本發(fā)明涉及一種高通量高回收的槍頭式固相萃取方法。

背景技術(shù)：

1、在生物、藥物分析中，固相萃取是一種從各種復(fù)雜樣本中提取有效目標(biāo)物質(zhì)的最佳方法之一，能夠降低基質(zhì)效應(yīng)，提高樣品清潔度以及有利于低濃度分析物/代謝物的分析。市面上常用的是硅膠鍵合的c18小柱以及聚合物基質(zhì)的hlb小柱，根據(jù)填料裝填容器的不同可以分為孔板式、柱式、板式等；根據(jù)容器的不同，可以通過自動(dòng)化處理、基于重力處理、基于正壓/反壓裝置處理、儀器在線處理等；裝填填料根據(jù)需求主要有5mg、10mg、30mg、60mg等。標(biāo)準(zhǔn)spe一般包括5個(gè)步驟，活化、平衡、上樣、清洗和洗脫，對于柱式的spe操作，每一步的操作至少需要用到幾百微升有機(jī)試劑，并且最后一步洗脫，每洗脫一次就需要幾百微升的洗脫劑。

2、洗脫體積大，導(dǎo)致供試液中待測成分的濃度被稀釋，一般需要通過氮吹干燥后，重新復(fù)溶后再用質(zhì)譜進(jìn)樣檢測。這樣會增加步驟，耗費(fèi)時(shí)間人力。

3、如果考慮減少洗脫體積，或者減少洗脫次數(shù)，直接上樣，會存在洗脫體積不足，目標(biāo)化合物回收率不足甚至未被洗脫的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

4、市場上也推出了新的3步spe方案，雖然減去活化和平衡步驟，理論上可以做到節(jié)約樣品制備時(shí)間和溶劑消耗量，但是洗脫液體積較大的問題仍未得到解決。

5、高通量樣本處理系統(tǒng)，即短時(shí)間內(nèi)，同時(shí)處理大量樣本，快速對大量樣品進(jìn)行高通量篩選和分析，是現(xiàn)代檢測技術(shù)的發(fā)展方向。結(jié)合自動(dòng)化系統(tǒng)，可以提高實(shí)驗(yàn)效率，減少人工操作，降低成本，并提高結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

6、市場上有多種規(guī)格的獨(dú)立spe柱可供選擇，但是在操作上無論是基于重力或者正壓/反壓裝置輔助的提取方式，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，無法有效實(shí)現(xiàn)高通量，并且成本較高。將spe做成elution板和自動(dòng)化結(jié)合的方式雖然可以提高通量，但是仍然需要借助吸頭或者鋼針進(jìn)行各類溶劑的轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生較大消耗，提高樣本處理成本。除此之外，商品化填充的柱床體積雖然有多種規(guī)格可選，但填料柱體積仍然較大，購買成本較高，而且對于后續(xù)結(jié)合質(zhì)譜分析的流程而言，仍停留在較大起始樣本體積及處理體積從而導(dǎo)致較大的樣品和中間處理的試劑浪費(fèi)。

7、因此，雖然spe處理能夠?yàn)榉治鰩順O大優(yōu)勢，但是由于該操作耗時(shí)、商品化產(chǎn)品價(jià)格昂貴且操作復(fù)雜，通常不會作為處理樣品首選。因此，亟需一種低成本高通量、可同時(shí)處理多種樣本，可用于復(fù)雜樣品spe處理的新方法。

8、dpx槍頭式分散固相微萃取柱是一種新型的固相萃取裝置，通過槍頭式裝置、分散型樹脂萃取技術(shù)大幅度地提高了固相萃取速度，同時(shí)有效減少了溶劑的用量。dpx槍頭式分散固相微萃取柱內(nèi)部裝填分散的吸附樹脂，在適當(dāng)溶劑條件下，特異性吸附目標(biāo)化合物，經(jīng)洗凈緩沖液洗滌可除去非特異吸附雜質(zhì)，再用洗脫緩沖液洗脫可使目的樣品從相應(yīng)樹脂上分離，完成目標(biāo)化合物的純化與濃縮。槍頭式分散固相微萃取柱結(jié)合自動(dòng)移液系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)高通量，并且減少了起始進(jìn)樣體積和洗脫體積。目前商品化dpx槍頭式分散固相微萃取柱的填料量可以低至1~5mg，但上樣體積仍然需要100μl以上，洗滌以及洗脫的體積通常在200μl以上。槍頭式分散固相微萃取柱雖然已經(jīng)大幅減少了起始樣本體積、填料用量和試劑用量，但仍然沒有解決洗脫液體積較大的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種高通量、低成本、高回收的固相萃取凈化方法，該方法可對微量樣本進(jìn)行處理，消耗相對更少的溶劑，凈化回收到更多目標(biāo)化合物，并且可用于后續(xù)質(zhì)譜直接進(jìn)樣，除特殊需求外無需額外富集濃縮。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、一種高通量高回收的槍頭式固相萃取方法，所述方法為：

