本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)血液中cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量的側(cè)向?qū)游鲈噭┖屑捌渲苽浞椒ā?/p>

背景技術(shù)：

自1981年世界第一例艾滋病病毒感染者發(fā)現(xiàn)至今，短短30多年間，艾滋病在全球肆虐流行，已成為重大的公共衛(wèi)生問題和社會(huì)問題，引起世界衛(wèi)生組織及各國(guó)政府的高度重視。

t淋巴細(xì)胞是一類具有抗感染和腫瘤免疫的細(xì)胞，它主要分為cd4⁺t細(xì)胞與cd8⁺t細(xì)胞。cd4⁺t細(xì)胞主要起輔助體液免疫和細(xì)胞免疫激活的作用。cd4⁺t細(xì)胞表面的cd4分子是艾滋病病毒的受體，當(dāng)hiv病毒進(jìn)入人體后，它感染并損壞cd4⁺t淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫被抑制，致使整個(gè)人體免疫功能遭到破壞，最終喪失對(duì)各種疾病的抵抗能力而導(dǎo)致死亡。因此可通過cd4⁺t淋巴細(xì)胞記數(shù)能夠直接反映hiv感染患者免疫系統(tǒng)損害狀況。

正常成人的cd4⁺t細(xì)胞為每微升的血液中含有500～1600個(gè)，艾滋病病毒感染者的cd4⁺t細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)進(jìn)行性或不規(guī)則性下降，提示感染者的免疫系統(tǒng)受到了嚴(yán)重?fù)p害，當(dāng)每微升血液中cd4⁺t細(xì)胞小于200個(gè)時(shí)就可能會(huì)發(fā)生多種嚴(yán)重的機(jī)會(huì)性感染或腫瘤。目前最新規(guī)定每微升血液中hiv感染者的cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量水平低于350個(gè)就應(yīng)該開始進(jìn)行治療。

目前檢查艾滋病的主要方法包括：(1)機(jī)體免疫功能檢查，主要包括cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)和cd4⁺t細(xì)胞與cd8⁺t細(xì)胞比值檢測(cè)；(2)pcr技術(shù)檢測(cè)hiv病毒核酸；(3)hiv抗體和抗原檢測(cè)，采用酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光檢測(cè)法、免疫印跡檢測(cè)法、側(cè)向?qū)游鲈嚰埛?、明膠顆粒凝集試驗(yàn)、放射免疫沉淀法等。cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)相比于病毒核酸檢測(cè)和病毒抗體檢測(cè)，能更加直觀的反應(yīng)出患者的免疫狀態(tài)，為患者提供合適的治療時(shí)機(jī)和治療方式，從而達(dá)到精準(zhǔn)治療、精確用藥的目的，對(duì)于艾滋病的治療防控具有重要意義。而目前針對(duì)cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)主要方法包括流式細(xì)胞術(shù)法、微流控芯片計(jì)數(shù)法以及顯微鏡人功計(jì)數(shù)法。流式細(xì)胞術(shù)法和微流控芯片計(jì)數(shù)法，具有檢測(cè)樣本量大和檢測(cè)準(zhǔn)確率高等優(yōu)勢(shì)。但需要昂貴的流式細(xì)胞儀或者微流控操控平臺(tái)、專業(yè)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員和特定的實(shí)驗(yàn)環(huán)境等條件。這些條件不利于艾滋病的實(shí)時(shí)防控，也不利于艾滋病的精準(zhǔn)診療在資源匱乏的國(guó)家和地區(qū)的普及。顯微鏡人功計(jì)數(shù)法，相比流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)成本更低，儀器要求更低，適合普通檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，但同樣需要專業(yè)的技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)、操作繁瑣、人為誤差大，不適合快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

