本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，特別是涉及一種用液相色譜法測定磷酸特地唑胺及其異構(gòu)體雜質(zhì)含量的方法。
背景技術(shù)：
：磷酸特地唑胺(tedizolidphosphate，式(i))是由卡畢思特制藥公司(cubistpharmaceuticals)研制的一種噁唑烷酮類抗生素，于2014年6月10日獲得fda批準(zhǔn)上市，商品名為sivextro，用于治療金黃色葡萄球菌和各種鏈球菌屬和糞腸球菌等革蘭氏陽性細(xì)菌引起的急性細(xì)菌性皮膚和皮膚結(jié)構(gòu)感染。磷酸特地唑胺屬于噁唑烷酮類抗生素，與其他類別的抗生素之間不易產(chǎn)生交叉耐藥，同首個噁唑烷酮類抗生素利奈唑胺相比，療效更好、安全性更高。磷酸特地唑胺分子結(jié)構(gòu)中含有1個手性碳原子，存在一對對映異構(gòu)體，其中(r)-構(gòu)型為活性構(gòu)型，而(s)-異構(gòu)體為對映異構(gòu)體雜質(zhì)。在磷酸特地唑胺的分析檢測過程中，二者難以分離、檢測。然而，在藥物定向合成過程以及終產(chǎn)物質(zhì)量控制過程中，均需要控制對映異構(gòu)體雜質(zhì)的含量。因此，建立靈敏度高、專屬性好的手性分析方法，實現(xiàn)磷酸特地唑胺與其對映異構(gòu)體的分析測定，在磷酸特地唑胺的合成和制劑的制備過程中對控制藥品質(zhì)量具有重要意義。目前，磷酸特地唑胺的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在現(xiàn)行版《歐洲藥典》及其藥典論壇、《美國藥典》及其藥典論壇和中國藥典2015版中均沒有收載。現(xiàn)有技術(shù)中，“infrared,ramanandultravioletwithcirculardichroismanalysisandtheoreticalcalculationsoftedizolid”，katarzynamichalska，等，journalofmolecularstructure1115，2016，136-143公開了在紫外-圓二色譜的基礎(chǔ)上結(jié)合ft-ir以及拉曼光譜測定特地唑胺的對映體純度的方法。此外，cn105085570a公開了一種以十八烷基硅烷鍵合硅膠填充色譜柱(xb-c18，4.6×300nm，5μm)、0.025mol/l碳酸氫銨溶液-乙腈(95:5)和乙腈為流動相、梯度洗脫的方式分離樣品中的磷酸特地唑胺及其光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)的方法，然而結(jié)果表明峰拖尾情況較為嚴(yán)重(磷酸特地唑胺峰的拖尾因子為1.567)，不利于準(zhǔn)確定量?？梢?，上述方法或者需要用到價格昂貴的儀器，或者分離狀況不理想，均無法滿足目前對磷酸特地唑胺中的異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行有效、準(zhǔn)確定量的需求。因此，開發(fā)新的能有效檢測磷酸特地唑胺及其異構(gòu)體雜質(zhì)含量的方法是非常必要的。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種用手性色譜柱分析測定磷酸特地唑胺及其光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)含量的液相色譜方法，其可以將磷酸特地唑胺與其光學(xué)異構(gòu)體進(jìn)行有效分離，從而可以準(zhǔn)確控制磷酸特地唑胺的質(zhì)量，實現(xiàn)磷酸特地唑胺與其光學(xué)異構(gòu)體的分離測定。磷酸特地唑胺及其異構(gòu)體雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)如下：本發(fā)明所述液相色譜方法分析測定磷酸特地唑胺及其光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)含量的方法，其特征在于，首先采用堿性磷酸酶溶液對磷酸特地唑胺進(jìn)行酶水解，使得磷酸特地唑胺及其異構(gòu)體雜質(zhì)tdpen被水解為相應(yīng)的醇產(chǎn)物(ina或inaen)，反應(yīng)式如下：然后，經(jīng)簡單處理(萃取、干燥)后，再以三(3,5-二甲苯基)-氨基甲酸酯直鏈淀粉為填料的手性色譜柱，以正己烷-無水乙醇混合溶液為流動相進(jìn)行液相色譜分析。