4、采用槍頭式固相萃取柱，進(jìn)行活化、平衡、樣品上樣、清洗、洗脫步驟，其特征在于，所述洗脫步驟為：

5、用第一洗脫劑進(jìn)行第一次洗脫，收集第一管洗脫液；

6、用第二洗脫劑進(jìn)行第二次洗脫，收集第二管洗脫液；

7、……

8、用第n洗脫劑進(jìn)行第n次洗脫，收集第n管洗脫液；n為2~10的整數(shù)；

9、將部分或全部的第二管、第三管……、第n管洗脫液和全部的第一管洗脫液合并，得到洗脫液。

10、所述洗脫液可直接進(jìn)行質(zhì)譜分析。

11、進(jìn)一步，所述洗脫劑可以根據(jù)樣品性質(zhì)，以及樣品和槍頭式固相萃取柱的填料之間的吸附性能而適應(yīng)性的改變。第一洗脫劑、第二洗脫劑、……、第n洗脫劑的種類和成分比例，可以相同也可以不同。

12、常用的洗脫劑包括有機(jī)溶劑（甲醇、乙腈、乙醇、異丙醇中的一種或多種混合）、水-有機(jī)溶劑混合物（水-甲醇、水-乙腈）、酸性溶液（0.1%甲酸水溶液、0.1%乙酸水溶液）、堿性溶液（0.1%氫氧化銨水溶液）及鹽溶液（磷酸鹽緩沖液）等。

13、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，第一洗脫劑、第二洗脫劑、……、第n洗脫劑為甲醇、乙腈的混合溶劑。

14、更優(yōu)選所述甲醇、乙腈的混合溶劑中，甲醇的體積分?jǐn)?shù)為20~80%，更優(yōu)選50%。

15、優(yōu)選所述第二次、第三次……第n次洗脫時(shí)，吸取洗脫劑，吹出液體，如此反復(fù)吹吸1~10次，優(yōu)選反復(fù)吹吸3~7次，更優(yōu)選反復(fù)吹吸3~5次。

16、對于洗脫次數(shù)，優(yōu)選n=2，即洗脫兩次即可。

17、更優(yōu)選的，所述第一管洗脫液的體積記為v1，第二管洗脫液的體積記為v2，……，第n管洗脫液的體積記為vn，

18、v1、v2、……、vn的體積各自獨(dú)立為20~200μl，優(yōu)選20~100μl，更優(yōu)選20~50μl。

19、優(yōu)選v1≤v2，……、vn

20、更優(yōu)選，v1=v2=…=vn。

21、優(yōu)選最終洗脫液的體積v=v1+v2*(v1/v2*k2)+v3*(v1/v3*k3)+……+vn*(v1/vn*kn)

22、k2、……、kn為權(quán)重修正因子，優(yōu)選范圍各自獨(dú)立為0.1~10，優(yōu)選為0.1~1，更優(yōu)選為0.1~0.5，當(dāng)k2=1時(shí)，代表從第二管洗脫液中轉(zhuǎn)移v1體積的洗脫液與第一管洗脫液混合。

23、所述方法中，活化、平衡、樣品上樣、清洗步驟，采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)即可。

24、所述槍頭式固相萃取柱為設(shè)有固相萃取填料的錐形管，錐形管的下端尖頭管口內(nèi)設(shè)有過濾篩板，固相萃取填料填充于過濾篩板上；所述過濾篩板具有能夠使液體試樣通過的孔或孔隙結(jié)構(gòu)。

