料管24的結(jié)合構(gòu)成了溶液的狹窄的基本上為層流的連續(xù)流路，溶液流向、流經(jīng)室12并可由室12流出。箭號A和B分別表示進(jìn)料管22和排料管24的流入和流出。在一個實施例中，工作電極系統(tǒng)54配置在第一組裝塊20的內(nèi)表面28，其包括第一和第二工作電極56和58。在另一個實施例中，可以配置一個工作電極，或僅以電極56作為工作電極。在工作電極56，58上進(jìn)行電化學(xué)和電致化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。工作電極56，58是固體的伏安電極，因此可由鉑、金、碳或符合要求的其他材料制成。分別與工作電極56，58連接的接線管60，62穿過第一組裝塊20。接線管60，62與電壓控制器66的第一“工作電極”末端64連接(示于圖2)。因此，電壓控制器66按電壓穩(wěn)壓器的方式運作，將電壓信號供給工作電極56，58，并在測量電致化學(xué)發(fā)光時可根據(jù)需要測量由其流出的電流。此外，接線管60，62可以各自與電壓控制器66的末端連接，進(jìn)行各自的運作。電壓控制器66的電壓穩(wěn)壓器的動作還可通過反向電極68和參考電極70產(chǎn)生有效作用。在一個實施例中，組裝塊32由不銹鋼制成，反向電極68在組裝塊32的暴露面72，74。反向電極72，74和工作電極56，58構(gòu)成的連接面，將電壓施加在樣品室30內(nèi)的溶液上，把能量供給化學(xué)反應(yīng)，激發(fā)樣品中的電致化學(xué)發(fā)光和/或提供能量用于凈化和檢查室12的表面。反向電極72，74通過接線管76與電壓控制器66的另一“反向電極”末端78連接。參考電極70提供參考電壓，由工作電極56，58施加的電壓是由其產(chǎn)生的，例如+1.2V對參考電壓。參考電極70配置在排料管24距室12的位置80上，并通過接線管82與電壓控制器66的第三“參考電極”末端84連接。在三個電極工作的情況下，電流可以不通過參考電極70流動。參考電極70可用于三個電極的動作，以提供均衡、已知和穩(wěn)定的電壓，因此其由銀/氯化銀(Ag/AgCl)制成或是一個飽和甘汞電極。僅用兩個電極動作，即用工作電極56和作為反向/參考電極的電極58也可以使電壓控制器66運作。以這兩個電極動作時，反向/參考電極58與電壓控制器66上的電壓控制器末端78，84進(jìn)行電連接。在這種情況下，電壓控制器66基本上作為一個電池在工作。電壓控制器66將電壓信號供給工作電極56和反向電極58，并且可根據(jù)需要測量通過各自電極流動的電流。參考電極70也可以是一個由鉑、金、不銹鋼或其他材料制成的所謂“準(zhǔn)參考”電極，其提供穩(wěn)定性較差的電壓，但就溶液而言可以測量。使用兩個和三個電極工作時，參考電極70或58可以為測量施加于工作電極56上的電壓時提供參考。穩(wěn)定的電壓參考現(xiàn)被認(rèn)為頗為有利。電壓控制器66以其電壓穩(wěn)壓器動作時，通過根據(jù)參考電極70在工作電極56，58上提供的已知電壓，控制各種不同的電極，同時測量工作電極56，58和反向電極72，74之間的電流。用于此目的的電壓穩(wěn)壓器都是已知的，電壓控制器66的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可以相當(dāng)于任何常規(guī)的通過商業(yè)途徑可以得到的具有上述功能的電壓穩(wěn)壓器，因此其本身并不構(gòu)成本發(fā)明的一部分。裝置10的結(jié)構(gòu)也可不包括內(nèi)電壓控制器66，并且可以適合于與外電壓穩(wěn)壓器連接，從而可以分別控制，將所要求的電壓信號提供給電極56，58，72，74和70。這些電壓信號(見如下所述，以一定方式使用)為工作電極56，58的表面和室12的表面提供可重復(fù)的初始條件，從整體來說這個特征可以顯著提高電致化學(xué)發(fā)光測量的精度。泵16配置在排料管24的位置上，將樣品溶液沿箭號方向A吸入到進(jìn)料管22中。溶液流經(jīng)進(jìn)料管22、樣品室30和排料管24，再經(jīng)參考電極70，沿箭號方向B排出。此外，泵16也可以配置在進(jìn)料管22上，使溶液流經(jīng)裝置10。流經(jīng)室12的所有溶液和流體都使用相同的流路，即流過進(jìn)料管22、樣品室30和排料管24，從而使由室12流出的流體都能經(jīng)流體動力學(xué)的靜化處理。泵16可以控制動作，使在任何時間內(nèi)都能保持溶液于室12中。裝置10的流向結(jié)構(gòu)使工作電極能夠接受可變電壓或保持原先的運作電壓，同時使一種或多種溶液連續(xù)得到處理，又不使工作電極56，58(或反向和參考電極72，74，70)受空氣的影響。受空氣影響則會使電路受到參考電極70的干擾，從而使電壓發(fā)生未知的任意的變化，破壞工作電極56，58表面條件的再現(xiàn)性。流向結(jié)構(gòu)使進(jìn)行凈化和監(jiān)測電極系統(tǒng)54的起始步驟和測量一種或多種形式的波的測量步驟之間迅速得到改變，或可加速激發(fā)電致化學(xué)發(fā)光。圖23和圖24表示裝有磁體系統(tǒng)的室和磁體27/37，該磁體系統(tǒng)產(chǎn)生的磁場線與電極表面56、58大致平行。磁體系統(tǒng)由各永久磁體或電磁體層疊和定向排列復(fù)合而成，使磁體27/37的南北極交錯層疊。磁體系統(tǒng)27/37的各個磁體由空氣或任何非磁性感應(yīng)材料隔開。按圖23圖24的排列可使磁力線作用于與電極面幾乎呈水平的工作電極上部的區(qū)域。這將使位于電極表面的磁性感應(yīng)顆粒按一定方向排列并且很容易利用由電極供給的電化學(xué)能(參閱圖20)。圖23和圖24中的磁體系統(tǒng)27/37的優(yōu)點還在于磁場線從磁體結(jié)構(gòu)中并沒伸出很長一段距離(參閱圖20)，因而由此磁體系統(tǒng)產(chǎn)生的磁場不可能誘導(dǎo)電極裝置附近永久磁體和鐵磁材料，并且不會嚴(yán)重影響液流室裝置附近光電倍增管的運作。圖25中的裝置如同圖1和圖2，并可參閱以上對圖1和圖2的介紹，但圖25中的裝置垂直配置在水平向電極56下面，或電極56、58如圖23和圖24一樣，是南北向的復(fù)合磁體系統(tǒng)27/37。本發(fā)明還涉及試劑組合物。廣義地說，該試劑組合物可以是本發(fā)明測量系統(tǒng)中的任何一種組成部分，即(a)電介質(zhì)，(b)含有電致化學(xué)發(fā)光部分的標(biāo)記化合物，(c)顆粒，包括磁性感應(yīng)顆粒，(d)被分析物或其類似物，(e)被分析物或其類似物的結(jié)合對象，(f)能與(d)或(e)反應(yīng)的反應(yīng)組分，(g)還原劑，或(h)電致化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的促進(jìn)劑。試劑可以與另一種常用試劑相結(jié)合，即可制備二種組分、三種組分和更多種組分的混合物，只要這些組分在貯藏期間不與其他組分相反應(yīng)，以致在所需測量中損害它們的作用。試劑最好是含有顆粒和一種或多種其他組分的二種組分或多種組分的混合物。本發(fā)明還涉及藥盒，其可包括含有上述(a)至(h)之一種或多種組分的容器，或該藥盒可包括含上述組分的混合物之一種或多種試劑組合物的容器，所有這些組分均可用于本發(fā)明的測量方法和測量系統(tǒng)。本發(fā)明優(yōu)選實施例的介紹在進(jìn)行本發(fā)明的顆粒測量時，可以使用各種顆粒，一般說來顆粒密度為1.0-5.0g/mL，優(yōu)選密度為1.1-2g/mL。最佳密度的選擇屬于本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員的工作范圍，重力測量的沉淀速率可在測量速度和需要在電極表面上獲得均勻?qū)拥膹?fù)合物之間進(jìn)行適當(dāng)選擇。各種平均直徑的顆粒都可使用，可以使用平均直徑為0.001-200μm(如0.05-200μm)的顆粒，優(yōu)選平均直徑為0.01-10μm的顆粒。在測量組合物中還可使用各種濃度的顆粒，例如可以使用1-10000μg/mL的濃度范圍，優(yōu)選5-1000μg/ml的濃度范圍。顆粒的密度、粒徑和濃度的選擇最好能使顆粒沉淀的速率至少達(dá)到0.5mm/分鐘，優(yōu)選更快的速率。采用過濾方法實施本發(fā)明時，過濾裝置的理想孔徑應(yīng)能測出0.01至90%的平均直徑的顆粒，尤以10至90%的平均直徑為佳。已有技術(shù)已經(jīng)介紹了大量磁性顆粒，這些顆粒可以用于本發(fā)明的測量。例如，美國專利4628037，4695392，4695393，4698302，4554088，英國專利2005019A和歐洲專利0180384(均為本申請的參考文獻(xiàn))介紹了能夠成功地使用的各種磁性顆粒。顆?？梢允琼槾蓬w粒，也可以是鐵磁顆粒，并且可以包覆能夠與結(jié)合化合物結(jié)合的各種材料，使磁性顆粒能夠用于免疫測量。用于本發(fā)明的磁性顆粒最好具有至少0.001cgs單位的磁化率，優(yōu)選磁化率至少為0.01cgs單位。磁性顆粒的密度可以具有很寬范圍，基本上低于水的密度，即0.01-5g/mL，優(yōu)選密度為0.5-2g/mL。粒徑可以為0.001-200μm，例如0.001-100或0.05-200μm，優(yōu)選范圍為0.01-10μm。顆粒濃度的范圍也很寬，可以是1-10000μg/mL，優(yōu)選范圍為5-1000μg/mL。正如歐洲專利0180384所述，所用磁性顆粒最好為低磁性共振，使從電極表面移去磁場后，將顆粒去磁，并能凈化測量室。磁性顆粒的密度、濃度和粒徑的選擇應(yīng)使沉淀時間至少達(dá)到0.5mm/分鐘，最好在該速率以上。在磁室動作時，為了不干擾光電倍增管的動作，在誘導(dǎo)電致化學(xué)發(fā)光前，先從磁極表面除去磁體裝置。測量本發(fā)明方法可用于各種測量。按圖3所示進(jìn)行的一種測量。由反應(yīng)生成的PCR產(chǎn)物用生物素和ECL標(biāo)記物(tris(2，2′-聯(lián)吡啶)RuⅡ，Ru(bpy)2+3)進(jìn)行標(biāo)記。用生物素(抗生蛋白鏈菌素)的結(jié)合方法，使抗生蛋白鏈菌素珠粒俘獲雙功能DNA，接著進(jìn)行洗滌，然后將結(jié)合產(chǎn)物的珠粒進(jìn)行檢測ECL標(biāo)記物的分析。按圖4所示進(jìn)行的一種測量。在抗生蛋白鏈菌素珠粒上俘獲含生物素的PCR產(chǎn)物，并且除去不含生物素的鏈。