術(shù)語定義術(shù)語“峰純度”是指hplc檢測中，用于判斷某一色譜峰是否只是由一種物質(zhì)引起的一個考察參數(shù)，一般認(rèn)為峰純度在0.990-1.000之間即認(rèn)為所考察的某一色譜峰純凈，該色譜峰是某單一物質(zhì)的色譜峰；術(shù)語“rt”是指hplc檢測中的色譜峰的保留時間，單位是分鐘(min)；術(shù)語“約”在本發(fā)明中是指在所述數(shù)值的±10％以內(nèi)；術(shù)語“50％乙醇”是指流動相中乙醇的體積百分比為50％，即100ml流動相中含有50ml的乙醇。本發(fā)明所述的方法，所述酶水解反應(yīng)的溫度為35～39℃，優(yōu)選為約37℃；酶水解反應(yīng)的時間為1.5～2.5h，優(yōu)選為約2.0h。所述酶水解反應(yīng)的ph范圍為ph8.8～ph9.2，優(yōu)選為約ph9.0；所加入的磷酸酶與反應(yīng)底物的質(zhì)量比為(3.6～4.4)：(8～12)。本發(fā)明所述的方法，所述堿性磷酸酶溶液的制備方法為：稱取堿性磷酸酶適量，加ph緩沖溶液溶解，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為2mg/ml的溶液，優(yōu)選臨用新制。進(jìn)一步地，所述ph緩沖溶液的制備方法為：稱取硼酸適量，加水溶解，加入適量1mol/lnaoh溶液和0.1mol/lmgcl2溶液，然后加水稀釋搖勻，即得。所述液相色譜法包括高效液相色譜法或高效液相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用。所述手性色譜柱選自牌號為chiralpakad和chiralpakad-h的色譜柱，優(yōu)選chiralpakad-h，250mm×4.6mm，5μm。本發(fā)明所述的方法，其流動相中正己烷與無水乙醇的體積比為40:60～60:40，優(yōu)選為44:56～50:50。上述流動相中，所述正己烷-無水乙醇溶液還包含選自甲酸、乙酸、三氟乙酸中的一種或多種酸，且其占正己烷-無水乙醇溶液的體積比為0.05％～0.15％，優(yōu)選占比0.1％，進(jìn)一步地，所述酸優(yōu)選為三氟乙酸。進(jìn)一步地，所述流動相為正己烷：無水乙醇：三氟乙酸的體積比更優(yōu)選為約47:53:0.1。本發(fā)明所述的方法，檢測波長為300±2nm。本發(fā)明所述的方法，其流動相流速常見的范圍一般為0.5ml/min～2ml/min，本發(fā)明優(yōu)選0.5～1.0ml/min，更優(yōu)選0.7ml/min。本發(fā)明所述的檢測方法，色譜柱溫度為35～45℃，優(yōu)選為40℃；樣品進(jìn)樣量10～30μl。本發(fā)明所述異構(gòu)體含量測定方法，可按以下方法實現(xiàn)：1)取磷酸特地唑胺或含磷酸特地唑胺的制劑適量，用堿性磷酸酶溶液水解，反應(yīng)后加乙腈溶解稀釋，分離有機層，干燥后用無水乙醇溶解稀釋；2)將步驟1)所得溶液注入液相色譜儀，完成磷酸特地唑胺與其對映異構(gòu)體的分離測定。其中：液相色譜儀：島津2010高效液相色譜儀或agilent1100高效液相色譜儀；色譜柱：大賽路chirapakad-h手性色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：正己烷-無水乙醇-三氟乙酸(47：53：0.1)；檢測波長：300nm；柱溫：40℃；流速：0.7ml/min；進(jìn)樣體積：10μl。所述的分離測定方法，按照高效液相色譜法(中國藥典2010年版二部附錄ⅴd)測定。本發(fā)明采用堿性磷酸酶溶液先對磷酸特地唑胺樣品進(jìn)行酶水解，然后對獲得的醇產(chǎn)物(ina與inaen)進(jìn)行色譜分離，采用chiralpakad-h手性色譜柱能夠有效分離測定ina與其光學(xué)異構(gòu)體inaen，選用進(jìn)樣體積為10μl，柱溫為40℃，提高了色譜峰的對稱性。本發(fā)明解決了分離測定磷酸特地唑胺及其對映體雜質(zhì)的測定問題，能簡單、快速、準(zhǔn)確地分離、檢測出磷酸特地唑胺及其光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)，從而保證了磷酸特地唑胺及其制劑的質(zhì)量可控。附圖說明圖1為磷酸特地唑胺對照品于0.5h酶水解后的hplc分析圖。