25、所述過濾篩板的上方為固相萃取填料層，所述固相萃取填料可以采用市面上通用的spe填料或自制填料，常用的spe填料包括c18（十八烷基鍵合硅膠）、c8（辛烷基鍵合硅膠）、hlb（親酯-親水高分子混合材料）、硅膠、離子交換樹脂、聚合物吸附劑等。常用的一般為c18填料、hlb填料等。

26、所述槍頭式固相萃取柱可以為商品化產(chǎn)品，也可以采用自填柱。

27、所述槍頭式固相萃取柱的填料量可以低至5μg~1mg，更低的填料用量顯著降低了固相萃取填料成本，有利于降低高通量檢測成本，通過高通量顯著提高檢測效率。

28、優(yōu)選活化步驟中采用甲醇活化，體積優(yōu)選50~200μl，次數(shù)可以為1~10次。

29、所述平衡步驟中采用水進(jìn)行平衡，體積優(yōu)選50~200μl，次數(shù)可以為1~10次。

30、所述槍頭式固相萃取柱的填料為hlb填料時(shí)，可省略活化步驟。

31、所述樣品上樣的步驟中，樣品的體積優(yōu)選5~200μl，可以通過反復(fù)吹吸樣本來上樣，吹吸次數(shù)可以為1~10次。

32、所述清洗步驟中，采用的清洗液為甲醇、水的混合溶劑，其中甲醇的體積分?jǐn)?shù)為1~10%，優(yōu)選3~5%，清洗次數(shù)可以為1~10次。

33、優(yōu)選的，本發(fā)明槍頭式固相萃取柱和自動(dòng)化移液裝置結(jié)合，自動(dòng)化移液裝置可以精準(zhǔn)移液，通過設(shè)置自動(dòng)化流程步驟，設(shè)置各步驟吸取體積、吹洗次數(shù)，以及各管洗脫液的收集體積，實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化樣本萃取前處理。

34、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明方法的洗脫步驟優(yōu)選為：

35、用第一洗脫劑進(jìn)行第一次洗脫，收集第一管洗脫液，體積為v1；

36、用第二洗脫劑進(jìn)行第二次洗脫，反復(fù)吹吸3~5次，收集第二管洗脫液，體積為v2，v2=v1；

37、將30%~80%（優(yōu)選50%）v1體積的第二管洗脫液和全部的第一管洗脫液合并，得到洗脫液。

38、本發(fā)明還公開了一種高通量高回收的鑒定檢測方法，所述方法為：

39、對待測樣本進(jìn)行提取，所得提取液采用槍頭式固相萃取柱，進(jìn)行活化、平衡、樣品上樣、清洗、洗脫步驟，所得洗脫液采用質(zhì)譜分析，其特征在于，所述洗脫步驟為：

40、用第一洗脫劑進(jìn)行第一次洗脫，收集第一管洗脫液；

41、用第二洗脫劑進(jìn)行第二次洗脫，收集第二管洗脫液；

42、……

43、用第n洗脫劑進(jìn)行第n次洗脫，收集第n管洗脫液；n為2~10的整數(shù)；

44、將部分或全部的第二管、第三管……、第n管洗脫液和全部的第一管洗脫液合并，得到洗脫液，直接用于質(zhì)譜分析。

45、本發(fā)明的有益效果在于：提供了一種高通量高回收的槍頭式固相萃取方法，通過多次洗脫來保證目標(biāo)化合物回收的完整性，通過部分轉(zhuǎn)移減少洗脫液的體積，但并不因此影響檢測目標(biāo)化合物回收的完整性，反而提高了對目標(biāo)化合物的檢出率，增加靈敏度，提高了檢測效率和檢測質(zhì)量，降低了試劑用量和操作步驟，降低成本。

46、在現(xiàn)有的洗脫方式中，洗脫液體積較大，如果想要處理樣本后直接進(jìn)樣，只能選擇較小的洗脫體積，否則目標(biāo)物整體稀釋倍數(shù)太大，會影響后續(xù)分析靈敏度。如果選擇較大洗脫體積，通常需要搭配氮吹或者凍干來避免靈敏度降低的問題，但是增加步驟造成整體方法耗時(shí)過長，樣本處理過程繁瑣，增加樣本污染的可能，并且對于大批量樣本的高通量自動(dòng)化檢測，增加步驟需要增加相應(yīng)的自動(dòng)化裝備模塊，導(dǎo)致成本增加。