然后將結(jié)合PCR產(chǎn)物的珠粒與ECL標(biāo)記的(Ru(bpy)2+3)寡核苷酸雜交，接著進(jìn)行ECL分析，檢測標(biāo)記物。按圖5所示進(jìn)行的一種測量。在抗生蛋白鏈菌素珠粒上俘獲雜交物，然后無需洗滌進(jìn)行ECL分析。按圖6所示進(jìn)行的一種測量和得到的結(jié)果。該測量是用由對病毒型和對各病毒型具有特異性的寡核苷酸呈正反應(yīng)的SiHa和HeLa細(xì)胞系分離得到的DNA樣品檢測是否存在HPV16和18。引物2PV16和2PV18含有生物素，而引物3PV16和3PV18則系ECL標(biāo)記的寡核苷酸。2/3PV16和2/3PV18寡核苷酸分別對HPV16和18具有特異性。用圖1所示分析儀分析生成的珠粒俘獲的ECL標(biāo)記物中的ECL。結(jié)果用圖示表示各樣品引物組合的ECL量。按圖7所示進(jìn)行的一種測量和得到的結(jié)果。用圖1所示分析儀，對生成的珠粒結(jié)合ECL標(biāo)記物分析ECL。根據(jù)HPV16DNA濃度的增高(病毒拷貝與總細(xì)胞DNA拷貝之比)用圖示表示ECL光子的峰值。用于分析HPV16的引物是1PV16(生物素標(biāo)記物)和2PV16(ECL標(biāo)記物)。用小牛胸腺DNA使用于各個PCR的DNA保持在1μg不變。按圖8所示進(jìn)行的一種測量和得到的結(jié)果。用帶未標(biāo)記的HRP1的含生物素HRP2(探針1T24和1CHR)和帶未標(biāo)記的HRP2的含生物素HRP1(探針2T24和2CHR)進(jìn)行PCR測量，產(chǎn)生用于雜交的珠粒結(jié)合的單鏈的靶。DNA樣品是正常的(胎盤)Ha-ras基因和突變的(NIH3T3-T24)Ha-ras基因。然后用TEMAC洗滌珠粒結(jié)合DNA與ECL標(biāo)記1T24(1T24)、ECL標(biāo)記2T24(2T24)、ECL標(biāo)記1CHR(1CHR)和ECL標(biāo)記2CHR(2CHR)的雜交，用圖1所示分析儀，對生成的珠粒結(jié)合ECL標(biāo)記物分析ECL。結(jié)果用圖示表示各樣品探針組合的ECL量。按圖9所示進(jìn)行的一種測量和得到的結(jié)果。用僅帶未標(biāo)記HRP1的含生物素HRP2(探針1T24和1CHR)按圖8所示進(jìn)行PCR測量。所用的探針是含32P的1T24和1CHR(1T24-P，1CHR-P)作為對照。用含32P和ECL標(biāo)記物的1T24和1CHR測定ECL標(biāo)記物的效果。按前所述，用TEMAC洗滌樣品。在閃爍計數(shù)器中加入閃爍合劑，分析生成的珠粒結(jié)合的32P。結(jié)果用圖示表示各樣品探針組合的每秒32P數(shù)。按圖10所示進(jìn)行的一種測量和得到的結(jié)果。根據(jù)圖4所述進(jìn)行測量。所用樣品是胎盤DNA，并用帶未標(biāo)記HRP1的含生物素的HRP2(探針1T24和1CHR)進(jìn)行擴(kuò)增。從生成的PCR產(chǎn)物中采樣，得到一組含有不同量的產(chǎn)物的樣品，將這些樣品組與用32P標(biāo)記的探針(1T23-P32和1CHR-P32)或與ECL標(biāo)記物(1T24-ECL和1CHR-ECL)雜交，然后再用90μl樣品的各個標(biāo)記物的平均峰值將所得各結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，這些標(biāo)準(zhǔn)化圖可以使信號與本底和兩種方法的對比反應(yīng)作更有效的對比。插圖以稀釋曲線的較低量說明其反應(yīng)。樣品按上述方法處理(圖6和圖8)。按圖11進(jìn)行的一種測量和得到的結(jié)果。用含生物素的2PV18和未標(biāo)記的1PV18、HeLaDNA(每個細(xì)胞400個拷貝數(shù))以圖3所述的PCR進(jìn)行PCR測量。然后將生成的PCR反應(yīng)物與特異性探針ECL標(biāo)記3PV18雜交。將雜交混合物加到抗生蛋白包衣的珠粒上，用圖1所示ECL分析儀對生成的珠粒結(jié)合ECL標(biāo)記物直接進(jìn)行ECL分析。結(jié)果用圖示表示ECL量與加到PCR的HPV18拷貝數(shù)之間的相互關(guān)系。以下是非限制性實施例，這些實施例是為了說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，顯然可以作出各種改變。實施例儀器，材料和方法(1)儀器如圖1和2所示的流向裝置，使用三個電極。工作電極Au片，直徑3mm反向電極Au片，直徑3mm參考電極Ag/AgCl特氟隆墊片0.15″厚有機(jī)玻璃面板進(jìn)料管0.042″，聚丙烯抽氣速率0.01-5mL/分鐘(可變)電壓穩(wěn)壓器用HamamatsuR374PMT(低增益紅敏光電管)的微處理機(jī)控制的發(fā)光計;PMT的可變電壓為0-1400伏(2)材料(a)電致化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物Ru(bpy)2+3(b)電致化學(xué)發(fā)光緩沖液112mMKH2PO4，88mMK2HPO4·3H2O，50μMNaCl，6.5mMNaN3，0.8μMTritonX-100，0.4mMTween20，100mM三丙胺的水溶液(c)電致化學(xué)發(fā)光稀釋劑37.5mMKH2PO4，109.2mMK2HPO4·3H2O，151.7mMNaCl，0.65mMNaN3，0.43mM牛血清清蛋白的水溶液(d)Ru(bpy)2+3-NHSRu(2，2′-聯(lián)吡啶基)(4-〔3-(1，3-二氧戊環(huán)-2-基)丙基〕-4′-甲基-2，2′-聯(lián)吡啶)2+(e)Dynal顆粒(ⅰ)DynalM-450Dynabeads，4.5μm直徑的超順磁顆粒，30mg/mL由Dynal(45NorthStationPlaza，GreatNeck，NY11021)提供(ⅱ)DynalM-280Dynabeads，2.8μM直徑的超順磁顆粒，10mg/mL由Dynal(45NorthStationPlaza，GreatNeck，NY11021)提供(3)電致化學(xué)發(fā)光周期(三電極室動作)電致化學(xué)發(fā)光周期由三個步驟組成(1)預(yù)處理，(2)測量，和(3)凈化。預(yù)處理步驟包括將電壓三角波以每秒2.0V的速率由0.0V-+2.2V變?yōu)?1.0V-+0.6V。測量步驟包括以每秒1.0V將三角波由+0.6V-+2.8V變?yōu)?2.0V。凈化步驟包括將電壓方波由+0.0V-+3.0V變?yōu)?0.5V-0.0V。所有電壓都以Ag/AgCl參考電極作基準(zhǔn)。實施例1重力收集微顆粒的裝置和方法在圖12所示室內(nèi)進(jìn)行測量，圖12介紹了采用重力進(jìn)行測量的裝置，該裝置包括透明窗48，墊片222，沉積室20(包括進(jìn)料口22，工作電極56/58，反向電極72/74和排料口24)。沉積室呈水平面，即垂直于地球重力場的方向，通過蠕動泵將ECL緩沖液中的標(biāo)記微顆粒(Dynal)輸送到沉積室，在顆粒送至該室后，將泵關(guān)閉，室內(nèi)的微顆粒沉落在工作電極表面上，微顆粒的沉落約以0.5mm/min速率沉落10mm(如圖13所示)。顆粒沉落的量與沉落時間和速率成函數(shù)關(guān)系，ECL強(qiáng)度與沉落在工作電極上顆粒的量成正比。落至表面的顆粒的量以及由此產(chǎn)生的ECL強(qiáng)度均受液體樣品對工作電極高度的限制。圖14以沉積時間的函數(shù)表示2個不同墊片厚度(0.015和0.075英寸)的室的ECL強(qiáng)度，2個室的微顆粒沉積速率相似，但是墊片較厚的室的最大讀數(shù)為墊片較薄的室的5倍。2個室的AFP(α-胎兒蛋白)測量的結(jié)果示于圖15，另外墊片較厚的室產(chǎn)生5倍的ECL信號強(qiáng)度。實施例2沉淀微顆粒的電致化學(xué)發(fā)光裝置和方法用沉積室進(jìn)行磁性收集用圖16的磁力沉積微顆粒進(jìn)行測量的沉積室。圖16中的標(biāo)號48表示透明窗，122表示墊片，22表示沉積室中的進(jìn)料口，56、58表示工作電極，24表示樣品排料口，20表示沉積室本身，27表示電磁體。沉積室的平面呈水平方向，用蠕動泵將電致化學(xué)發(fā)光緩沖液中的標(biāo)記微顆粒(Dynal)輸送到沉積室，在微顆粒被輸送到沉積室后將泵關(guān)閉。用電磁體27產(chǎn)生的磁場將沉積室中的微顆粒輸送到工作電極，電磁體的動作可用12V和1.5A。由于采用了電磁體，微顆粒的沉積速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過只用重力作用進(jìn)行顆粒沉積的速率(如圖17所示)。實施例3沉積微顆粒的電致化學(xué)發(fā)光裝置和方法用收集室進(jìn)行磁性收集測量是在如圖18所述收集室中進(jìn)行。圖18中的標(biāo)號48表示透明窗，132表示墊片，22表示收集室中的進(jìn)料口，56、58表示工作電極，20表示收集室本身，24表示樣品排料口，37表示永久磁體。收集室的平面沿水平方向取向，用蠕動泵將電致化學(xué)發(fā)光緩沖液中的標(biāo)記微顆粒(Dynal)輸送到電化學(xué)室，在導(dǎo)入樣品前，先將永久磁體37以0.035英寸的間隔直接固定在工作電極/溶液界面之下。當(dāng)樣品輸送到電化學(xué)室時，微顆粒沉積在工作電極上由磁體面積限定的表面上。在全部樣品沉積后，將泵關(guān)閉，除去磁場。收集時間越長，沉積的顆粒越多。隨著工作電極上顆粒濃度的提高，導(dǎo)致電致化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度增高(如圖19所示)。實施例4使用磁體沉積微顆粒磁場取向如圖20所示電場98和98′，被吸引在磁體27/37上(不論其是永久磁體還是電磁體)上的微顆粒96、96′與磁場98、98′的方向相一致，生成的顆粒排列96和96′與工作電極56/58的表面相平行(A)和垂直于(B)，且在該表面的附近。實施例5過濾收集和富集顆粒磁性感應(yīng)、非磁性感應(yīng)和密度范圍很寬的微顆粒可通過膜濾器表面的過濾進(jìn)行收集。在本發(fā)明的一個實施例中，用泵將顆粒泵送經(jīng)過濾膜，該過濾膜的孔徑小于顆粒的直徑，最好顯著小于顆粒的直徑，并且具有足夠高的表面密度，使顆粒收集不致堵塞膜孔。膜濾器最好具有很高的透明度，在收集顆粒后使膜濾器能夠置于工作電極的表面，誘發(fā)顆粒產(chǎn)生電致化學(xué)發(fā)光和測量發(fā)光，從而定量測出顆粒上的ECL標(biāo)記物。