本發(fā)明涉及多肽疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多肽疫苗的篩選評估方法。
背景技術(shù)：
多肽疫苗的研發(fā)是目前病毒疫苗研發(fā)中的一個重要組成部分，在疫苗的研究中，多肽疫苗具有免疫應(yīng)答能力、安全、反應(yīng)原性低等優(yōu)勢，是新一代疫苗研究的熱點之一。
ev71病毒是導(dǎo)致重癥手足口病的重要病毒之一，目前多以小鼠和兔等實驗動物進行ev71中和抗原表位肽的研究。然而，由于動物與人的免疫系統(tǒng)的差異，基于動物實驗的ev71中和表位和多肽疫苗的研究，其結(jié)果不能等同于人類對于相同多肽疫苗的反應(yīng)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種多肽疫苗的篩選評估方法，用于篩選經(jīng)動物實驗驗證的具有中和效果的中和抗原表位或多肽在用于人體前的評估工作。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種多肽疫苗的篩選評估方法，包括如下步驟：
（1）多肽序列的選擇：選擇病原體中和抗原表位多肽序列作為多肽疫苗的序列；
（2）中和抗原表位多肽的合成：將選定的中和抗原表位進行多肽合成，封閉活性基團；
（3）多肽與偶聯(lián)載體偶聯(lián)：將多肽與偶聯(lián)載體進行偶聯(lián)，洗脫未偶聯(lián)的多肽，封閉未偶聯(lián)的偶聯(lián)載體，清洗待用；
（4）親和層析：將偶聯(lián)多肽后的偶聯(lián)載體裝填至蛋白質(zhì)純化柱，加入抗體樣本，洗脫并收集中和抗體；
（5）中和抗體分析：通過體外微量中和試驗的方法，分析捕獲的中和抗體的中和滴度。
本發(fā)明通過對ev71病毒中和抗原表位sp55、sp70和vp2-28分別通過小鼠和兔作為實驗動物進行研究，具有較好的中和效果。將其作為ev71多肽疫苗的備選序列。
sp55：pesreslawqtatnpc
sp70：yptfgehkqekdleyc
vp2-28：aggtgtedshppykq。
本發(fā)明的實驗動物不僅限于小鼠和兔體內(nèi)驗證有效的中和抗原表位，還包括其他動物，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
優(yōu)選的，所述步驟（1）具體為：選擇ev71病毒c4流行株中和抗原表位sp55、sp70和vp2-28多肽序列作為多肽疫苗的序列。本發(fā)明選用的病原體不僅限于ev71病毒，還可以為其他病原體（如病毒、細菌、支原體、衣原體和寄生蟲等），還包括臨床各類疾病等的疫苗研發(fā)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
更為優(yōu)選的，所述步驟（1）中，ev71病毒c4流行株中和抗原表位sp55、sp70和vp2-28多肽序列分別為：
sp55：pdsreslawqtatnp
sp70：yptfgehkqekdley
vp2-28：aggtgtedthppykq。
本發(fā)明的多肽序列不僅限于上述三條，還可以為很多條，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
所述步驟（2）具體為：將選定的中和抗原表位采用化學(xué)方法進行多肽合成，封閉巰基等活性基團。
本發(fā)明的多肽合成方法不僅限于化學(xué)方法，還可以采用其它多肽合成方法，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
優(yōu)選的，所述步驟（3）包括如下步驟：