綜合上所述：已上方法都普遍存在如下幾個(gè)問題：第一，需要昂貴的儀器設(shè)備；第二，需要專業(yè)的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室和專業(yè)的技術(shù)人員；第三，大部分儀器成本和檢測(cè)成本昂貴難以普及。側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l在診斷領(lǐng)域的應(yīng)用具有如下優(yōu)點(diǎn)：第一，無需大型儀器設(shè)備；第二，操作簡(jiǎn)單，無需專業(yè)技術(shù)人員可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；第三，檢測(cè)成本低，檢測(cè)速度快，適合推廣應(yīng)用。但目前市面上的側(cè)向?qū)游鲈嚰堄糜跈z測(cè)診斷領(lǐng)域主要的檢測(cè)對(duì)象是血清或血漿中的蛋白分子或核酸分子，而對(duì)于全血的檢測(cè)，特別是針對(duì)血液中細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)還是一片空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種檢測(cè)血液中cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量的側(cè)向?qū)游鲈噭┖小?/p>

本發(fā)明的另一目的在于提供上述側(cè)向?qū)游鲈噭┖械闹苽浞椒ā?/p>

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種檢測(cè)血液中cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量的側(cè)向?qū)游鲈噭┖?，包含樣品處理管和試紙條；其中，樣品處理管含有全血樣品處理液和信號(hào)物標(biāo)記的cd4抗體(信標(biāo)cd4抗體)；試紙條包括底板和在底板上附著有沿層析方向緊密相連的樣品墊、濾血層、層析膜層和吸水墊；樣品墊部分壓在濾血層上，濾血層部分壓在層析膜層上，吸水墊部分壓在層析膜層上；在層析膜層上設(shè)置檢測(cè)線(t線)和質(zhì)控線(c線)，濾血層、檢測(cè)線、質(zhì)控線和吸水墊依次排列。

所述的檢檢測(cè)血液中cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量的側(cè)向?qū)游鲈噭┖?，還包括外殼，外殼設(shè)置于試紙條的外部；在外殼上設(shè)置有加樣孔和觀察孔，加樣孔位于樣品墊上，觀察孔位于層析膜層上檢測(cè)線和質(zhì)控線區(qū)域。塑料外殼的作用是防止試紙條受到污染以及便攜易用。

所述的全血樣品處理液的組成如下：0.02m、ph＝7.3～7.4pb緩沖液中加入0.9％(w/v)nacl、1％(w/v)bsa、1％(w/v)peg-4000、20％(v/v)飽和硫酸銨(22±3℃)、0.1％(w/v)肝素鈉、0.02％(w/v)nan3。

所述的全血樣品處理液在每支所述的樣品處理管中的量?jī)?yōu)選為50μl。

所述的信號(hào)物標(biāo)記的cd4抗體在每支所述的樣品處理管中的量?jī)?yōu)選為1μl按cd4抗體計(jì)算為0.01mg/ml的信號(hào)物標(biāo)記的cd4抗體。

所述的信號(hào)物標(biāo)記的cd4抗體優(yōu)選為熒光微球標(biāo)記的cd4抗體。

所述的熒光微球標(biāo)記的cd4抗體，優(yōu)選為通過如下步驟制備得到：在100μl1％(w/v)羧基化的熒光微球溶液中加入400μl雙蒸水，然后加入20μl1‰(w/v)edc(碳二亞胺)和10μl1‰(w/v)nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)，混合反應(yīng)30min，得到活化后的熒光微球溶液；在活化后熒光微球溶液中加入60μl濃度為1mg/ml的cd4抗體溶液，混合均勻，在攪拌的條件下反應(yīng)2h；接著加入60μl濃度為10％(w/v)的牛血清白蛋白溶液封閉，攪拌反應(yīng)1h；離心，棄上清，加入60000μl復(fù)溶液重懸沉淀，獲得熒光微球標(biāo)記的cd4抗體；其中，復(fù)溶液是0.02m、ph＝8.4的pb緩沖液中加入5％(w/v)蔗糖、5％(w/v)海藻糖、0.5％(w/v)bsa、0.5％(w/v)表面活性劑(s-17)、0.5％(v/v)tween-20、0.5％(w/v)peg-4000和0.01％(w/v)nan3。