圖2為磷酸特地唑胺對照品于1.0h酶水解后的hplc分析圖。圖3為磷酸特地唑胺對照品于1.5h酶水解后的hplc分析圖。圖4為磷酸特地唑胺對照品于2.0h酶水解后的hplc分析圖。圖5為tdpen對照品于0.5h酶水解后的hplc分析圖。圖6為tdpen對照品于1.0h酶水解后的hplc分析圖。圖7為tdpen對照品于1.5h酶水解后的hplc分析圖。圖8為tdpen對照品于2.0h酶水解后的hplc分析圖。圖9為磷酸特地唑胺精制品在酶水解后的hplc分析圖。圖10為不經(jīng)磷酸酶水解下的tdp及tdpen混合溶液的hplc分析圖。具體實施方式以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。本發(fā)明的實施例僅是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，因此在本發(fā)明的方法基礎(chǔ)上對本發(fā)明的簡單改進(jìn)或替換均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。本發(fā)明具體實施方式中使用的原料、試劑、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過購買市售產(chǎn)品、自制或者按照本發(fā)明所描述的方法制備而得。例如，以下實施例中磷酸特地唑胺與其對映異構(gòu)體對照品、ina與inaen對照品以及磷酸特地唑胺精制品均為自制品，且其中磷酸特地唑胺對照品和精制品中的ina和inaen均低于檢測限。本發(fā)明所使用的分析試劑及溶液符合中國藥典2010版附錄的要求，除另有說明外。實施例一采用磷酸酶水解法的磷酸特地唑胺及其異構(gòu)體的高效液相色譜分析1、磷酸酶水解條件的選擇溶液配制：ph9.0緩沖溶液：精密稱取硼酸3.1g，置1l容量瓶中，加500ml水溶解，精密加入21ml1mol/lnaoh溶液和10ml0.1mol/lmgcl2溶液，加水稀釋至刻度，搖勻，作為ph9.0緩沖溶液。堿性磷酸酶溶液(臨用新制)：精密稱取堿性磷酸酶100mg，置50ml量瓶，加ph9.0緩沖溶液溶解，并定容至刻度，搖勻，作為堿性磷酸酶溶液。取磷酸特地唑胺(tdp)和其異構(gòu)體tdpen對照品各約10mg，精密稱定，分別置10ml量瓶中，加2ml堿性磷酸酶溶液，37℃水浴，強力震搖，分別于0.5h、1h、1.5h、2h取樣品50μl，用乙腈定容至1ml，采用以下色譜分析條件檢測tdp和tdpen分別水解為ina和inaen(即ina的對映異構(gòu)體)的情況(面積歸一化)。結(jié)果見表1和說明書附圖圖1-圖8。色譜分析條件——高效液相色譜儀為島津2010或agilent1100；色譜柱為watersxterrac18(150*4.6mm,3.5μm)；用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；檢測器為uv檢測器，檢測波長為300nm；以25mmol/l醋酸氨(用氨水調(diào)ph至8.5)為流動相a，以乙腈:四氫呋喃(90：10)為流動相b，流速為1.0ml/min；柱溫為40℃；理論板數(shù)按磷酸特地唑胺或其異構(gòu)體峰計算不低于3000；按下表進(jìn)行梯度洗脫：時間(min)流動相a(％)流動相b(％)09913053474053474299152991表1磷酸特地唑胺及其異構(gòu)體在磷酸酶作用下的水解情況結(jié)果表明，tdp和tdpen在該條件下均可以被磷酸酶水解，生成ina和inaen；而且1.5h后水解情況基本穩(wěn)定，2h時ina和inaen的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了98.5％以上，因此該水解條件可用于將tdp轉(zhuǎn)化為ina來進(jìn)行異構(gòu)體測定。2、磷酸特地唑胺及其異構(gòu)體的分離取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加2ml上述堿性磷酸酶溶液(臨用新制)，37℃水浴，強力震搖2h，加乙腈溶解稀釋至刻度，搖勻，靜置；精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加無水硫酸鈉0.5g，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液。