（3.1）偶聯(lián)載體預(yù)處理：選擇瓊脂糖珠作為偶聯(lián)載體，加入雙蒸水進行膨脹，再加入雙蒸水進行洗滌；
（3.2）偶聯(lián)配基：
（3.2.1）配基溶解：將多肽用質(zhì)量分數(shù)為25%、ph為9.0的二甲基甲酰胺溶解；
（3.2.2）偶聯(lián)：將預(yù)處理后的瓊脂糖珠和溶解后的多肽按體積比0.8-1.2:1的比例混合，在20-40℃溫度下孵育14-18h；
（3.2.3）洗脫：用質(zhì)量分數(shù)為25%、ph為9.0的二甲基甲酰胺洗脫未偶聯(lián)的多肽；
（3.2.4）封閉：在20-40℃溫度下，將洗脫后的瓊脂糖珠靜置于0.8-1.2mol/l的乙醇胺中3-5h，封閉未偶聯(lián)的偶聯(lián)載體；
（3.2.5）清洗：用摩爾濃度為0.1mol/l、ph為4.0的醋酸鹽緩沖液加0.4-0.6mol/l的nacl溶液和ph為8.0的tris-hcl緩沖液加摩爾濃度為0.4-0.6mol/l的nacl溶液循環(huán)清洗瓊脂糖珠。
本發(fā)明采用的偶聯(lián)載體不僅限于瓊脂糖珠，只要帶有偶聯(lián)基團的載體均可，如磁珠或其它微球等，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
優(yōu)選的，所述步驟（4）包括如下步驟：
（4.1）結(jié)合：將偶聯(lián)多肽后的偶聯(lián)載體裝填至蛋白質(zhì)純化柱，以丙種球蛋白作為抗體樣本，加入純化柱中，加入ph為7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌；
（4.2）洗脫：用摩爾濃度為0.1mol/l、ph為4.0的檸檬酸緩沖液洗脫抗體，于收集管中加入0.4-0.6gtris固體試劑；
（4.3）收集：重復(fù)步驟（4.1）和步驟（4.2），直至收集足夠量的抗體；
（4.4）平衡：用10k的蛋白超濾管加入13-17mlpbs平衡，在4500-5500rpm轉(zhuǎn)速下離心25-35min，棄掉廢液；
（4.5）濃縮去鹽：將步驟（4.3）收集的抗體加入蛋白超濾管中，在4500-5500rpm轉(zhuǎn)速下離心25-35min，收集超濾膜上方液體為濃縮去鹽抗體；重復(fù)該步驟，直至全部抗體濃縮去鹽。
本發(fā)明采用的抗體樣本不僅限于人丙種球蛋白，還包括各類血液制品以及患者的血液類樣本，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
優(yōu)選的，所述步驟（4.5）之后還包括步驟（4.6）保存：短時間內(nèi)用不完的抗體加入無菌甘油至質(zhì)量分數(shù)為45%-55%，于-15～-25℃溫度下保存。
優(yōu)選的，所述步驟（5）包括如下步驟：
（5.1）病毒tcid50的計算：將vero細胞接種至96孔板，然后接種ev71病毒，接種7天后觀察細胞病變情況，計算ev71病毒的tcid50；
（5.2）體外微量中和實驗通過體外微量中和試驗的方法，分析捕獲的中和抗體的中和滴度。
優(yōu)選的，所述步驟（5.1）包括如下步驟：
（5.1.1）接種細胞：將含有fbs的dmem培養(yǎng)基的vero細胞，用pbs洗三遍，再用2-4ml質(zhì)量分數(shù)為0.2%-0.3%的胰酶消化1.5-2.5min，加入2-4ml含有fbs的dmem培養(yǎng)基，吹打制成單細胞懸液，800-1200rpm轉(zhuǎn)速下離心4-6min，棄掉上清，加入含有fbs的dmem培養(yǎng)基，吹打制成單細胞懸液，并用細胞計數(shù)板計數(shù)；