在另一個實施例中，具有上述孔徑的膜濾器附加或配置在吸附材料的表面上，使毛細(xì)作用將含微顆粒的液體自然流經(jīng)膜濾器，不需要使流經(jīng)濾器的任何裝置。在一個較佳實施例中，用金屬薄膜或其他導(dǎo)電材料包覆具有上述孔徑的膜濾器，使膜表面能夠用作ECL裝置中的工作電極。采用微電子裝置制作中的常規(guī)方法(例如熱蒸發(fā)或噴涂方法)，很容易將導(dǎo)電薄膜涂于膜上。這種過濾電極很容易裝配在液流室中，使液體的流徑通過過濾電極。液流中的顆粒通過過濾電極被俘獲，并且很容易就地洗滌，從而為進(jìn)行多相測量提供快速簡便的方法，不需要任何外加的洗滌裝置。實施例6采用離心方法收集和富集顆粒圖21所示旋轉(zhuǎn)液流室提供了在工作電極表面上俘獲復(fù)合物進(jìn)行發(fā)光測量的另一個方法。測量溶液通過進(jìn)料口261進(jìn)入裝置，經(jīng)轉(zhuǎn)動密封圈263泵入室262內(nèi)，旋轉(zhuǎn)運動沿箭號R所指方向進(jìn)入室內(nèi)。復(fù)合物的較密顆粒富集在工作電極264的表面上。在室繼續(xù)旋轉(zhuǎn)的同時，溶液經(jīng)排料口268流出該室。流經(jīng)室透明窗的輸出光通過光電倍增管265進(jìn)行測量。輸出光由垂直配置的工作電極表面264反射到位于室中央的曲面鏡表面266，圖中還給出了反向電極269。然后沖洗和清潔該室，以便用于下一個循環(huán)。此項操作可在停止或轉(zhuǎn)動室時進(jìn)行。圖21給出了本發(fā)明俘獲顆粒的離心方法和裝置以及本發(fā)明的離心液流室。實施例7用中等表面濃度的標(biāo)記非特異性蛋白包覆顆粒用150mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)通過磁力分離方法，洗滌30mg(1ml)的4.5μm未包覆的磁性感應(yīng)聚苯乙烯M-450DYNABEADS(DYNAL，Oslo，Norway)，每次洗滌用2ml溶液。將150μgRu(bpy)2+3標(biāo)記鼠IgG(JacksonImmunochemicals)的磷酸緩沖鹽水(PBS，1ml)和0.05%乙基汞硫代水楊酸鈉加到顆粒中，該混合物可在室溫下旋轉(zhuǎn)溫育過夜，然后從顆粒中磁力分離出溶液并將其除去。為了封阻未反應(yīng)部位，將1ml3%BSA/PBS和0.05%疊氮化鈉加到顆粒中，生成的溶液可在室溫下溫育2小時，洗滌顆粒5次，每次2ml，然后懸浮在6ml相同的緩沖液中，貯藏備用。實施例8用磁性感應(yīng)顆粒測量電致化學(xué)發(fā)光用實施例7所述的標(biāo)記蛋白包覆均勻的和不均勻的、聚合的和非聚合的磁性感應(yīng)顆粒(Dynal，Oslo，Norway;Polysciences，Warrington，PA18976;CortexBiochem，SanLeandro，CA94577;Aldrich，Milwaukee，WI53201)。經(jīng)過包覆的顆粒用電致化學(xué)發(fā)光緩沖液洗滌3次，然后制備2ml的300μg/ml懸浮液。用蠕動泵將500μl的顆粒懸浮液輸送到液流室(實施例3)。當(dāng)顆粒流向工作電極時，由于磁體作用被吸引和富集在工作電極表面上。用配置在液流室(顆粒集中在工作電極表面)上部中心的HamamatsuR374光電倍增管測量磁性顆粒的電致化學(xué)發(fā)光。表Ⅰ給出了由標(biāo)記蛋白包覆的磁性感應(yīng)顆粒得到的電致化學(xué)發(fā)光的光發(fā)射量。表Ⅰ不同磁性感應(yīng)顆粒的電致化學(xué)發(fā)光測量顆粒種類直徑(μm)密度(g/ml)原料電致化學(xué)發(fā)光量玻璃8.02.4鈉鈣玻璃22002.02.4鈉鈣玻璃8500石英0.3-3.52.5SiO21150金1.0-2.019.3Au1100實施例9用非磁性顆粒測量電致化學(xué)發(fā)光用實施例7所述的標(biāo)記蛋白包覆均勻的和不均勻的、聚合的和非聚合的非磁性感應(yīng)顆粒(Aldrich，Milwaukee，WI53201DukeScientific，PaloAlto，CA94303)。經(jīng)過包覆的顆粒用電致化學(xué)發(fā)光緩沖液洗滌3次，然后制備2ml的300μg/ml懸浮液。用蠕動泵將500μl的顆粒懸浮液輸送到液流室。包覆的顆粒按實施例1所述重力作用富集在工作電極上。用配置在液流室(顆粒集中在工作電極表面)上部中心的HamamatsuR374光電倍增管測量非磁性顆粒的電致化學(xué)發(fā)光。表Ⅱ給出了包覆的非磁性顆粒得到的電致化學(xué)發(fā)光的光發(fā)射量。表Ⅱ由重力收集得到的非磁性感應(yīng)顆粒測量電致化學(xué)發(fā)光顆粒種類直徑顆粒密度原料電致化學(xué)(μm)(g/ml)發(fā)光量Rhone-Poulenc4.01.5聚苯乙烯二乙烯基苯1680/Fe3O41.5-2.11.4聚苯乙烯/Fe3O4462Polysciences1.5-2.12.1聚苯乙烯/FeO2504Dynal4.51.5聚苯乙烯/Fe2O34200Cortex1.0-101.3纖維素/Fe3O41251.0-101.8聚丙烯醛/Fe3O41251.0-251.2聚丙烯酰胺/Fe3O4W125/活性炭鎳3.08.9Ni125實施例10物理吸附的羊抗促甲狀腺激素(TSH)包覆的Dynal顆粒的制備(試劑Ⅰ)用150mM碳酸鈉/碳酸氫鈉溶液(pH9.6)通過磁力分離洗滌1ml4.5μm未包覆的表面上具有-OH殘基的磁性聚苯乙烯顆粒(DYNAL，DYNABEADSM-450，DYNALA.S.Oslo，Norway)，每次用2ml洗滌。將0.5mg親和純化的羊抗TSH，HCG純凈的抗體(CIBA)的碳酸鈉/碳酸氫鈉溶液(1ml)加到顆粒中。該混合物在室溫下溫育過夜，然后將溶液與顆粒通過磁力進(jìn)行分離，并除去溶液。加入1ml3%BSA/PBSW/0.05%重疊氮鈉，在室溫下攪拌溫育2小時，封阻未反應(yīng)部位。將顆粒洗滌5次(每次用2ml)，然后懸浮在1ml相同的緩沖液中，貯藏備用。該試劑Ⅰ的最終濃度為3%(重量)。實施例11烏本箭毒苷-BSA結(jié)合物的制備(試劑Ⅱ)鳥本箭毒苷的活化將60.4mg烏本箭毒苷八水合物(AldrichCat＃14，193-3)的去離子水(6ml)(薄膜包裝)溶液與87mg偏過碘酸鈉(MallinckrodtCat＃1139)混合，該混合物在室溫下轉(zhuǎn)動溫育2小時。反應(yīng)混合物通過裝有去離子水的Dowex1×8-50離子交換樹脂(AldrichCat＃21，740-9)終止反應(yīng)。加入200μl1M磷酸鈉(pH7.2)，將溶液的pH調(diào)至7.0?；罨臑醣炯拒张cBSA結(jié)合將50mg活化烏本箭毒苷(4.6ml)滴加到108mg牛血清清蛋白(BSA)(MilesFractionⅤ)的PBS(5ml，0.15M，pH7.8)溶液中，烏本箭毒苷與BSA的比為40∶1。反應(yīng)物在室溫下溫育2小時。在混合的同時迅速加入30mg氰基硼氫鈉。游離的烏本箭毒苷和過量的氰基硼氫鈉通過在4℃下于pH7.8的重疊氮鈉(0.15MPBSW/0.05%)中透析除去。烏本箭毒苷-BSA結(jié)合試劑Ⅱ貯藏在4℃。實施例12物理吸附的烏本箭毒苷-BSA包覆的Dynal顆粒的制備(試劑Ⅲ)用150mM碳酸鈉/碳酸氫鈉溶液(pH9.6)通過磁力分離洗滌5mg4.5μm未包覆的表面具有-OH殘基的磁性聚苯乙烯顆粒(DYNAL，DYNABEADSM-450，DYNALA.S.Oslo，Norway)，每次洗滌用10ml。將3mg烏本箭毒苷-BSA結(jié)合物(結(jié)合試劑Ⅱ)的碳酸鈉/碳酸氫鈉溶液(5ml)加到顆粒中。該混合物在室溫下轉(zhuǎn)動溫育過夜，溶液經(jīng)磁力與顆粒分離后除去。加入5ml3%BSA/PBSW/0.05%重疊氮鈉，在室溫下溫育2小時，旋轉(zhuǎn)至封阻未反應(yīng)部分。顆粒洗滌5次(每次用10ml)，最后懸浮在1ml相同的緩沖液中，貯藏備用。試劑Ⅲ的最終濃度為3%(重量)。實施例13Ru(bpy)2+3標(biāo)記的鼠抗地高辛的制備(試劑Ⅳ)用Ru(bpy)2+3標(biāo)記1mg鼠抗地高辛(CambridgeMedicalTechnologiesCat＃200-014LotA3575)，用Centricon30微濃縮器(Amicon)將單克隆抗體(抗地高辛抗體)緩沖交換到0.15M磷酸鉀緩沖液中(0.15MNaCl，pH7.8)，最終容積為0.5ml。用125μl無水二甲亞砜(Aldrich)溶解0.5mgRu(bpy)2+3-NHS后即可使用。將0.18mgRu(bpy)2+3-NHS(45μl)振動加入到蛋白溶液，可得到以分子量計分別為1057和150000的25∶1摩爾比的Ru(bpy)2+3∶蛋白。在室溫和黑暗下，反應(yīng)管振動溫育30分鐘。加入25μl1M甘氨酸使反應(yīng)終止，再溫育10分鐘。反應(yīng)混合物通過SephadexG-25柱(1×20cm的0.15M磷酸鉀，0.15MNaCl和0.05%重疊氮鈉，pH7.2)純化。收集和沉淀Ru(bpy)2+3標(biāo)記的鼠抗地高辛部分，標(biāo)記蛋白(試劑Ⅳ)經(jīng)測定，每蛋白分子具有12個標(biāo)記物。實施例14Ru(bpy)2+3標(biāo)記的鼠抗促甲狀腺激素(TSH)的制備(試劑Ⅴ)用Ru(bpy)2+3標(biāo)記0.5mg鼠抗TSH(CIBA)，再用Centricon30微濃縮器(Amicon)將抗TSH抗體緩沖交換到0.15M磷酸鉀緩沖液、0.15MNaCl(pH7.8)中，最終容積為0.35ml。將0.5mgRu(bpy)2+3-NHS溶解到75μl無水二甲亞砜(Aldrich)后即可使用。將0.176mgRu(bpy)2+3-NHS(26.4μl)振動加到蛋白溶液中，即可得到以分子量計分別為1057和150000的50∶1摩爾比的Ru(bpy)2+3標(biāo)記物∶蛋白。在室溫和黑暗下，反應(yīng)管振動溫育30分鐘。加入25μl1M甘氨酸使反應(yīng)終止，再溫育10分鐘。反應(yīng)混合物經(jīng)過SephadexG-25柱(1×20cm，0.15M磷酸鉀、0.15MNaCl和0.05%重疊氮鈉，pH7.2)純化，收集和沉淀Ru(bpy)2+3標(biāo)記的鼠抗TSH部分。測定標(biāo)記的蛋白(試劑Ⅴ)，每蛋白分子具有14個標(biāo)記物。