本發(fā)明涉及生物領域，尤其涉及一種梭子蟹肌孢蟲的染色方法，具體來說是一種針對三疣梭子蟹肌肉內(nèi)寄生的梭子蟹肌孢蟲的染色方法。

背景技術：

梭子蟹肌孢蟲是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種感染三疣梭子蟹的微孢子蟲，主要寄生在三疣梭子蟹的肌肉組織，導致肌肉病變呈白化狀。據(jù)調(diào)查了解，該病在我國東部沿海已發(fā)生多年，因病蟹附肢擠出的肌肉類似牙膏，故養(yǎng)殖戶稱其為“牙膏病”。該病流行范圍廣，山東、江蘇、浙江、福建等沿海區(qū)域均有發(fā)現(xiàn)，發(fā)病期一般為7～11月份，9～10月死亡高峰期。梭子蟹肌孢蟲不同于其它類水生寄生蟲，它具有專性細胞內(nèi)寄生的特點，一旦在宿主體內(nèi)形成成熟孢子，一般的外源性藥物很難對其殺滅，養(yǎng)殖中后期梭子蟹因微孢子蟲寄生而全身肌肉白化喪失商品價值，而且臨床癥狀不易被養(yǎng)殖戶發(fā)現(xiàn)，后期大量死亡致使養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖收益受損。梭子蟹肌孢蟲已影響我國三疣梭子蟹的養(yǎng)殖產(chǎn)量。

組織病理學檢查能夠清晰直觀反映出病原侵染的具體部位，確定病原是寄生在細胞外環(huán)境還是細胞內(nèi)，甚至可區(qū)分病原是在細胞核內(nèi)寄生還是在細胞質(zhì)內(nèi)寄生。分子診斷方法雖然近年來急速發(fā)展，并在臨床診斷中廣泛應用，但單純使用分子手段，如pcr方法，僅能確認所采樣組織是否含有病原體，而對病原的寄生狀態(tài)及組織病理變化無法直接體現(xiàn)，使用組織病理學手段，可以彌補單純使用分子檢測方法的不足。染色是組織病理切片制作中至關重要的環(huán)節(jié)，理想和可靠的染發(fā)方法有利于區(qū)分和診斷病原。he染色法是組織病理中最為普用的染色方法，它適用生物種類范圍廣，對多數(shù)器官組織具有較好的染色效果，因此，在病理研究和診斷應用中，它常作為首選染色方法。但該方法也具有局限性，我們對患“牙膏病”蟹的肌肉進行組織病理學研究發(fā)現(xiàn)，在病變肌肉的濕涂片中可以鏡檢到大量的梭子蟹肌孢蟲孢子，而在常規(guī)he染色切片中，卻很難鏡檢到大量的孢子，即使在高倍視野下(1000倍)，孢子著色較淺，與肌肉組織背景顏色對比不明顯，難以區(qū)分。因此，針對三疣梭子蟹“牙膏病”，需要建立一種特殊的染色方法，以將孢子與病變肌肉組織區(qū)分。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種梭子蟹肌孢蟲的染色方法。本發(fā)明是通過以下方案實現(xiàn)的：

一種梭子蟹肌孢蟲的染色方法，包括以下步驟：

s1.取梭子蟹肌肉組織，用davidson’safa固定液固定；

s2.制作組織石蠟包埋塊；然后利用組織切片機制作5um厚切片；

s3.二甲苯脫蠟2次；時間可以為5min/次；

s4.乙醇梯度水化：100％乙醇2-4min，100％乙醇2-4min，95％乙醇2-4min，85％乙醇2-4min，75％乙醇2-4min，50％乙醇2-4min，蒸餾水洗2-4min；所述乙醇濃度均為體積百分比；

s5.weigert氏鐵蘇木素染液染色4-6min，水洗，1％的鹽酸酒精分化，流水沖洗返藍；所述1％的鹽酸酒精是用質(zhì)量分數(shù)為37％的鹽酸與體積分數(shù)為70％的乙醇按體積1:99混合而成；

s6.麗春紅酸性品紅液染色6-8min，水漂洗，磷鉬酸水溶液分化3-5min；

s7.苯胺藍液復染4-6min，體積百分比為1％的冰醋酸水溶液分化1min；

s8.用95％體積百分比的乙醇和100％乙醇分別脫水，二甲苯透明，晾干。

其中，步驟s5中所述weigert氏蘇木素染液包括溶液a和溶液b；染色時，將溶液a和溶液b等體積混合；

所述溶液a的制備方法為將蘇木精按0.8～1.2g:100ml的比例溶解于體積百分比為95％酒精；

所述溶液b的制備方法為取質(zhì)量百分比為29％三氯化鐵溶液加入到蒸餾水中后，再加入濃鹽酸，所述三氯化鐵溶液、蒸餾水和濃鹽酸的體積比為4：95：1；所述濃鹽酸的質(zhì)量百分比為37％。