另分別取inaen、ina對照品適量，加乙腈適量溶解，并用無水乙醇定量稀釋制成每1ml中含inaen為2μg、ina為200μg的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。按照高效液相色譜法(中國藥典2010年版二部附錄ⅴd)試驗，用大賽路chirapakad-h手性色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；以正己烷-無水乙醇-三氟乙酸(47：53：0.1)為流動相；檢測器為uv檢測器，檢測波長為300nm；柱溫為40℃，流速為0.7ml/min。理論板數(shù)按ina峰計算不低于3000。精密量取系統(tǒng)適用性溶液10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，出峰順序依次為雜質(zhì)inaen和ina。精密量取供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液中如有與inaen出峰時間相同雜質(zhì)峰，按面積歸一化法計算。結(jié)果見表2和說明書附圖圖9。表2磷酸特地唑胺精制品在酶水解后的hplc分離情況結(jié)論：該色譜條件下，空白干凈，混合溶液中ina和inaen的分離度為4.8，理論板數(shù)較高，因此上述條件可用于磷酸特地唑胺的異構(gòu)體雜質(zhì)控制。對比例一不經(jīng)磷酸酶水解下的磷酸特地唑胺及其異構(gòu)體的高效液相色譜分析分別取tdpen和tdp對照品適量，加正己烷：無水乙醇：三氟乙酸(50:50:0.1)溶解并稀釋制成濃度為每1ml中200μg的溶液，作為各自的定位溶液；然后取tdp和tdpen的定位溶液，等量混合，搖勻，得混合溶液。按照實施例一中的色譜條件[即色譜柱：大賽璐ad-h(250×4.6mm,5μm)；流動相：正己烷:無水乙醇:三氟乙酸(47:53:0.1)；檢測波長：300nm；流速：0.7ml/min；柱溫：40℃]，精密量取上述混合溶液10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表3和說明書附圖圖10。表3不經(jīng)磷酸酶水解下的磷酸特地唑胺及其異構(gòu)體雜質(zhì)的分離情況樣品rt(min)理論板數(shù)分離度tdp8.4205830.0tdpen10.9547011.7試驗結(jié)果顯示，tdp與tdpen分離度合格，但峰拖尾極其嚴(yán)重，且峰形難看，降低了分離質(zhì)量和精度。實施例二磷酸酶水解法分離磷酸特地唑胺及其異構(gòu)體雜質(zhì)的方法學(xué)考察參照中國藥典2010版附錄ⅹⅸa藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則，對磷酸特地唑胺異構(gòu)體測定方法進(jìn)行驗證，具體內(nèi)容如下。1、系統(tǒng)適用性考察混合溶液的配制：取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，精密量加入tdpen溶液(取tdpen約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，加緩沖液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得)100μl，加堿性磷酸酶溶液(取堿性磷酸酶適量，加緩沖液溶解并定量稀釋制成濃度為每1ml含堿性磷酸酶2mg的溶液，搖勻，即得)(臨用新制)2ml，37℃水浴中強力振搖2h，加乙腈溶解并稀釋至刻度，靜置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g無水硫酸鈉，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，作為系統(tǒng)適用性溶液。精密量取上述混合溶液各10μl，注入液相色譜儀，進(jìn)樣6次，記錄色譜圖；考察保留時間及峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4-表5。表4異構(gòu)體系統(tǒng)適用性樣品rt(min)分離度理論板數(shù)inaen26.9080.07043ina33.9504.86967表5異構(gòu)體系統(tǒng)適用性-系統(tǒng)精密度結(jié)論：在該色譜條件下，混合溶液中ina和inaen的分離度為4.8，理論板數(shù)較高；混合溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，inaen和ina的峰面積和保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0％，符合規(guī)定，表明該系統(tǒng)穩(wěn)定。