所述的熒光微球溶液優(yōu)選為為度生物的黃綠色熒光微球溶液，熒光微球粒徑約為130nm、固含量為1％(即1ml的溶液中含有10mg微球顆粒)、羧基含量約為75μmol/g、激發(fā)波長(zhǎng)為468nm、發(fā)射波長(zhǎng)為508nm。

所述的離心的條件優(yōu)選為12000rpm離心15min。

所述的底板的材質(zhì)為不透水物質(zhì)，優(yōu)選為塑料，更優(yōu)選為聚氯乙烯(pvc)。

所述的濾血層的材質(zhì)優(yōu)選為v-9型濾血膜。

所述的濾血層由至少兩層濾血膜疊加而成；優(yōu)選由三層濾血膜疊加而成；更優(yōu)選為長(zhǎng)度為1.25cm的濾膜、長(zhǎng)度為1cm的濾膜和長(zhǎng)度為0.75cm的濾膜從上到下依次疊加，其中挨著層析膜層的濾血層一端是平整的。濾血層的主要功能是過濾血液中的血細(xì)胞。檢測(cè)的血液樣本量一般為50-100μl，如果采用單層膜過濾，膜長(zhǎng)度已經(jīng)超出了試紙條的底板長(zhǎng)度。通過實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)如果采用三層濾血膜，在達(dá)到實(shí)驗(yàn)效果的同時(shí)也節(jié)約直線長(zhǎng)度。

所述的層析膜優(yōu)選為硝酸纖維素膜。

所述的檢測(cè)線(t)上設(shè)置有羊抗鼠二抗層。羊抗鼠二抗用來識(shí)別信號(hào)物標(biāo)記的鼠源cd4⁺抗體。由于cd4抗原市場(chǎng)價(jià)格昂貴且不穩(wěn)定，如果使用其作為t線包被抗原，將造成檢測(cè)成本過高，不適合產(chǎn)品推廣。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，羊抗鼠二抗對(duì)鼠源的cd4⁺抗體具有優(yōu)秀的捕獲能力，可以滿足實(shí)驗(yàn)要求，并且制作成本下降了將近100倍。

所述的質(zhì)控線(c)上設(shè)置有信號(hào)物標(biāo)記的兔igg層。質(zhì)控線在整個(gè)系統(tǒng)中主要有兩個(gè)作用：第一作為產(chǎn)品的質(zhì)量控制，直接判斷產(chǎn)品是否有效；第二作為比色指標(biāo)，可以通過t線和c線的比值反應(yīng)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度，消除誤差干擾。

所述的信號(hào)物標(biāo)記的兔igg優(yōu)選為熒光微球標(biāo)記的兔igg。

所述的熒光微球標(biāo)記的兔igg，優(yōu)選為通過如下步驟制備得到：在100μl1％(w/v)羧基化的熒光微球溶液中加入400μl雙蒸水，然后加入20μl(w/v)edc(碳二亞胺)和10μl(w/v)nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)，混合反應(yīng)30min，得到活化后的熒光微球溶液；在活化后熒光微球溶液中加入30μl濃度為2mg/ml的兔igg溶液，混合均勻，在攪拌的條件下反應(yīng)2h；接著加入60μl濃度為10％(w/v)的牛血清白蛋白溶液封閉，攪拌反應(yīng)1h；離心，棄上清，加入1000μl復(fù)溶液重懸沉淀，獲得熒光微球標(biāo)記的兔igg；其中，復(fù)溶液是0.02m、ph＝8.4的pb緩沖液中加入5％(w/v)蔗糖、5％(w/v)海藻糖、0.5％(w/v)bsa、0.5％(w/v)表面活性劑(s-17)、0.5％(v/v)tween-20、0.5％(w/v)peg-4000和0.01％(w/v)nan3。