其中，步驟s6中所述麗春紅酸性品紅染液由麗春紅、酸性品紅、水與冰醋酸按0.7g：0.3g：99ml：1ml配制而成。

其中，步驟s6中所述磷鉬酸水溶液的質(zhì)量百分比為1％。

其中，步驟s7中所述苯胺藍液由苯胺藍、水與冰醋酸按2g：98ml：2ml配制而成。

用本發(fā)明提供的染色方法進行染色后：病變肌肉組織經(jīng)染色后，肌纖維呈藍色條帶狀，梭子蟹肌孢蟲孢子呈紅色卵圓形，形態(tài)結(jié)構清晰，與背景組織對比清晰，易辨別。

附圖說明

圖1為病變肌肉組織he染色，400倍。圖中，1為肌肉，2梭子蟹肌孢蟲。

圖2實施例1中病變肌肉組織染色，400倍。圖中，1為肌肉，2梭子蟹肌孢蟲。

圖3病變肌肉組織he染色，1000倍。圖中，1為肌肉，2梭子蟹肌孢蟲。

圖4實施例1中病變肌肉組織染色，1000倍。圖中，1為肌肉，2梭子蟹肌孢蟲。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步說明：

實施例1

制備95％乙醇：乙醇95ml，蒸餾水5ml。

制備85％乙醇：乙醇85ml，蒸餾水15ml。

制備75％乙醇：乙醇75ml，蒸餾水25ml。

制備50％乙醇：乙醇50ml，蒸餾水50ml。

davidson’safa固定液：冰醋酸57.5ml，甲醛110ml，95％乙醇165ml，過濾海水167.5ml。

制備weigert氏蘇木素染液：溶液a：將1g蘇木精加入100ml95％酒精，溶解。溶液b：取29％三氯化鐵溶液4ml，加入到95ml蒸餾水中，最后加入1ml濃鹽酸。染色時，將溶液a和b等比例混合，兩液不宜預先混合，否則預混液容易氧化而失去染色力。

制備1％的鹽酸酒精：1ml37％鹽酸(質(zhì)量分數(shù))，99ml70％乙醇(體積分數(shù))。

制備麗春紅酸性品紅染液：麗春紅0.7g，酸性品紅0.3g，蒸餾水99ml，冰醋酸1ml。

制備磷鉬酸水溶液：磷鉬酸1g，蒸餾水99g。

制備苯胺藍水溶液：苯胺藍2g，蒸餾水98ml，冰醋酸2ml。

制備1％冰醋酸：冰醋酸1ml，蒸餾水99ml。

染色過程：

1.解剖活體或瀕死“牙膏蟹”，剪取肌肉組織，用davidson’safa固定液固定24h。

2.常規(guī)方法制作組織石蠟包埋塊，然后利用組織切片機制作5um厚切片。

3.二甲苯脫蠟2次，每次5min。

4.乙醇水化：100％乙醇3min，100％乙醇3min，95％乙醇3min，85％乙醇3min，75％乙醇3min，50％乙醇3min，蒸餾水洗3min。

5.weigert氏鐵蘇木素染液染色5min，自來水洗，1％的鹽酸酒精分化數(shù)秒，流水沖洗數(shù)分鐘返藍。

6.麗春紅酸性品紅液染色7min，蒸餾水快速漂洗，磷鉬酸水溶液分化約3-5min，

7.苯胺藍液復染5min，1％冰醋酸分化1min。

8.95％乙醇和100％乙醇脫水，二甲苯透明，晾干后中性樹膠封片。

400倍和1000倍的圖見圖2和圖4所示，其中1為肌肉，2梭子蟹肌孢蟲。實施例1染色結(jié)果可以看出病變肌肉組織經(jīng)染色后，(染色后，1肌纖維呈藍色條帶狀，2梭子蟹肌孢蟲孢子呈紅色卵圓形)形態(tài)結(jié)構清晰，與背景組織對比清晰，易辨別。而he染色效果見圖1和圖3所示，其中1為肌肉，2梭子蟹肌孢蟲。

以上所述為本發(fā)明的較佳實施例而已，但本發(fā)明不應該局限于該實施例所公開的內(nèi)容。所以凡是不脫離本發(fā)明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保護的范圍。