實施例15促甲狀腺激素(TSH)的一步分離夾層測定將100μl標(biāo)定血清(LondonDiagnosticsTSHLumiTAGKit)、25μlRu(bpy)2+3標(biāo)記的鼠抗TSH(試劑Ⅴ)的ECL緩沖溶液和25μl羊抗TSH-DYNAL顆粒(試劑Ⅰ)的ECL緩沖溶液合并后，在室溫下置于聚丙烯管中溫育15分鐘混合，通過磁力分離洗滌顆粒，再將顆粒懸浮到500μl的ECL緩沖液中，該洗滌步驟再重復(fù)2次。最后將顆粒懸浮在1ml的ECL緩沖液中，按實施例3所述方法讀得各個樣品的電致化學(xué)發(fā)光。電致化學(xué)發(fā)光量與樣品中被分析物的濃度成正比(電致化學(xué)發(fā)光量與被分析物的濃度成正比增加)。表Ⅲ給出了測量曲線的值。表Ⅲ一步分離夾層測量檢測TSHTSH濃度電致化學(xué)發(fā)光量(μIU/ml)(雙份樣品)0.00191818850.05258425300.10336532880.50873386522.50356883534710.012531613699425.030024828827250.0549034564948實施例16促甲狀腺激素(TSH)的一步不分離夾層測定將100μl標(biāo)定血清(LondonDiagnosticsTSHLumiTAGKit)、25μlRu(bpy)2+3標(biāo)記的鼠抗TSH(試劑Ⅴ)的ECL緩沖溶液和25μl羊抗TSH-DYNAL顆粒(試劑Ⅰ)的ECL緩沖溶液合并后，在室溫下置于聚丙烯管中溫育15分鐘混合，在得出結(jié)果之前，先加入1mlECL緩沖液，然后按實施例3所述，讀得各個樣品的電致化學(xué)發(fā)光數(shù)。電致化學(xué)發(fā)光量與樣品中被分析物的濃度成正比(電致化學(xué)發(fā)光量與被分析物的濃度成正比增加)。表Ⅳ給出了測量曲線的值。表Ⅳ一步不分離夾層測量檢測TSHTSH濃度電致化學(xué)發(fā)光量(μIU/ml)(雙份樣品)0.00261027690.05287028940.10297029500.50347334032.505588549510.0130511313925.0264682730650.04710448664實施例17地高辛的兩步分離對比測定將50μl標(biāo)定血清(TDxAssay，AbbottLabs，Chicago，IL)和25μlRu(bpy)2+3標(biāo)記的鼠抗地高辛(試劑Ⅳ)的ECL緩沖溶液合并后，在室溫下溫育20分鐘混合，加入25μl烏本箭毒苷-BSA-DYNAL顆粒(試劑Ⅲ)的ECL緩沖液，再在室溫下溫育20分鐘混合，通過磁力分離洗滌顆粒，再將顆粒懸浮到500μl的ECL緩沖液中，該洗滌步驟再重復(fù)2次。最后將顆粒懸浮在1ml的ECL緩沖液中，按實施例3所述方法讀得各個樣品的電致化學(xué)發(fā)光數(shù)。電致化學(xué)發(fā)光量與樣品中被分析物的濃度成反比(電致化學(xué)發(fā)光量隨著被分析物的濃度增加而降低)。表Ⅴ給出了測量曲線的值。表Ⅴ兩步分離對比測量檢測地高辛地高辛濃度電致化學(xué)發(fā)光量(ng/ml)(雙份樣品)0.022031211540.513367136381.0950696072.0524451293.0295929945.015811631實施例18地高辛的兩步不分離對比測定將50μl標(biāo)定血清(TDxAssay，AbbottLabs，Chicago，IL)和25μlRu(bpy)2+3標(biāo)記的鼠抗地高辛(試劑Ⅳ)的ECL緩沖溶液合并后，在室溫下溫育20分鐘混合，加入25μl烏本箭毒苷-BSA-DYNAL顆粒(試劑Ⅲ)的ECL緩沖液，再在室溫下溫育20分鐘混合，在讀數(shù)前將顆粒懸浮在1ml的ECL緩沖液中，按實施例3所述方法讀得各個樣品的電致化學(xué)發(fā)光數(shù)。電致化學(xué)發(fā)光量與樣品中被分析物的濃度成反比(電致化學(xué)發(fā)光量隨著被分析物的濃度的增加而降低)。表Ⅵ給出了測量曲線的值。表Ⅵ兩步不分離對比測量檢測地高辛地高辛濃度電致化學(xué)發(fā)光量(ng/ml)(雙份樣品)0.042051396430.528721280741.022190213642.014660145423.011315118935.091618945實施例19在電極上加洗最終反應(yīng)樣品通過讀數(shù)周期進(jìn)行地高辛兩步不分離對比測定將50μl標(biāo)定血清(TDxAssay，AbbottLabs，Chicago，IL)和25μlRu(bpy)2+3標(biāo)記的鼠抗地高辛(試劑Ⅳ)的ECL緩沖溶液合并后，在室溫下溫育20分鐘混合，加入25μl烏本箭毒苷-BSA-DYNAL顆粒(試劑Ⅲ)的ECL緩沖液，再在室溫下溫育20分鐘混合，在讀數(shù)前將顆粒懸浮在1ml的ECL緩沖液中，按實施例3所述方法讀得各個樣品的電致化學(xué)發(fā)光數(shù)。電致化學(xué)發(fā)光量與樣品中被分析物的濃度成反比(電致化學(xué)發(fā)光量隨著被分析物的濃度的增加而降低)。表Ⅶ給出了測量曲線的值。表Ⅶ兩步分離對比測量檢測地高辛地高辛濃度電致化學(xué)發(fā)光量(ng/ml)(雙份樣品)0.042613353090.524211241681.017561172062.01049199093.0671271455.046804603實施例20寡核苷酸的合成使用β-氨基磷酸氰乙酯(1)在應(yīng)用生物系統(tǒng)自動寡核苷酸合成儀上合成寡核苷酸，用改性固相(受控帶孔玻璃)在最后結(jié)合步驟時對5′端和3′端進(jìn)行寡核苷酸氨基的飾變。Clontech公司(SanDiegoCA)提供了氨基改性劑，生成的5′端飾變的寡核苷酸被稱為(C6，NH)的氨基都含有6個碳原子的間隔鏈段，3′端飾變的寡核苷酸對氨基則都含有3個碳原子的間隔鏈段。被構(gòu)建的寡核苷酸及其修飾和利用將在下面詳述。HPV的寡核苷酸已有文獻(xiàn)(2)介紹為E6區(qū)。寡核苷酸順序如下HPV16;1PV165′(C6,NH2)TTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTT;2PV165′(C6,NH2)CAGTTAATACACCTAATTAACAAATCACAC;3PV165′(C6,NH2)ACAACATTAGAACAGCAATACAACAAACCG;HPV18;1PV185′(C6,NH2)TTAGAGAATTAAGACATTATTCAGACT;2PV185′(C6,NH2)CACCGCAGGCACCTTATTAATAAATTGTAT;3PV185′(C6,NH2)GACACATTGGAAAAACTAACTAACACTGGG.上述寡核苷酸能使PCR產(chǎn)生各種片段，3PV16或3PV18與2PV16或2PV18形成62bp片段;1PV16與2PV16形成100bp片段;1PV18與2PV18形成103bp片段。已知3PV16和3PV18寡核苷酸還能用作與由1PV16和2PV16以及1PV18與2PV18的PCR反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行雜交的探計，以及用作與由PCR內(nèi)寡核苷酸2PV16和2PV18產(chǎn)生的鏈進(jìn)行雜交的探針。用于Ha-ras點突變測量的寡核苷酸如下HRP15′(C6,NH2)GCGATGACGGAATATAAGCTGGTGGTGGTG;HRP25′(C6,NH2)TTCTGGATCAGCTGGATGGTCAGCGCACTC;上述2個寡核苷酸引物就是80bp片段的PCR合成，用于該點突變的探針的順序如下1T245′(C6,NH2)GGCGCCGTCGGTGTGGGCAA;1CHR5′(C6,NH2)GGCGCCGGCGGTGTGGGCAA;2T245′(C6,NH2)TTGCCCACACCGACGGCGCC;2CHR5′(C6,NH2)TTGCCCACACCGCCGGCGCC.除上述順序外，我們還合成了上述的1CHR和2T24順序，其不含5′端氨基飾變但帶3′端氨基，這些3′端氨基修飾的寡核苷酸用ECL標(biāo)記物標(biāo)記并用于雜交。突變/失配的位點由核苷酸清楚地指出。探針1T24和1CHR與由PCR中的寡核苷酸HRP2產(chǎn)生的鏈雜交，探針2T24和2CHR與由PCR中的寡核苷酸HRP1產(chǎn)生的鏈雜交。與顆粒相結(jié)合的寡核苷酸JK8和JK8C的2個順序是由水母發(fā)光蛋白順序衍生得到的并且彼此互補(bǔ)。JK8和JK8C順序如下JK85′(C6,NH2)GTCCAATCCATCTTGGCTTGTCGAAGTCTGAJK8C5′(C6,NH2)TCAGACTTCGACAACCCAAGATGGATTGGALC.寡核苷酸JK7是用由Clontech公司(SanDiegoCA)得到的能在順序內(nèi)進(jìn)行氨基飾變的氨基改性劑修飾過的氨基。JK7用Ru(bpy)2+3標(biāo)記物標(biāo)記，其順序如下JK75′TCAGACTTCGACAA(NH2)CCCAAGATGGATTGGA:由離體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的用于水母發(fā)光蛋白RNA的寡核苷酸探針T35用生物素和Ru(bpy)2+3標(biāo)記物標(biāo)記，T35的順序如下T355′(NH2)GATTTTTCCATTGTGGTGGACATCAAGGAA為了檢測大腸桿菌DNA，我們合成了對如下所示的基因組(3)的TrpE/D區(qū)具有特異性的寡核苷酸TRP.CO35′(C6,NH2)GCCACGCAAGCGGGTGAGGAGTTCC(NH2)該順序用Ru(bpy)2+3標(biāo)記物標(biāo)記，和TRP.CO45′(C6,NH2)GTCCGAGGCAAATGCCAATAATGG該順序用生物素標(biāo)記，詳述于后。實施例21標(biāo)記寡核苷酸所有合成寡核苷酸都通過BiogelP6(BioRadLans)柱的凝膠過濾進(jìn)行純化，除去雜的氨基。使用NHS-生物素(Clontech，SanDiegoCA)，通過PCR引物的5′-氨基引入生物素(4)。按如下所述，通過修飾的寡核苷酸的氨基引入Ru(bpy)2+3-NHS。在室溫和黑暗條件下，將溶于100μlPBS(pH7.4)的寡核苷酸(0.1μmole)與溶于DMSO的5μmoleRu(bpy)2+3標(biāo)記物反應(yīng)過夜。用乙醇沉淀法由這些標(biāo)記反應(yīng)物中回收寡核苷酸。最近的研究證明，用0.5μmoleRu(bpy)2+3標(biāo)記物能夠有效地進(jìn)行標(biāo)記(＞80%)(數(shù)據(jù)未示)。標(biāo)記的寡核苷酸通過逆向VydacC-18半制備柱上的HPLC進(jìn)一步進(jìn)行純化，其流動相為(A)100mM乙酸四乙銨，pH7.0;和(B)50%的(A)和50%乙腈，由20%至40%B梯度移動。