用含有fbs的dmem培養(yǎng)基將細胞稀釋成1.5×104-2.5×104個細胞/100μl，并接種至96孔板，過夜培養(yǎng)；
（5.1.2）接種病毒：將培養(yǎng)的ev71病毒經(jīng)過0.20-0.25μm濾膜過濾，用含有fbs的dmem培養(yǎng)基將ev71病毒按照10-1~10-15梯度稀釋；
將ev71病毒接種至步驟（5.1.1）中的96孔板，每孔接種100μl，每個梯度接種10個孔；
（5.1.3）計算：病毒接種7天后觀察細胞病變情況，計算ev71病毒tcid50；
所述含有fbs的dmem培養(yǎng)基中，fbs的質(zhì)量分數(shù)為1.5%-2.5%。
優(yōu)選的，所述步驟（5.2）包括如下步驟：
（5.2.1）將vero細胞按每孔1.5×104-2.5×104個細胞/100μl接種到96孔板，生長過夜；
（5.2.2）用含有fbs的dmem培養(yǎng)基稀釋病毒至tcid50為100，取新96孔板，每孔加入ev71病毒50μl；
（5.2.3）用含有fbs的dmem培養(yǎng)基按倍比稀釋濃縮去鹽抗體，將不同稀釋比例的抗體按50μl/孔加入步驟（5.2.2）的96孔板中，輕搖混勻，36-37℃溫度下孵育0.5-1.5h；
（5.2.4）將步驟（5.2.2）的96孔板中的液體加入步驟（5.2.1）的96孔板中，每個樣本設(shè)平行孔3個，在co2濃度為4%-6%、36-37℃溫度下培養(yǎng)2-4d，完全抑制致細胞病變效應(yīng)出現(xiàn)的最高血清稀釋度作為血清的中和滴度；
（5.2.5）分析單個中和抗原表位多肽結(jié)合抗體的中和滴度，并作為評價該中和抗原表位多肽在人體免疫反應(yīng)中的效果；
所述含有fbs的dmem培養(yǎng)基中，fbs的質(zhì)量分數(shù)為1.5%-2.5%。
優(yōu)選的，所述步驟（5）之后還包括步驟（6）組合分析：將捕獲的中和抗體兩兩組合以及三個組合，通過體外微量中和試驗的方法，分析不同組合的中和抗體的中和滴度。
本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明涉及一種前期已在動物試驗中證實具有中和效果的抗原表位肽，評估其是否適合用于人體的多肽疫苗的篩選評估方法。本發(fā)明的篩選評估方法將大大提高多肽疫苗的研發(fā)效率，降低研發(fā)成本，還可以為科研學(xué)術(shù)提供理論依據(jù)。
本發(fā)明的驗證方法用于篩選經(jīng)動物實驗驗證的具有中和效果的中和抗原表位或多肽在用于人體前的評估工作。一方面預(yù)測該中和抗原表位或多肽其免疫人體后產(chǎn)生中和抗體的情況，分析人體和動物免疫差異。另一方面又可以將無法引起免疫反應(yīng)的中和抗原表位肽或多肽疫苗去掉，從而大大的減少研發(fā)費用，同時亦為后續(xù)臨床試驗提供寶貴數(shù)據(jù)。
具體實施方式
為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，實施方式提及的內(nèi)容并非對本發(fā)明的限定。
實施例1
一種多肽疫苗的篩選評估方法，包括如下步驟：
（1）多肽序列的選擇：選擇病原體中和抗原表位多肽序列作為多肽疫苗的序列；
（2）中和抗原表位多肽的合成：將選定的中和抗原表位采用化學(xué)方法進行多肽合成，封閉巰基等活性基團；
（3）多肽與偶聯(lián)載體偶聯(lián)：將多肽與偶聯(lián)載體進行偶聯(lián)，洗脫未偶聯(lián)的多肽，封閉未偶聯(lián)的偶聯(lián)載體，清洗待用；
（4）親和層析：將偶聯(lián)多肽后的偶聯(lián)載體裝填至蛋白質(zhì)純化柱，加入抗體樣本，洗脫并收集中和抗體；