47、本發(fā)明在第一步洗脫時(shí)用較小的洗脫體積將大部分目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行洗脫收集。在后續(xù)多步洗脫時(shí)，填料上只殘留一些與填料吸附力強(qiáng)，需要大量洗脫體積洗脫的目標(biāo)化合物，采用與第一部洗脫等量或較大洗脫體積并反復(fù)吹吸的方式，將與填料吸附力強(qiáng)，難洗脫的目標(biāo)化合物洗脫收集，從而提高回收的完整性，獲得大部分剩余目標(biāo)化合物。為了避免增大樣本體積導(dǎo)致無法直接進(jìn)行后續(xù)質(zhì)譜分析的問題，本發(fā)明提出只將后續(xù)洗脫液中的部分轉(zhuǎn)移與第一管洗脫液進(jìn)行混合。按照優(yōu)化結(jié)果，本發(fā)明推薦轉(zhuǎn)移0.3~0.8倍v1體積的v2與v1混合，普適性較強(qiáng)。但是根據(jù)樣本處理的需求，也保留了靈活更改的選擇，可以根據(jù)公式v2*(v1/v2*k)計(jì)算轉(zhuǎn)移體積，只要按需對權(quán)重因子k進(jìn)行修改即可，修改范圍可從0.1到1-10。

48、本發(fā)明采用槍頭spe多步洗脫，在保證能質(zhì)譜直接上樣的前提下，用多次洗脫來保證目標(biāo)化合物回收的完整性。

49、本發(fā)明無需額外槍頭和鋼針支持，并且無需額外正壓或者反壓模塊，可以將樣本起始量控制比較低，微量樣本也可檢測，且使用對應(yīng)的較少的處理溶劑，在保證回收率的基礎(chǔ)上高效地實(shí)現(xiàn)樣本處理成本的降低。此外，spe中影響回收率的其中一點(diǎn)是填料的動(dòng)態(tài)吸附和解析量的問題，部分目標(biāo)化合物由于與填料之間存在較大的吸附，洗脫難度大，導(dǎo)致需要更大的洗脫體積才能獲得理想回收，但是過大的體積會增加氮吹等樣品干燥步驟，從而降低整體的樣品處理效率，從另一個(gè)角度增加前處理成本。本發(fā)明洗脫體積小，無需氮吹，但同樣可檢測到難洗脫的目標(biāo)化合物，提高檢出率，增加靈敏度，提高檢測效率的同時(shí)降低了成本。

50、本發(fā)明通過權(quán)重修正因子，對第二管乃至第n管洗脫液，只收集部分洗脫液和第一管洗脫液合并后進(jìn)樣，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，在只收集部分洗脫液的情況下，本發(fā)明既可以實(shí)現(xiàn)直接進(jìn)樣（無需大體積洗脫后的氮吹干燥步驟等），而且盡可能的保證了需要大洗脫體積的難洗脫目標(biāo)物的有效回收，能有效檢出樣本中的所有待測物，特別是難洗脫目標(biāo)物，保證目標(biāo)化合物回收的完整性，減少出現(xiàn)漏檢的情況，有非常大的實(shí)用價(jià)值。

51、另外，本發(fā)明結(jié)合自填柱可以大幅減少進(jìn)樣體積，填料種類和用量可根據(jù)目標(biāo)樣本量進(jìn)行計(jì)算，減少填料用量和進(jìn)樣體積，大大降低運(yùn)行成本。

52、本發(fā)明方法可以結(jié)合自動(dòng)化移液系統(tǒng)，進(jìn)行自動(dòng)化樣本處理凈化，從成本上，自動(dòng)化流程從頭到尾只需要spe槍頭完成所有液體流程，無需額外潔凈槍頭，解決了自動(dòng)化工作中最大的耗材使用問題，使得該方法真正做到樣本處理時(shí)間大大降低，成本大大降低，并且基本無需人工操作。并且自動(dòng)化移液裝置可以高通量同時(shí)進(jìn)行，可采用8~96通道，對大批量樣本的檢測，顯著提高處理效率。