探針1CHR和1T24也用32P、T4多核苷酸激酶和由已建立的方法產(chǎn)生的比活性為77000cpm/ng的探針進(jìn)行標(biāo)記(5)。實施例22核酸磁性顆粒的制備按常規(guī)方法(6)，用甲苯-4-磺酸2-氟-1-甲基吡啶鎓激活DynalM450顆粒，然后將激活的這些顆粒與寡核苷酸JK8和JK8C反應(yīng)，將33nmole寡核苷酸的650μl0.1MNaHCO3溶液加到100mg激活的Dynal顆粒中，溫育3小時混合，再加入4ml乙醇胺(0.1M)封阻顆粒。將結(jié)合的顆粒與0.5mg/ml鮭魚精子單鏈DNA的ECL緩沖液混合，在ECL緩沖液中洗滌4-5次，再懸浮在10mg/ml含100μg/ml鮭魚精子單鏈DNA的ECL緩沖液中。實施例23抗生蛋白鏈菌素磁性顆粒Ⅰ的制備按常規(guī)方法(6)，用甲苯-4-磺酸2-氟-1-甲基吡啶鎓激活DynalM450顆粒，然后將激活的顆粒與抗生蛋白鏈菌素(SigmaLtd)反應(yīng)。用0.1MNaHCO3洗滌激活顆粒(50mg)，再加入1.5mg抗生蛋白鏈菌素，反應(yīng)過夜。加入4ml乙醇胺(0.1M)封阻顆粒。結(jié)合的顆粒與0.5mg/ml鮭魚精子單鏈DNA的ECL緩沖液混合，在ECL緩沖液中洗滌4-5次，懸浮在含100μg/ml鮭魚精子單鏈DNA的10mg/mlECL緩沖液中。由DynalM-280得到的抗生蛋白鏈菌素還證明具有重要意義，但用現(xiàn)在的測量順序則信號較低。為了進(jìn)行免疫測量，可用被動包覆用的緩沖液結(jié)合抗原或抗體后，再用BSA封阻所用顆粒。實施例24抗生蛋白鏈菌素磁性顆粒Ⅱ的制備將105μl含50mg/ml生物素-x-NHS(Clontech，SanDiegoCA，5002-1)的二甲亞砜加到15mgBSA(于2-3mlPBS中)中，混合后在室溫下溫育30分鐘。加入30μl1M甘氨酸使反應(yīng)終止，再在室溫下溫育10分鐘。該反應(yīng)混合物經(jīng)凝膠過濾層析(Biorad，Bio-GelP6)純化。生物素-BSA用0.2μm注射器過濾。將5mg生物素-BSA的10ml0.2M碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液(pH9.6)加到300mg經(jīng)碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液洗滌過的Dynabead(Dynal14002)中，混合物經(jīng)渦動后，在室溫下溫育過夜混合。這些顆粒經(jīng)磁力分離后，加入10ml的ECL稀釋液和100μltRNA(10mg/ml)，再在室溫下溫育3-4小時混合，用10ml的ECL稀釋劑一次洗滌這些顆粒，然后懸浮在10ml的ECL稀釋液和100μltRNA(10mg/ml)中。混合后在2-6℃下溫育過夜，使蛋白質(zhì)固定在顆粒上。顆粒經(jīng)磁力分離后，懸浮在含15mg抗生蛋白鏈菌素(ScrippsS1214)的10mlPBS中，混合1小時，顆粒在10ml的ECL稀釋液中洗滌4次，每次洗滌都經(jīng)5分鐘混合。最后將顆粒懸浮在29.7ml的ECL稀釋液和300μltRNA(10mg/ml)中，使最終濃度達(dá)到10mg/ml顆粒+100μg/mltRNA。實施例25通過與ECLDNA探針的雜交檢測固定在顆粒上的DNA通過結(jié)合著JK8和JK8C的顆粒(實施例22)與Ru(bpy)2+3標(biāo)記寡核苷酸JK7雜交，證明能夠檢測與顆粒雜交后的ECL。將于ECL緩沖液中的大量顆粒(300μg)分別與含有12.5、6.3、3.01和1.5fmole標(biāo)記JK7的50μlECL緩沖液混合，這些混合物在52℃下雜交4小時后，用1mlECL緩沖液洗滌，然后懸浮在830μlECL緩沖液中。按實施例1所述分析上述樣品，探針JK7與JK8順序互補(bǔ)，但不與JK8C順序互補(bǔ)。表Ⅷ顆粒探針量(fmole)ECL量JK812.550856.330353.0113451.5657JK8C12.54516.33453.012561.5212示于表Ⅷ的結(jié)果證明，經(jīng)過特異性雜交，由ECL能夠檢測直接固定在顆粒表面上存在的特異性順序。實施例26根據(jù)珠粒結(jié)合的ECL測量RNA按常規(guī)方法(實施例10)，用對RNA/DNA抗體具有特異性的抗體(7)包覆DynalM450顆粒，特異性RNA是用由我們克隆的水母發(fā)光蛋白基因(8)得到的質(zhì)粒產(chǎn)生的。簡要地說，質(zhì)粒pA5′用純化的EcoRI切割，并用產(chǎn)生T3-RIRNA(負(fù)RNA)的T3RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。質(zhì)粒pA5′還用純化的BamHI切割，并用產(chǎn)生T7-BamRNA(正NRA)的T7RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。因此，這兩種RNA代表兩種互補(bǔ)RNA，并且都用等體積的苯酚∶氯仿(50∶50)提取純化，再用氯仿提取和2.5體積乙醇沉析出上清液，經(jīng)凝膠電泳和分光光度法測定RNA的量。這些方法都已建立并為本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知(9)。按已知方法，以25∶1(Ru(bpy)2+3標(biāo)記物∶抗生蛋白鏈菌素)的過量摩爾比，用Ru(bpy)2+3標(biāo)記物標(biāo)記抗生蛋白鏈菌素(實施例13)。該標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素按知方法(10)用亞氨基生物素柱進(jìn)行純化。經(jīng)過測定抗生蛋白鏈菌素，每個抗生蛋白鏈菌素四聚物含有10個Ru(bpy)2+3標(biāo)記物。然后將該標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素與含生物素的T35復(fù)合，寡核苷酸與標(biāo)記抗生蛋白鏈菌素的混合比為1∶1。每20pmole混合成最終體積為15μl的ECL緩沖液，在4℃下溫育過夜，形成標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素-寡核苷酸(SA-T35)復(fù)合物。正和負(fù)RNA(10ng)的樣品與2μlSA-T35復(fù)合物(一步測量)或與25ng含生物素的T35(兩步測量)雜交。將樣品配制成50μl，并在50℃下雜交3小時，然后加入200μg抗DNA/RNA抗體包覆的顆粒(于20μlPBS0.1%BSA中)。該混合物在室溫下混合1小時后，在ECL緩沖液中洗滌2次。將與SA-T35復(fù)合物雜交后的樣品懸浮在530μlECL緩沖液中，并按實施例1所述方法進(jìn)行分析。將僅與含生物素的T35雜交過的樣品與50pmole標(biāo)記抗生蛋白鏈菌素一起混合溫育1小時，再在ECL緩沖液中洗滌2次。經(jīng)過雜交的樣品懸浮在530μlECL緩沖液中，并按實施例1所述方法進(jìn)行分析。結(jié)果示于表Ⅸ。表Ⅸ測量RNAECL平均量一步法正815負(fù)91兩步法正1123負(fù)194實施例27聚合酶鏈反應(yīng)基本上按(11，12，13)所述進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。除非另有說明外，一般說來各反應(yīng)都用100μl。PCR是以不對稱方式摻入Ru(bpy)2+3標(biāo)記物，使用5pmole含生物素的寡核苷酸和50pmoleRu(bpy)2+3標(biāo)記的寡核苷酸。Ha-ras點突變的測量是在相同條件下進(jìn)行的，但不加Ru(bpy)2+3標(biāo)記的寡核苷酸。不分離的HPV測量是以不對稱方式進(jìn)行的，但使用了10倍過量的含生物素的寡核苷酸，一般為40pmole。熱周期的條件如下直接摻入HPV18和16的測量為93℃1秒，50℃1秒，60℃2分鐘;Ha-ras點突變的測量為93℃1秒，69℃2分鐘;不分離的HPV測量為93℃10秒，50℃30秒，60℃2分鐘。根據(jù)測量和所要求的靈敏度，進(jìn)行PCR的循環(huán)數(shù)為30至40。實施例28DNA探針的測量(Ⅰ)通過摻入酶檢測和定量分析人乳頭狀瘤病毒PCR產(chǎn)物在直接摻入Ru(bpy)2+3標(biāo)記的寡核苷酸進(jìn)行PCR后，將整個反應(yīng)混合物(90-100μl)加到600μg抗生蛋白鏈菌素結(jié)合的磁性顆粒Ⅰ中，在室溫下振蕩溫育20分鐘。用磁條將樣品中的固相分離，經(jīng)ECL緩沖液洗滌2次后，懸浮在530μlECL緩沖液中，按實施例1所述分析電致化學(xué)發(fā)光。圖3解釋了這個測量，用人乳頭狀瘤病毒樣品(2，14)證明該測量的結(jié)果。關(guān)于將Ru(bpy)2+3標(biāo)記的寡核苷酸直接摻入到含生物素的PCR產(chǎn)物中的特定研究則使用了密切相關(guān)的HPV16和HPV18型病毒，對于是否存在HPV16和18的測量使用對病毒型和病毒特異性寡核苷酸均為正反應(yīng)的DNA樣品。各個引物如下2PV16、2PV18是含有生物素的，3PV16、3PV18是Ru(bpy)2+3標(biāo)記的寡核苷酸。2/3PV16和2/3PV18寡核苷酸分別對HPV16和18具有特異性。生成的珠粒俘獲的Ru(bpy)2+3標(biāo)記物按實施例1所述方法分析ECL。結(jié)果以樣品引物的各種組合的ECL量示于圖6。為了說明我們所進(jìn)行的測量的量的性質(zhì)，給出了將Ru(bpy)2+3標(biāo)記物和含生物素的寡核苷酸直接摻入到HPV16PCR產(chǎn)物中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，生成的珠粒結(jié)合的Ru(bpy)2+3標(biāo)記物按實施例1所述方法分析ECL。與HPV16DNA濃度的增加相比較，用病毒拷貝數(shù)與總的細(xì)胞DNA拷貝數(shù)之比表示，給出了ECL光子的峰值。用于HPV16分析的引物是1PV16(生物素標(biāo)記)和2PV16(Ru(bpy)2+3標(biāo)記)。用于各PCR的DNA使用小牛胸腺保持在1μg的恒量。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果示于圖7。關(guān)于該測量的特異性和定量分析的結(jié)果說明，這些ECL標(biāo)記物能夠用于簡便快速地進(jìn)行DNA測定。