（5）中和抗體分析：通過體外微量中和試驗的方法，分析捕獲的中和抗體的中和滴度。
所述步驟（1）具體為：選擇ev71病毒c4流行株中和抗原表位sp55、sp70和vp2-28多肽序列作為多肽疫苗的序列。
所述步驟（1）中，ev71病毒c4流行株中和抗原表位sp55、sp70和vp2-28多肽序列分別為：
sp55：pdsreslawqtatnp
sp70：yptfgehkqekdley
vp2-28：aggtgtedthppykq。
所述步驟（3）包括如下步驟：
（3.1）偶聯(lián)載體預(yù)處理：選擇瓊脂糖珠作為偶聯(lián)載體，加入雙蒸水進行膨脹，再加入雙蒸水進行洗滌；
（3.2）偶聯(lián)配基：
（3.2.1）配基溶解：將多肽用質(zhì)量分數(shù)為25%、ph為9.0的二甲基甲酰胺溶解；
（3.2.2）偶聯(lián)：將預(yù)處理后的瓊脂糖珠和溶解后的多肽按體積比0.8:1的比例混合，在20℃溫度下孵育18h；
（3.2.3）洗脫：用質(zhì)量分數(shù)為25%、ph為9.0的二甲基甲酰胺洗脫未偶聯(lián)的多肽；
（3.2.4）封閉：在20℃溫度下，將洗脫后的瓊脂糖珠靜置于0.8mol/l的乙醇胺中3h，封閉未偶聯(lián)的偶聯(lián)載體；
（3.2.5）清洗：用摩爾濃度為0.1mol/l、ph為4.0的醋酸鹽緩沖液加0.4mol/l的nacl溶液和ph為8.0的tris-hcl緩沖液加摩爾濃度為0.4mol/l的nacl溶液循環(huán)清洗瓊脂糖珠。
所述步驟（4）包括如下步驟：
（4.1）結(jié)合：將偶聯(lián)多肽后的偶聯(lián)載體裝填至蛋白質(zhì)純化柱，以丙種球蛋白作為抗體樣本，加入純化柱中，加入ph為7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌；
（4.2）洗脫：用摩爾濃度為0.1mol/l、ph為4.0的檸檬酸緩沖液洗脫抗體，于收集管中加入0.4gtris固體試劑；
（4.3）收集：重復(fù)步驟（4.1）和步驟（4.2），直至收集足夠量的抗體；
（4.4）平衡：用10k的蛋白超濾管加入13mlpbs平衡，在4500rpm轉(zhuǎn)速下離心35min，棄掉廢液；
（4.5）濃縮去鹽：將步驟（4.3）收集的抗體加入蛋白超濾管中，在4500rpm轉(zhuǎn)速下離心35min，收集超濾膜上方液體為濃縮去鹽抗體；重復(fù)該步驟，直至全部抗體濃縮去鹽。
所述步驟（4.5）之后還包括步驟（4.6）保存：短時間內(nèi)用不完的抗體加入無菌甘油至質(zhì)量分數(shù)為45%，于-15℃溫度下保存。
所述步驟（5）包括如下步驟：
（5.1）病毒tcid50的計算：將vero細胞接種至96孔板，然后接種ev71病毒，接種7天后觀察細胞病變情況，計算ev71病毒的tcid50；
（5.2）體外微量中和實驗通過體外微量中和試驗的方法，分析捕獲的中和抗體的中和滴度。
所述步驟（5.1）包括如下步驟：
（5.1.1）接種細胞：將含有fbs的dmem培養(yǎng)基的vero細胞，用pbs洗三遍，再用2ml質(zhì)量分數(shù)為0.2%的胰酶消化1.5min，加入2ml含有fbs的dmem培養(yǎng)基，吹打制成單細胞懸液，800rpm轉(zhuǎn)速下離心6min，棄掉上清，加入含有fbs的dmem培養(yǎng)基，吹打制成單細胞懸液，并用細胞計數(shù)板計數(shù)；
用含有fbs的dmem培養(yǎng)基將細胞稀釋成1.5×104個細胞/100μl，并接種至96孔板，過夜培養(yǎng)；