2、重復(fù)性供試品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，精密量加入tdpen溶液100μl，加堿性磷酸酶溶液2ml，37℃水浴中強力振搖2h，加乙腈溶解并稀釋至刻度，靜置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g無水硫酸鈉，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得(平行配制6份)。精密量取供試品溶液和對照溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；考察tdpen回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表6。表6異構(gòu)體方法學(xué)-重復(fù)性結(jié)論：平行六份樣品，其tdpen含量回收率結(jié)果為105.4％，rsd值為1.61％，表明方法重復(fù)性良好。3、準(zhǔn)確度供試品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，加堿性磷酸酶溶液2ml，37℃水浴中強力振搖2h，加乙腈溶解并稀釋至刻度，靜置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g無水硫酸鈉，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得(平行配制2份)。20％供試品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，精密量加入tdpen溶液20μl，加堿性磷酸酶溶液2ml，37℃水浴中強力振搖2h，加乙腈溶解并稀釋至刻度，靜置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g無水硫酸鈉，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得(平行配制3份)。50％供試品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，精密量加入tdpen溶液50μl，加堿性磷酸酶溶液2ml，37℃水浴中強力振搖2h，加乙腈溶解并稀釋至刻度，靜置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g無水硫酸鈉，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得(平行配制3份)。100％供試品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，精密量加入tdpen溶液100μl，加堿性磷酸酶溶液2ml，37℃水浴中強力振搖2h，加乙腈溶解并稀釋至刻度，靜置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g無水硫酸鈉，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得(平行配制3份)。150％供試品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，精密量加入tdpen溶液150μl，加堿性磷酸酶溶液2ml，37℃水浴中強力振搖2h，加乙腈溶解并稀釋至刻度，靜置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g無水硫酸鈉，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得(平行配制3份)。精密量取上述供試品溶液和對照溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；考察tdpen回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表7。