同時還說明，該標(biāo)記物能夠很容易與酶反應(yīng)相聯(lián)系但并不影響酶的方法。實施例29DNA探針的測量(Ⅱ)檢測和測定人Ha-ras致癌基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的點突變我們使用寡核苷酸HRP1和HRP2進(jìn)行Ha-ras基因的PCR反應(yīng)。使用帶未標(biāo)記HRP2的含生物素的HRP1，生成的PCR產(chǎn)物能夠與Ru(bpy)2+3標(biāo)記的探針2CHR和2T24雜交。反之，使用帶未標(biāo)記HPR1的含生物素的HRP2，則生成的PCR產(chǎn)物能夠與Ru(bpy)2+3標(biāo)記的探針1CHR和1T24雜交。所用的DNA是人胎盤細(xì)胞DNA(正常)和用膀胱癌T24得到的突變Ha-ras基因轉(zhuǎn)染過的鼠NIH3T3細(xì)胞DNA(15)。測量方法如下將90μlPCR反應(yīng)混合物加到600μg抗生蛋白鏈菌素結(jié)合的磁性顆粒Ⅰ，然后在室溫下溫育30分鐘，用磁條分離出這些樣品中的固相，先后用50mMNaOH和雜交緩沖液(0.9MNaCl，50mMNaPO4，pH7.7，5mMEDTA，0.1%W/V聚蔗糖，0.1%W/V聚乙烯吡咯烷酮，0.1%W/V牛血清清蛋白)洗滌，然后懸浮在含10μg/mlRu(bpy)2+3標(biāo)記寡核苷酸的雜交緩沖液中。上述樣品在66℃下雜交15分鐘。用磁條分離出固相后，經(jīng)0.9MNaCl、50mMNaPO4pH7.7、5mMEDTA洗滌2次，再用3M氯代四甲銨、50mMTris-HClpH8.0、2mMEDTA、0.025%tritonX-100在室溫下洗滌1次，在66℃下洗滌2次，每次20分鐘。固相用ECL緩沖液洗滌3次后，懸浮在530μlECL緩沖液中，按實施例1所述方法檢測電致化學(xué)發(fā)光。圖4說明了該項測量。用32P標(biāo)記探針進(jìn)行的Ha-rasPCR產(chǎn)物的測量與用Ru(bpy)2+3標(biāo)記的相類似，只是將固相最終懸浮在250μlECL緩沖液中，然后將這些樣品轉(zhuǎn)移到5ml閃爍液體中，并用BeckmanLS-100C液體閃爍計數(shù)管計數(shù)。由圖8可以看到Ha-ras致癌基因點突變測量的數(shù)據(jù)。如圖4所示，PCR的測量使用了帶未標(biāo)記的HRP1的含生物素的HRP2(用于探針1T24和1CHR)和帶未標(biāo)記HRP2的含生物素的HRP1(用于探針2T24和2CHR)，得到用于雜交的珠粒結(jié)合的單鏈靶。DNA樣品是正常的(胎盤)Ha-ras基因和突變的(NIH3T3-T24)Ha-ras基因。珠粒結(jié)合的DNA與Ru(bpy)2+3標(biāo)記的1T24(1T24)、Ru(bpy)2+3標(biāo)記的2T24(2T24)、Ru(bpy)2+3標(biāo)記的1CHR(1CHR)和Ru(bpy)2+3標(biāo)記的2T24(2CHR)雜交后經(jīng)TEMAC洗滌，生成的珠粒結(jié)合的Ru(bpy)2+3標(biāo)記物按實施例1所述方法進(jìn)行ECL分析。結(jié)果用樣品探針的各種組合的ECL量表示。如所期望的結(jié)果(示于圖8)，正常探針與正常DNA雜交情況良好(見CHR探針)，突變探針能與突變基因雜交(見T24探針)。頗有意義的是這些探針的性能并非完全相同。為了研究這個明顯的異常情況，我們用含或不含Ru(bpy)2+3標(biāo)記物的32P標(biāo)記探針對上述探針作進(jìn)一步的研究。按如下所述，用32P標(biāo)記探針研究Ru(bpy)2+3標(biāo)記探針對Ha-ras致癌基因的特異性。如圖8所示，僅用帶未標(biāo)記HRP1的含生物素的HRP2(用于探針1T24和1CHR)進(jìn)行PCR測量。所用的探針為以含32P的1T24和1CHR(1T24-P，1CHR-P)作為對照，用含32P和Ru(bpy)2+3標(biāo)記物的1T24和1CHR測量用Ru(bpy)2+3標(biāo)記物的作用。樣品按上所述用TEMAC洗滌，生成的珠粒結(jié)合的32P在加入閃爍合劑的閃爍計數(shù)管中進(jìn)行分析。結(jié)果用樣品探針的各種組合的每秒32P數(shù)表示(見圖9)。該結(jié)果說明，32P探針和Ru(bpy)2+3標(biāo)記的探針的作用是相同的，關(guān)于探針特異性的種種問題則是由于所用特異性探針的各種順序造成的。為了進(jìn)一步說明我們的Ru(bpy)2+3標(biāo)記物和32P的相同性，我們對這些標(biāo)記探針進(jìn)行了對比。按前所述，用胎盤DNA和帶未標(biāo)記HRP1的含生物素的HRP2(用于探針1T24和1CHR)進(jìn)行擴(kuò)增。然后從生成的PCR產(chǎn)物中取樣，得到一組含有不同產(chǎn)物數(shù)量的樣品。將這些樣品與用32P標(biāo)記的探針(1T24-P32和1CHR-P32)雜交，或與Ru(bpy)2+3標(biāo)記物(1T24-Ru(bpy)2+3和1CHR-Ru(bpy)2+3)雜交。用從90μl樣品的各個標(biāo)記物的平均值，將上述各項研究結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，這些標(biāo)準(zhǔn)化圖可使信號與本底進(jìn)行更有效的對比，并且可對兩種方法進(jìn)行對比。附圖10說明了在稀釋曲線中含量較低時的反應(yīng)。樣品按前所述方法進(jìn)行處理(圖8和圖9)。圖10中的結(jié)果說明，兩個標(biāo)記物與我們的Ru(bpy)2+3標(biāo)記探針的良好反應(yīng)具有相同性。這些研究證明，在區(qū)別樣品DNA中的單個堿基的改變方面，Ru(bpy)2+3標(biāo)記探針與32P標(biāo)記探針都能起相同的作用。這個事實可以說明，在雜交反應(yīng)中Ru(bpy)2+3標(biāo)記物對標(biāo)記探針的性質(zhì)幾乎沒有影響。實施例30DNA探針的測量(Ⅲ)在不分離的測量中檢測和定量分析人乳頭狀瘤病毒PCR產(chǎn)物關(guān)于HPV18的不分離測量，我們用過量含生物素的引物進(jìn)行不對稱PCR反應(yīng)。該PCR反應(yīng)可以通過用Ru(bpy)2+3標(biāo)記探針進(jìn)行直接雜交，從而產(chǎn)生過量的含生物素的單鏈DNA。為了雜交，在完成擴(kuò)增后我們將對經(jīng)過擴(kuò)增的HPV基因具有特異性的1000ECL量的Ru(bpy)2+3標(biāo)記寡核苷酸(～2ng)加到15μlPCR中，然后在50℃下溫育15分鐘。再將含有600μg抗生蛋白鏈菌素結(jié)合的磁性顆粒Ⅰ的60μlECL緩沖液加到該雜交混合物中，在室溫下振動溫育15分鐘。加入ECL緩沖液，使樣品體積增至530μl，然后按實施例1所述方法檢測電致化學(xué)發(fā)光。圖5說明了該測量。為了說明這個不分離測量，我們作了HPV18DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用含生物素的2PV18、未標(biāo)記1PV18和HeLaDNA進(jìn)行PCR測量(14)。生成的PCR反應(yīng)物與特異性探針Ru(bpy)2+3標(biāo)記3PV18雜交。然后將雜交混合物加到抗生蛋白鏈菌素包覆的顆粒中，按實施例1所述方法生成的珠粒結(jié)合的Ru(bpy)2+3標(biāo)記物直接進(jìn)行ECL分析。結(jié)果用ECL量與加到含對照ras寡核苷酸探針的PCR中的HPV18拷貝數(shù)的關(guān)系表示(見圖11)。這些結(jié)果說明，根據(jù)ECL測量系統(tǒng)的性質(zhì)，能夠快速不分離測定核酸順序。實施例31特異性基因組DNA順序的測定此例所述測定使用了2個寡核苷酸，都與相互靠近的相同的DNA鏈雜交，其中一個俘獲，另一個標(biāo)記復(fù)合物(夾層雜交)。該測定使用了對trpE/D基因區(qū)有特異性的大腸桿菌DNA和探針。大腸桿菌DNA按常規(guī)方法(16)制備，鮭魚精子對照DNA由Sigma公司提供。將14μl雜交緩沖液(10×PBS，10mMEDTA和0.7%SDS)、2ng生物素標(biāo)記的TRP.CO4和5ngRu(bpy)2+3標(biāo)記TRP.CO3加到DNA樣品中，用水將樣品制備成100μl，加熱至97℃，再在97℃下溫育10分鐘，然后冷卻至50℃，雜交2小時。將20μl抗生蛋白鏈菌素包覆的磁性顆粒Ⅱ加到樣品中，在室溫下混合2小時，顆粒在ECL緩沖液中洗滌4次，再懸浮在500μlECL緩沖液中，按實施例3所述方法進(jìn)行分析。正DNA是大腸桿菌，負(fù)DNA是鮭魚精子，結(jié)果示于表Ⅹ。表ⅩDNA含量電致化學(xué)發(fā)光平均量正101842525750266.5負(fù)108725705075上述結(jié)果說明，使用夾層雜交測量方法在未擴(kuò)增的DNA上，電致化學(xué)發(fā)光測量系統(tǒng)能夠用于檢測大腸桿菌中的基因組基因。在這個實施例中，與抗生蛋白鏈菌素包覆的磁性顆粒Ⅱ一樣，也可使用抗生蛋白鏈菌素包覆的磁性顆粒Ⅰ。實施例32在漸消失波熒光檢測器上顆粒的富集使用漸消失波檢測器在檢測表面上標(biāo)記復(fù)合物的富集可用于提高測量的靈敏度。這類檢測器可以使用光學(xué)纖維或平面光波導(dǎo)300將光310由光源帶至液體環(huán)境。由于入射光束射到高折射指數(shù)電介質(zhì)(n1)和低折射指數(shù)電介質(zhì)(n2)間的界面產(chǎn)生的總內(nèi)部反射(TIR)310′，光反射穿過波導(dǎo)或光纖。當(dāng)光束入射角大于臨界角θ0315(該角表示垂直線300′和光程310′之間的角度)，θ0＝Sin-1(n2/n1)，光在界面處100%的內(nèi)反射。在光波導(dǎo)和光纖中，光以大于臨界角的入射角傳播，并且以總內(nèi)部反射穿過介質(zhì)。圖22表示在波導(dǎo)或光纖中TIR的傳播。雖然光線在與界面相互作用的各點上能夠完全反射，但是在介質(zhì)外的電磁場并不等于0。當(dāng)電磁場由光纖或波導(dǎo)外部透入到外部環(huán)境時，連續(xù)穿過界面就物理學(xué)要求而言，電磁場需要按指數(shù)衰減。這個電磁場稱為漸消失場320，并且能將熒光團(tuán)激發(fā)為熒光。漸消失場的衰減率決定于入射波長、折射指數(shù)n1和n2和入射角。在水環(huán)境中使用石英波導(dǎo)和可見光，在由波導(dǎo)/溶液界面的100nm距離內(nèi)，漸消失場320約衰減90%。