（5.1.2）接種病毒：將培養(yǎng)的ev71病毒經(jīng)過0.20μm濾膜過濾，用含有fbs的dmem培養(yǎng)基將ev71病毒按照10-1~10-15梯度稀釋；
將ev71病毒接種至步驟（5.1.1）中的96孔板，每孔接種100μl，每個梯度接種10個孔；
（5.1.3）計算：病毒接種7天后觀察細胞病變情況，計算ev71病毒tcid50；
所述含有fbs的dmem培養(yǎng)基中，fbs的質(zhì)量分數(shù)為1.5%。
所述步驟（5.2）包括如下步驟：
（5.2.1）將vero細胞按每孔1.5×104個細胞/100μl接種到96孔板，生長過夜；
（5.2.2）用含有fbs的dmem培養(yǎng)基稀釋病毒至tcid50為100，取新96孔板，每孔加入ev71病毒50μl；
（5.2.3）用含有fbs的dmem培養(yǎng)基按倍比稀釋濃縮去鹽抗體，將不同稀釋比例的抗體按50μl/孔加入步驟（5.2.2）的96孔板中，輕搖混勻，36℃溫度下孵育1.5h；
（5.2.4）將步驟（5.2.2）的96孔板中的液體加入步驟（5.2.1）的96孔板中，每個樣本設(shè)平行孔3個，在co2濃度為4%、36℃溫度下培養(yǎng)4d，完全抑制致細胞病變效應(yīng)出現(xiàn)的最高血清稀釋度作為血清的中和滴度；
（5.2.5）分析單個中和抗原表位多肽結(jié)合抗體的中和滴度，并作為評價該中和抗原表位多肽在人體免疫反應(yīng)中的效果；
所述含有fbs的dmem培養(yǎng)基中，fbs的質(zhì)量分數(shù)為1.5%。
所述步驟（5）之后還包括步驟（6）組合分析：將捕獲的中和抗體兩兩組合以及三個組合，通過體外微量中和試驗的方法，分析不同組合的中和抗體的中和滴度。
實施例2
本實施例與上述實施例1的不同之處在于：
所述步驟（3）包括如下步驟：
（3.1）偶聯(lián)載體預(yù)處理：選擇瓊脂糖珠作為偶聯(lián)載體，加入雙蒸水進行膨脹，再加入雙蒸水進行洗滌；
（3.2）偶聯(lián)配基：
（3.2.1）配基溶解：將多肽用質(zhì)量分數(shù)為25%、ph為9.0的二甲基甲酰胺溶解；
（3.2.2）偶聯(lián)：將預(yù)處理后的瓊脂糖珠和溶解后的多肽按體積比1:1的比例混合，在30℃溫度下孵育16h；
（3.2.3）洗脫：用質(zhì)量分數(shù)為25%、ph為9.0的二甲基甲酰胺洗脫未偶聯(lián)的多肽；
（3.2.4）封閉：在30℃溫度下，將洗脫后的瓊脂糖珠靜置于1mol/l的乙醇胺中4h，封閉未偶聯(lián)的偶聯(lián)載體；
（3.2.5）清洗：用摩爾濃度為0.1mol/l、ph為4.0的醋酸鹽緩沖液加0.5mol/l的nacl溶液和ph為8.0的tris-hcl緩沖液加摩爾濃度為0.5mol/l的nacl溶液循環(huán)清洗瓊脂糖珠。
所述步驟（4）包括如下步驟：
（4.1）結(jié)合：將偶聯(lián)多肽后的偶聯(lián)載體裝填至蛋白質(zhì)純化柱，以丙種球蛋白作為抗體樣本，加入純化柱中，加入ph為7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌；
（4.2）洗脫：用摩爾濃度為0.1mol/l、ph為4.0的檸檬酸緩沖液洗脫抗體，于收集管中加入0.5gtris固體試劑；
（4.3）收集：重復(fù)步驟（4.1）和步驟（4.2），直至收集足夠量的抗體；
（4.4）平衡：用10k的蛋白超濾管加入15mlpbs平衡，在5000rpm轉(zhuǎn)速下離心30min，棄掉廢液；
（4.5）濃縮去鹽：將步驟（4.3）收集的抗體加入蛋白超濾管中，在5000rpm轉(zhuǎn)速下離心30min，收集超濾膜上方液體為濃縮去鹽抗體；重復(fù)該步驟，直至全部抗體濃縮去鹽。