表7異構(gòu)體方法學(xué)-準(zhǔn)確度結(jié)論：從試驗結(jié)果可知，其inaen在20％～150％范圍內(nèi)，回收率良好，其平均回收率為103.3％，rsd值為3.14％，表明方法準(zhǔn)確度良好。4、溶液穩(wěn)定性供試品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，精密量加入tdpen溶液100μl，加堿性磷酸酶溶液2ml，37℃水浴中強力振搖2h，加乙腈溶解并稀釋至刻度，靜置。精密量取上清液2.5ml，置10ml量瓶中，加0.5g無水硫酸鈉，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。將供試品溶液在室溫放置24小時，分別于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h進(jìn)樣，記錄色譜圖；考察tdpen和tdp的峰面積變化。結(jié)果見表8。表8異構(gòu)體方法學(xué)-溶液穩(wěn)定性結(jié)論：從數(shù)據(jù)結(jié)果上可看出，本品溶液室溫放置24小時，tdp和tdpen峰面積幾乎沒有變化，表明溶液在24h穩(wěn)定。5、耐用性磷酸特地唑胺耐用性考察主要針對磷酸酶水解條件中反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、反應(yīng)ph、磷酸酶量和樣品量及色譜條件中柱溫、流動相比例進(jìn)行試驗。具體方法如下：5.1酶反應(yīng)溫度考察不同酶反應(yīng)溫度(37±2℃)對磷酸特地唑胺異構(gòu)體測定的影響，具體試驗如下：供試品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，精密量加入tdpen溶液100μl，加堿性磷酸酶溶液2ml，分別于35℃、37℃、39℃水浴中強力振搖2h，照重復(fù)性項下同法配制(平行配制2份)。精密量取供試品溶液和對照溶液各10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表9。表9異構(gòu)體方法學(xué)耐用性-不同酶反應(yīng)溫度結(jié)論：經(jīng)試驗，在不同酶反應(yīng)溫度37±2℃進(jìn)行水解，tdpen回收率基本一致，表明酶反應(yīng)溫度在35～39℃下耐用性好。5.2酶反應(yīng)時間考察不同酶反應(yīng)時間對本品異構(gòu)體測定的影響，具體試驗如下：供試品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，精密量加入tdpen溶液100μl，加堿性磷酸酶溶液2ml，分別于37℃水浴中強力振搖1.5h、2.0h、2.5h，照重復(fù)性試驗同法配制(平行配制2份)。精密量取供試品溶液和對照溶液各10μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表10。表10異構(gòu)體方法學(xué)耐用性-不同酶反應(yīng)時間結(jié)論：經(jīng)試驗，在不同酶反應(yīng)時間2.0±0.5h進(jìn)行水解，tdpen回收率基本一致，表明酶反應(yīng)時間在1.5～2.5h下耐用性好。5.3酶反應(yīng)ph考察不同酶反應(yīng)ph對本品異構(gòu)體測定的影響，具體試驗如下：不同ph緩沖液的配制：ph9.0緩沖液：取3.1g硼酸至1000ml容量瓶中，加500ml水溶解，再加1mol/l氫氧化鈉溶液21ml，再加0.1mol/l氯化鎂溶液10ml，定容，搖勻。ph8.8緩沖液：取ph9.0的緩沖液適量，加硼酸溶液(取0.3g硼酸至100ml容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻)調(diào)節(jié)ph至8.8。ph9.2緩沖液：取ph9.0的緩沖液適量，加1mol/l氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至9.2，搖勻。堿性磷酸酶溶液配制：取堿性磷酸酶適量，分別加ph8.8、9.0、9.2緩沖液溶解并定量稀釋制成濃度為每1ml含堿性磷酸酶2mg的溶液，搖勻，即得(臨用新制)。供試品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，精密量加入tdpen溶液100μl，分別加入ph為8.8、9.0、9.2堿性磷酸酶溶液2ml，于37℃水浴中強力振搖2.0h，照重復(fù)性項下同法配制(平行配制2份)。