在圖22中，周圍介質(zhì)330具有折射指數(shù)n2和光纖或波導(dǎo)300以及折射指數(shù)n。光在波導(dǎo)和光纖中傳播產(chǎn)生漸消失場的同樣原理也可使熒光團(tuán)發(fā)光時產(chǎn)生的光有效地被吸收到光學(xué)元件中。此外，在漸消失區(qū)320外產(chǎn)生的任何光都可有效地由進(jìn)入光學(xué)元件中返回。將這些作用結(jié)合起來就能使光纖或波導(dǎo)作為有效的光學(xué)元件用于水環(huán)境中在熒光團(tuán)標(biāo)記物的表面上或表面附近測量熒光團(tuán)標(biāo)記物的存在和濃度。美國專利4447546(系本文的參考文獻(xiàn))介紹了使用光學(xué)纖維激發(fā)和測量標(biāo)記免疫反應(yīng)物的漸消失區(qū)熒光進(jìn)行熒光免疫測量的一種適宜方法和裝置。本發(fā)明使用光纖或波導(dǎo)能夠提高熒光結(jié)合測量的靈敏度，該測量可使用由熒光標(biāo)記的試劑來完成。將顆粒、樣品和試劑進(jìn)行溫育后，顆粒富集在波導(dǎo)或光纖的表面上。由于顆粒的表面積大于波導(dǎo)或光纖的幾何面積，在光學(xué)元件周圍的漸消失區(qū)能夠收集更多的熒光團(tuán)。因此，由顆粒產(chǎn)生的發(fā)光信號將較強(qiáng)，使定量分析的靈敏度更高，從而使各種檢測限度得到改進(jìn)。上述較佳實施例詳細(xì)介紹了本發(fā)明，但不能因此限制本發(fā)明，在不脫離本發(fā)明實質(zhì)的情況下，根據(jù)說明書的介紹，顯然可以作出各種改變，但無疑這也應(yīng)屬本發(fā)明的范圍。參考文獻(xiàn)1.BeaucageSL，CaruthersMH.Deoxynucleosidephosphoramidites，anewclassofkeyintermediatesfordeoxypolynucleotidesynthesis.TetrahedronLett1982;221859-62.2.ShibataDK，ArnheimN，MartinJW.Detectionofhumanpapillomavirusinparaffin-embeddedtissueusingthepolymerasechainreaction.JExpMed1988;167225-30.3.Yanofsky，C.etal(1981)NucleicAcidsRes.24，6647-6668.4.UpdykeTV，NicolsonGL.Immunoaffinityisolationofmembraneantigenswithbiotinylatedmonoclonalantibodiesandstreptavidin-agarose.MethodsEnzymol1986;121717-25.5.CardulloRA，AgrawalS，F(xiàn)loresC，ZamecnikDC，WolfDE.Detectionofnucleicacidhybridizationbynonradiativefluorescenceresonanceenergytransfer.ProcNatlAcadSci1988;858790-4.6.NgoTT.Procedureforactivatingpolymerswithprimaryandorsecondaryhydroxylgroups.MakromolChemMacromolSymp1988;17224-39.7.CoutleeF，BoboL，MayurK，YolkenRH，ViscidiRP.ImmunodetectionofDNAwithbiotinylatedRNAprobesAstudyofreactivityofamonoclonalantibodytoDNA-RNAhybrids.AnalBiochem1989;18196-105.8.CasadeiJ，PowellMJ，KentenJH.Expressionandsecretionofaequorinasachimericantibodyusingamammalianexpressionvector.ProcNatlAcadSci1990;872047-51.9.Molecularcloning，alaboratorymanual2ndEdSambrook，J.ColdSpringHarborLaboratoryNewYork10.Heney，G.andOrr，G.A.(1981)AnalBiochem.114，92-96.11.MullisKB，F(xiàn)aloonaFA.SpecificsynthesisofDNAinvitroviaapolymerase-catalyzedchainreaction.MethodsEnzymol1987;155335-50.12.LyonsJ，JanssenJWG，BartramC，LaytonM，MuftiGJ.MutationofKi-rasandN-rasoncogenesinmyelodysplasticsyndromes.Blood1988;711707-12.13.SaikiRK，GelfandDH，StoffelS，ScharfSJ，HiguchiR，HornGT，MullisKB，ErlichHA.Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science1988;239487-91.14.YeeC，Krishnan-HewlettI，BakerCC，SchlegelR，HowleyPM.PresenceandExpressionofHuman-Papillomavirussequencesinhumancervicalcarcinomacelllines.AmJPathol1985;119361-6.15.ReddyEP，ReynoldsRK，SantoE，BarbacidM.ApointmutationisresponsiblefortheacquisitionofthetransformingpropertiesbytheT24humanbladdercarcinomaoncogene.Nature1982;300149-52.16.Marmur，J.(1961)J.Mol.Biol3，208.權(quán)利要求1.結(jié)合測量樣品中有意義分析物的方法，該方法的步驟包括(a)組成組合物，其含有(ⅰ)所述樣品，(ⅱ)測量用物質(zhì)，其含有與能誘導(dǎo)發(fā)光的標(biāo)記化合物連接的組分，和(ⅲ)能與被分析物和/或所述測量用物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合的復(fù)合顆粒；(b)溫育所述組合物，組成含有顆粒和所述標(biāo)記化合物的復(fù)合物；(c)在測量區(qū)收集所述復(fù)合物；(d)通過表面選擇性激發(fā)將所述復(fù)合物中的標(biāo)記化合物誘導(dǎo)發(fā)光；以及(e)測量受射發(fā)光，從而測量樣品中的被分析物。2.按權(quán)利要求1的方法，其中在用于激發(fā)和測量發(fā)光的裝置表面上收集所述復(fù)合物。3.按權(quán)利要求2的方法，用于測量電致化學(xué)發(fā)光中所述復(fù)合物是在電極表面收集的。4.按權(quán)利要求2的方法，其中采用喇曼激射方法。5.按權(quán)利要求2的方法，其中根據(jù)總內(nèi)部反射熒光進(jìn)行測量。6.按權(quán)利要求2的方法，其中采用表面質(zhì)?；蚪M共振方法。7.應(yīng)用電極表面測量電致化學(xué)發(fā)光，對樣品中有意義分析物進(jìn)行結(jié)合測量的方法，該方法包括步驟(a)組成組合物，其含有(ⅰ)所述樣品，(ⅱ)測量用物質(zhì)，其含有與能誘導(dǎo)電致化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記化合物連接的組分，和(ⅲ)能與被分析物或所述測量用物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合的復(fù)合顆粒;(b)溫育所述組合物，組成含有顆粒和所述標(biāo)記化合物的復(fù)合物;(c)收集所述復(fù)合物;(d)通過將電壓施加在所述電極上，使所收集的復(fù)合物與電極表面接觸并將復(fù)合物中的標(biāo)記化合物誘導(dǎo)發(fā)光;以及(e)在電極表面測量受射發(fā)光，從而測量樣品中的被分析物。8.應(yīng)用電極表面測量電致化學(xué)發(fā)光對樣品中有意義分析物進(jìn)行結(jié)合測量的方法，該方法包括步驟(a)組成組合物，其含有(ⅰ)所述樣品，(ⅱ)測量用物質(zhì)，其含有與能誘導(dǎo)電致化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記化合物連接的組分，和(ⅲ)密度大于所述組合物平衡量并能與被分析物或所述測量用物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合的復(fù)合懸浮顆粒;(b)溫育所述組合物，組成含有顆粒和所述標(biāo)記化合物的復(fù)合物;(c)將所述組合物導(dǎo)入測量室;(d)使所述組合物在所述測量室中滯留足夠的時間，從而通過重力使顆粒沉淀在所述電極表面，至少在位于該測量室容器主要部分下面的電極表面收集所述復(fù)合物;(e)通過將電壓施加在所述電極上，將所收集的復(fù)合物中的標(biāo)記化合物誘導(dǎo)發(fā)光;以及(f)在電極表面測量受射發(fā)光，從而測量樣品中的被分析物。9.按權(quán)利要求8的方法進(jìn)行分批測量，使該組合物在所述測量室中滯留足夠的時間，從而使所述顆粒沉淀在該電極表面上。10.按權(quán)利要求8的方法進(jìn)行流動測量，其中所述組合物以足夠低的速率流過該測量室，使至少一部分顆粒沉淀在該電極表面上。11.按權(quán)利要求8的方法，其中所述顆粒的密度為0.1-5g/ml。12.按權(quán)利要求11的方法，其中所述顆粒的密度為0.5-2g/ml。13.按權(quán)利要求8的方法，其中所述顆粒粒徑的平均直徑為0.01-100μm。14.按權(quán)利要求13的方法，其中所述顆粒的粒徑為0.01-10μm。15.按權(quán)利要求8的方法，其中顆粒在所述組合物中的濃度為1-10000μg/ml。16.按權(quán)利要求15的方法，其中所述顆粒濃度為5-1000μg/ml。17.按權(quán)利要求8的方法，其中在所述組合物中，顆粒的密度、粒徑和濃度應(yīng)使沉淀速度至少達(dá)到0.5mm/分鐘。18.