所述步驟（4.5）之后還包括步驟（4.6）保存：短時間內(nèi)用不完的抗體加入無菌甘油至質(zhì)量分數(shù)為50%，于-20℃溫度下保存。
所述步驟（5.1）包括如下步驟：
（5.1.1）接種細胞：將含有fbs的dmem培養(yǎng)基的vero細胞，用pbs洗三遍，再用3ml質(zhì)量分數(shù)為0.25%的胰酶消化2min，加入3ml含有fbs的dmem培養(yǎng)基，吹打制成單細胞懸液，1000rpm轉(zhuǎn)速下離心5min，棄掉上清，加入含有fbs的dmem培養(yǎng)基，吹打制成單細胞懸液，并用細胞計數(shù)板計數(shù)；
用含有fbs的dmem培養(yǎng)基將細胞稀釋成2×104個細胞/100μl，并接種至96孔板，過夜培養(yǎng)；
（5.1.2）接種病毒：將培養(yǎng)的ev71病毒經(jīng)過0.22μm濾膜過濾，用含有fbs的dmem培養(yǎng)基將ev71病毒按照10-1~10-15梯度稀釋；
將ev71病毒接種至步驟（5.1.1）中的96孔板，每孔接種100μl，每個梯度接種10個孔；
（5.1.3）計算：病毒接種7天后觀察細胞病變情況，計算ev71病毒tcid50；
所述含有fbs的dmem培養(yǎng)基中，fbs的質(zhì)量分數(shù)為2%。
所述步驟（5.2）包括如下步驟：
（5.2.1）將vero細胞按每孔2×104個細胞/100μl接種到96孔板，生長過夜；
（5.2.2）用含有fbs的dmem培養(yǎng)基稀釋病毒至tcid50為100，取新96孔板，每孔加入ev71病毒50μl；
（5.2.3）用含有fbs的dmem培養(yǎng)基按倍比稀釋濃縮去鹽抗體，將不同稀釋比例的抗體按50μl/孔加入步驟（5.2.2）的96孔板中，輕搖混勻，37℃溫度下孵育1h；
（5.2.4）將步驟（5.2.2）的96孔板中的液體加入步驟（5.2.1）的96孔板中，每個樣本設(shè)平行孔3個，在co2濃度為5%、37℃溫度下培養(yǎng)3d，完全抑制致細胞病變效應(yīng)出現(xiàn)的最高血清稀釋度作為血清的中和滴度；
（5.2.5）分析單個中和抗原表位多肽結(jié)合抗體的中和滴度，并作為評價該中和抗原表位多肽在人體免疫反應(yīng)中的效果；
所述含有fbs的dmem培養(yǎng)基中，fbs的質(zhì)量分數(shù)為2%。
實施例3
本實施例與上述實施例1的不同之處在于：
所述步驟（3）包括如下步驟：
（3.1）偶聯(lián)載體預(yù)處理：選擇瓊脂糖珠作為偶聯(lián)載體，加入雙蒸水進行膨脹，再加入雙蒸水進行洗滌；
（3.2）偶聯(lián)配基：
（3.2.1）配基溶解：將多肽用質(zhì)量分數(shù)為25%、ph為9.0的二甲基甲酰胺溶解；
（3.2.2）偶聯(lián)：將預(yù)處理后的瓊脂糖珠和溶解后的多肽按體積比1.2:1的比例混合，在40℃溫度下孵育14h；
（3.2.3）洗脫：用質(zhì)量分數(shù)為25%、ph為9.0的二甲基甲酰胺洗脫未偶聯(lián)的多肽；
（3.2.4）封閉：在40℃溫度下，將洗脫后的瓊脂糖珠靜置于1.2mol/l的乙醇胺中5h，封閉未偶聯(lián)的偶聯(lián)載體；
（3.2.5）清洗：用摩爾濃度為0.1mol/l、ph為4.0的醋酸鹽緩沖液加0.6mol/l的nacl溶液和ph為8.0的tris-hcl緩沖液加摩爾濃度為0.6mol/l的nacl溶液循環(huán)清洗瓊脂糖珠。
所述步驟（4）包括如下步驟：