精密量取供試品溶液和對照溶液各10μl注入液相色譜儀，結(jié)果見表11。表11異構(gòu)體方法學(xué)耐用性-不同酶反應(yīng)ph結(jié)論：經(jīng)試驗，酶反應(yīng)ph在9.0±0.2下進(jìn)行水解，tdpen回收率基本一致，表明酶反應(yīng)ph在8.8～9.2下耐用性好。5.4磷酸酶量考察不同酶濃度對本品異構(gòu)體測定的影響，具體試驗如下：供試品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，精密量加入tdpen溶液100μl，分別加入堿性磷酸酶溶液1.8ml、2.0ml、2.2ml，于37℃水浴中強力振搖2.0h，照重復(fù)性項下同法配制(平行配制2份)。精密量取供試品溶液和對照溶液各10μl注入液相色譜儀，結(jié)果見表12。表12異構(gòu)體方法學(xué)耐用性-不同磷酸酶量結(jié)論：經(jīng)試驗，酶反應(yīng)量在2.0±0.2ml下進(jìn)行水解，tdpen回收率基本一致，表明酶反應(yīng)量在1.8～2.2ml下耐用性好。5.5反應(yīng)底物量考察不同樣品量對磷酸特地唑胺異構(gòu)體測定的影響，具體試驗如下：供試品溶液配制：分別取磷酸特地唑胺精制品約8、10、12mg，精密稱定，置10ml量瓶，分別精密加入tdpen溶液80、100、120μl，加入堿性磷酸酶溶液2.0ml，于37℃水浴中強力振搖2.0h，照重復(fù)性項下同法配制(平行配制2份)。精密量取供試品溶液和對照溶液各10μl注入液相色譜儀，結(jié)果見表13。表13異構(gòu)體方法學(xué)耐用性-不同反應(yīng)底物量結(jié)論：經(jīng)試驗，反應(yīng)底物在10±2mg下進(jìn)行水解，tdpen回收率基本一致，表明酶反應(yīng)中底物量在8～12mg下耐用性好。5.6柱溫考察不同柱溫對磷酸特地唑胺異構(gòu)體測定的影響，具體試驗如下：供試品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，精密量加入tdpen溶液100μl，加堿性磷酸酶溶液2ml，于37℃水浴中強力振搖2h，照重復(fù)性項下同法配制(平行配制2份)。分別調(diào)節(jié)不同的柱溫(40±5℃)，精密量取供試品溶液和對照溶液各10μl注入液相色譜儀，結(jié)果見表14-表15。表14異構(gòu)體方法學(xué)耐用性-不同柱溫分離度考察表15異構(gòu)體方法學(xué)耐用性-不同柱溫結(jié)論：經(jīng)試驗，采用不同柱溫進(jìn)行考察，除保留時間略有差異外，分離度和理論板數(shù)均符合規(guī)定，tdpen回收率基本一致。系統(tǒng)適用性溶液結(jié)果顯示柱溫在35～45℃范圍內(nèi)變化時，耐用性良好。5.7流動相比例考察不同比例對本品異構(gòu)體測定的影響，具體試驗如下：供試品溶液配制：取磷酸特地唑胺精制品約10mg，精密稱定，置10ml量瓶，精密量加入tdpen溶液100μl，加堿性磷酸酶溶液2ml，于37℃水浴中強力振搖2h，照重復(fù)性項下同法配制(平行配制2份)。分別調(diào)節(jié)不同流動相比例(乙醇比例為：50％、53％、56％)，精密量取供試品溶液和對照溶液各10μl注入液相色譜儀，結(jié)果見表16-表17。表16異構(gòu)體方法學(xué)耐用性-不同比例分離度考察表17異構(gòu)體方法學(xué)耐用性-不同比例結(jié)論：經(jīng)試驗，采用不同流動相比例進(jìn)行考察，除保留時間略有差異外，分離度和理論板數(shù)均符合規(guī)定，tdpen回收率基本一致。系統(tǒng)適用性溶液結(jié)果顯示流動相中乙醇比例在50～56％范圍內(nèi)變化時，耐用性良好。綜上所述，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，在采用堿性磷酸酶對磷酸特地唑胺樣品進(jìn)行酶水解后，以三(3,5-二甲苯基)-氨基甲酸酯直鏈淀粉填料手性柱為固定相，加入特定比例的流動相，可以有效分離檢測磷酸特地唑胺樣品中的對映異構(gòu)體含量，且耐用性良好，可以快速、準(zhǔn)確、靈敏地分離和分析其中對應(yīng)異構(gòu)體雜質(zhì)的含量，從而有效控制磷酸特地唑胺及其制劑的質(zhì)量。當(dāng)前第1頁12