按權(quán)利要求8的方法，其中在誘導(dǎo)電致化學(xué)發(fā)光前，用一層所述復(fù)合物至少復(fù)蓋所述電極表面的主要部分。19.應(yīng)用電極表面測量電致化學(xué)發(fā)光對樣品中有意義分析物進(jìn)行結(jié)合測量的方法，該方法包括步驟(a)組成組合物，其含有(ⅰ)所述樣品，(ⅱ)測量用物質(zhì)，其含有與能誘導(dǎo)電致化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記化合物連接的組分，和(ⅲ)密度大于所述組合物平衡量并能與被分析物或所述測量用物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合的復(fù)合懸浮顆粒;(b)溫育所述組合物，組成含有顆粒和所述標(biāo)記化合物的復(fù)合物;(c)離心收集所述復(fù)合物;(d)通過將電壓施加在所述電極上，使所收集的復(fù)合物與電極表面接觸并將復(fù)合物中的標(biāo)記化合物誘導(dǎo)發(fā)光;以及(e)在電極表面測量受射發(fā)光，從而測量樣品中的被分析物。20.按權(quán)利要求19的方法，其中所述離心步驟是在所述電極的表面上收集所述復(fù)合物。21.按權(quán)利要求19的方法，其中所述顆粒的密度為0.1-5g/ml。22.按權(quán)利要求21的方法，其中所述顆粒的密度為0.5-2g/ml。23.按權(quán)利要求19的方法，其中在離心所述樣品的同時測量發(fā)光。24.應(yīng)用電極表面測量電致化學(xué)發(fā)光對樣品中有意義分析物進(jìn)行結(jié)合測量的方法，該方法包括步驟(a)組成組合物，其含有(ⅰ)所述樣品，(ⅱ)測量用物質(zhì)，其含有與能誘導(dǎo)電致化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記化合物連接的組分，和(ⅲ)能與被分析物或所述測量用物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合的復(fù)合懸浮顆粒;(b)溫育所述組合物，組成含有顆粒和所述標(biāo)記化合物的復(fù)合物;(c)過濾收集所述復(fù)合物;(d)通過將電壓施加在所述電極上，使所收集的復(fù)合物與電極表面接觸并將復(fù)合物中的標(biāo)記化合物誘導(dǎo)發(fā)光;以及(e)在電極表面測量受射發(fā)光，從而測量樣品中的被分析物。25.按權(quán)利要求24的方法，其中所述過濾步驟是在所述電極的表面上收集所述復(fù)合物。26.按權(quán)利要求24的方法，其中所述顆粒粒徑的平均直徑為0.001-100μm。27.按權(quán)利要求26的方法，其中所述顆粒粒徑為0.01-10μm。28.按權(quán)利要求24的方法，其中所述過濾是在帶孔金屬電極表面上進(jìn)行的，其中孔徑的平均直徑為該顆粒平均直徑的10-90%。29.應(yīng)用電極表面測量電致化學(xué)發(fā)光對樣品中有意義分析物進(jìn)行結(jié)合測量的方法，該方法包括步驟(a)組成組合物，其含有(ⅰ)所述樣品，(ⅱ)測量用物質(zhì)，其含有與能誘導(dǎo)電致化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記化合物連接的組分，和(ⅲ)能與被分析物或所述測量用物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合的復(fù)合磁性感應(yīng)懸浮顆粒;(b)溫育所述組合物，組成含有顆粒和所述標(biāo)記化合物的復(fù)合物;(c)將磁場施加在所述顆粒上收集所述復(fù)合物;(d)通過將電壓施加在所述電極上，使所收集的復(fù)合物與電極表面接觸并將所述復(fù)合物中的標(biāo)記化合物誘導(dǎo)發(fā)光;以及(e)在電極表面測量受射發(fā)光，從而測量樣品中的被分析物。30.按權(quán)利要求19的方法，其中施加所述磁場使在所述電極的表面上能夠收集所述復(fù)合物。31.應(yīng)用電極表面測量電致化學(xué)發(fā)光對樣品中有意義的分析物進(jìn)行結(jié)合測量的方法，該方法包括步驟(a)組成組合物，其含有(ⅰ)所述樣品，(ⅱ)測量用物質(zhì)，其含有與能誘導(dǎo)電致化學(xué)發(fā)光的標(biāo)記化合物連接的組分，和(ⅲ)能與被分析物或所述測量用物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合的復(fù)合磁性感應(yīng)懸浮顆粒;(b)溫育所述組合物，組成含有顆粒和所述標(biāo)記化合物的復(fù)合物;(c)將所述組合物導(dǎo)入測量室;(d)通過將磁場施加在所述顆粒上，在電極表面收集所述復(fù)合物;(e)通過將電壓施加在所述電極上，將所收集的復(fù)合物中的標(biāo)記化合物誘導(dǎo)發(fā)光;以及(f)在電極表面測量受射發(fā)光，從而測量樣品中的被分析物。32.按權(quán)利要求31的方法進(jìn)行分批測量，使該組合物在所述測量室中滯留足夠時間，從而使所述磁場能使所述顆粒沉淀在所述電極表面上。33.按權(quán)利要求31的方法進(jìn)行流動測量，其中所述組合物以足夠低的速率流過所述測量室，使所述磁場能使所述顆粒沉淀在所述電極表面上。34.按權(quán)利要求31的方法，其中所述顆粒的磁化率至少為0.001cgs單位。35.按權(quán)利要求34的方法，其中磁化率至少為0.01cgs單位。36.按權(quán)利要求31的方法，其中所述顆粒的密度為0.5-2g/ml。37.按權(quán)利要求36的方法，其中所述顆粒的密度為0.5-2g/ml。38.按權(quán)利要求31的方法，其中所述顆粒粒徑的平均直徑為0.001-100μm。39.按權(quán)利要求31的方法，其中所述顆粒的粒徑為0.01-10μm，該顆粒為低共振。40.按權(quán)利要求31的方法，其中顆粒在所述組合物中的濃度為1-10000μg/ml。41.按權(quán)利要求40的方法，其中所述顆粒的濃度為5-1000μg/ml。42.按權(quán)利要求31的方法，其中在所述組合物中，該顆粒的磁化率、密度、粒徑和濃度應(yīng)使所述顆粒的沉淀速率至少達(dá)到0.5mm/分鐘。43.按權(quán)利要求31的方法，其中在誘導(dǎo)電致化學(xué)發(fā)光前，用一層所述復(fù)合物至少復(fù)蓋所述電極表面的主要部分。44.按權(quán)利要求31的方法，其中在所述電極表面區(qū)內(nèi)，該磁場的磁力線基本上與所述電極的表面相平行。45.按權(quán)利要求31的方法，其中在收集所述復(fù)合物后和誘導(dǎo)發(fā)光前移去磁場。46.應(yīng)用電極表面測量電致化學(xué)發(fā)光對樣品中的有意義分析物進(jìn)行結(jié)合測量的裝置，該裝置包括(a)限定樣品含量的具有垂直柱狀區(qū)和進(jìn)料排料裝置的樣品室，還包括基本上沿水平方向的位于所述樣品室和柱狀區(qū)主要部分下面的電極;(b)將電壓施加在所述電極上的裝置;以及(c)測量在所述電極上產(chǎn)生的電致化學(xué)發(fā)光的裝置。47.應(yīng)用電極表面測量電致化學(xué)發(fā)光對樣品中的有意義分析物進(jìn)行結(jié)合測量的裝置，該裝置包括(a)限定測量樣品含量的具有進(jìn)料排料裝置的樣品室、電極、以及使所述復(fù)合物在所述電極表面上基本均勻分布的裝置;(b)將電壓施加在所述電極上的裝置;以及(c)測量在所述電極上產(chǎn)生電致化學(xué)發(fā)光的裝置。48.按權(quán)利要求47的裝置，其中所述使復(fù)合物均勻分布的裝置包括產(chǎn)生磁場的裝置，其與所述電極的取向應(yīng)在所述表面區(qū)內(nèi)使該磁場的磁力線與該電極表面基本平行。49.按權(quán)利要求48的裝置，其中所述產(chǎn)生磁場的裝置包括垂直配置在所述電極下面的南北向磁體。50.一種在微顆粒結(jié)合測量中用作試劑的物質(zhì)組合物，該組合物包括顆粒和至少選自下列組分中的一種組分(a)電介質(zhì);(b)含有ECL部分的標(biāo)記化合物;(c)有意義的分析物或其類似物;(d)有意義的分析物或其類似物的結(jié)合對象;(e)能與(c)或(d)反應(yīng)的反應(yīng)組分;(f)還原劑;以及(g)電致化學(xué)發(fā)光反應(yīng)促進(jìn)劑，但在任何試劑組合物中所含的兩種組分在貯藏期間必須都不導(dǎo)致測量時影響其作用。51.按權(quán)利要求50的試劑組合物，其中含有磁性感應(yīng)顆粒。52.一種測量結(jié)合反應(yīng)和電致化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象的試劑，包括(a)電介質(zhì);(b)具有能與測量組合物組分結(jié)合的表面的復(fù)合磁性感應(yīng)顆粒;以及(c)具有結(jié)合性質(zhì)的標(biāo)記物質(zhì)，所述標(biāo)記物質(zhì)包括具有電致化學(xué)發(fā)光性質(zhì)的化學(xué)部分。53.一種用于微顆粒結(jié)合測量的含有試劑的藥盒，該藥盒包含(a)磁性感應(yīng)顆粒和至少一種選自下述的試劑(ⅰ)電介質(zhì);(ⅱ)含有ECL部分的標(biāo)記化合物;(ⅲ)有意義的分析物或其類似物;(ⅳ)有意義的分析物或其類似物的結(jié)合對象;(ⅴ)能與(c)或(d)反應(yīng)的反應(yīng)組分;(ⅵ)還原劑;以及(ⅶ)電致化學(xué)發(fā)光反應(yīng)促進(jìn)劑，或(b)一種或多種試劑，其中至少一種含有磁性感應(yīng)顆粒，所述試劑中所含的組分選自上述組分(ⅰ)-(ⅶ)，但是這樣混合的試劑中的兩種或多種組分必須在貯藏條件下不能與其他一種組分反應(yīng)，以致測量時影響試劑的作用。全文摘要本發(fā)明涉及應(yīng)用電極上的電致化學(xué)發(fā)光對樣品中的有意義的分析物進(jìn)行結(jié)合測量的方法、裝置、試劑和藥盒。采用該方法時，試劑和藥盒顆?？梢酝ㄟ^重力、離心或磁性吸引沉淀在電極表面上。所述裝置包括在接近電極區(qū)內(nèi)產(chǎn)生磁場的磁體。文檔編號G01N21/66GK1064945SQ92102540公開日1992年9月30日申請日期1992年2月7日優(yōu)先權(quán)日1991年2月6日發(fā)明者J·K·利蘭,H·P·沙,J·H·肯滕,J·E·古德曼,G·E·洛克,G·F·布萊克本,R·J·梅西申請人:伊根有限公司