（4.1）結(jié)合：將偶聯(lián)多肽后的偶聯(lián)載體裝填至蛋白質(zhì)純化柱，以丙種球蛋白作為抗體樣本，加入純化柱中，加入ph為7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌；
（4.2）洗脫：用摩爾濃度為0.1mol/l、ph為4.0的檸檬酸緩沖液洗脫抗體，于收集管中加入0.6gtris固體試劑；
（4.3）收集：重復(fù)步驟（4.1）和步驟（4.2），直至收集足夠量的抗體；
（4.4）平衡：用10k的蛋白超濾管加入17mlpbs平衡，在5500rpm轉(zhuǎn)速下離心25min，棄掉廢液；
（4.5）濃縮去鹽：將步驟（4.3）收集的抗體加入蛋白超濾管中，在5500rpm轉(zhuǎn)速下離心25min，收集超濾膜上方液體為濃縮去鹽抗體；重復(fù)該步驟，直至全部抗體濃縮去鹽。
所述步驟（4.5）之后還包括步驟（4.6）保存：短時間內(nèi)用不完的抗體加入無菌甘油至質(zhì)量分數(shù)為55%，于-25℃溫度下保存。
所述步驟（5.1）包括如下步驟：
（5.1.1）接種細胞：將含有fbs的dmem培養(yǎng)基的vero細胞，用pbs洗三遍，再用4ml質(zhì)量分數(shù)為0.3%的胰酶消化2.5min，加入4ml含有fbs的dmem培養(yǎng)基，吹打制成單細胞懸液，1200rpm轉(zhuǎn)速下離心4min，棄掉上清，加入含有fbs的dmem培養(yǎng)基，吹打制成單細胞懸液，并用細胞計數(shù)板計數(shù)；
用含有fbs的dmem培養(yǎng)基將細胞稀釋成2.5×104個細胞/100μl，并接種至96孔板，過夜培養(yǎng)；
（5.1.2）接種病毒：將培養(yǎng)的ev71病毒經(jīng)過0.25μm濾膜過濾，用含有fbs的dmem培養(yǎng)基將ev71病毒按照10-1~10-15梯度稀釋；
將ev71病毒接種至步驟（5.1.1）中的96孔板，每孔接種100μl，每個梯度接種10個孔；
（5.1.3）計算：病毒接種7天后觀察細胞病變情況，計算ev71病毒tcid50；
所述含有fbs的dmem培養(yǎng)基中，fbs的質(zhì)量分數(shù)為2.5%。
所述步驟（5.2）包括如下步驟：
（5.2.1）將vero細胞按每孔2.5×104個細胞/100μl接種到96孔板，生長過夜；
（5.2.2）用含有fbs的dmem培養(yǎng)基稀釋病毒至tcid50為100，取新96孔板，每孔加入ev71病毒50μl；
（5.2.3）用含有fbs的dmem培養(yǎng)基按倍比稀釋濃縮去鹽抗體，將不同稀釋比例的抗體按50μl/孔加入步驟（5.2.2）的96孔板中，輕搖混勻，37℃溫度下孵育0.5h；
（5.2.4）將步驟（5.2.2）的96孔板中的液體加入步驟（5.2.1）的96孔板中，每個樣本設(shè)平行孔3個，在co2濃度為6%、37℃溫度下培養(yǎng)2d，完全抑制致細胞病變效應(yīng)出現(xiàn)的最高血清稀釋度作為血清的中和滴度；
（5.2.5）分析單個中和抗原表位多肽結(jié)合抗體的中和滴度，并作為評價該中和抗原表位多肽在人體免疫反應(yīng)中的效果；
所述含有fbs的dmem培養(yǎng)基中，fbs的質(zhì)量分數(shù)為2.5%。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實現(xiàn)方案，除此之外，本發(fā)明還可以其它方式實現(xiàn)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下任何顯而易見的替換均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。