所述的熒光微球溶液優(yōu)選為為度生物的黃綠色熒光微球溶液，熒光微球粒徑約為130nm、固含量為1％(1ml的溶液中含有10mg微球顆粒)、羧基含量約為75μmol/g、激發(fā)波長(zhǎng)為468nm、發(fā)射波長(zhǎng)為508nm。

所述的離心的條件優(yōu)選為12000rpm離心15min。

所述的樣品墊的材質(zhì)優(yōu)選為玻璃纖維。

所述的樣品墊為通過全血樣品墊處理液處理得到，具體步驟如下：每條長(zhǎng)×寬＝30cm×2cm的樣品墊原材料加入5ml全血樣品墊處理液，37℃干燥過夜，濕度低于30％、常溫保存；其中全血樣品墊處理液的組成如下：ph值＝7.4、0.015mpbs緩沖液中加入0.5％(w/v)bsa、2％(w/v)海藻糖、2％(w/v)peg-4000、0.5％(v/v)tween-20、0.1％(w/v)肝素鈉、0.02％(w/v)nan3。

所述的吸水墊的材質(zhì)優(yōu)選為加厚吸水紙。

所述的檢測(cè)血液中cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量的側(cè)向?qū)游鲈噭┖械闹苽浞椒?，包括如下步驟：

(1)制備樣品處理管：

①配制全血樣品處理液：100ml0.02m、ph值＝7.3～7.4的pb緩沖液中加入100mg肝素鈉、0.9gnacl、1gbsa、1gpeg-4000、20ml飽和(nh4)2so4(22℃±3℃)、20mgnan3；

②取一支200μlep管(無菌)，加入50μl全血樣品處理液和1μl信號(hào)物標(biāo)記后的cd4抗體，得到樣品處理管；該樣品處理管在23℃±2℃可保存1周，4℃可保存1個(gè)月，-20℃可保存3～6個(gè)月；

(2)制備試紙條：

①用全血樣品墊處理液處理樣品墊，每條長(zhǎng)×寬＝30cm×2cm的樣品墊原材料加入5ml全血樣品墊處理液，37℃干燥過夜，濕度低于30％、常溫保存；全血樣品墊處理液的組成如下：ph值＝7.4、0.015mpbs緩沖液中加入0.5％(w/v)bsa、2％(w/v)海藻糖、2％(w/v)peg-4000、0.5％(v/v)tween-20、0.1％(w/v)肝素鈉、0.02％(w/v)nan3；

②將羊抗鼠二抗和信號(hào)物標(biāo)記后的兔igg呈直線型包被在層析膜上，分別形成檢測(cè)線和質(zhì)控線；

④先將步驟②得到的層析膜貼附在底板上，得到層析膜層；接著在靠近層析膜層質(zhì)控線的一端貼上吸水紙，得到吸水墊，吸水墊的部分在層析膜層上；在遠(yuǎn)離層析膜層質(zhì)控線的一端貼上濾血膜，得到濾血層，濾血層的部分位于層析膜層上；再貼上樣品墊，樣品墊的部分位于濾血層上，得到試紙條；

(3)將樣品處理管和試紙條搭配在一起，得到檢測(cè)血液中cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量的側(cè)向?qū)游鲈噭┖小?/p>

步驟(2)中所述的羊抗鼠二抗優(yōu)選通過噴金劃膜儀包被到層析膜上，羊抗鼠二抗的濃度為1mg/ml時(shí)，按1μl/cm制備檢測(cè)線。

步驟(2)中所述的信號(hào)物標(biāo)記的兔igg優(yōu)選通過噴金劃膜儀包被到層析膜上，信號(hào)物標(biāo)記的兔igg稀釋14倍后按1μl/cm制備質(zhì)控線。

本發(fā)明的是基于細(xì)胞阻斷競(jìng)爭(zhēng)法原理：向樣品處理管中加入待測(cè)的全血樣品，樣品經(jīng)全血樣本處理液稀釋和前處理，降低纖維蛋白等雜質(zhì)的干擾，同時(shí)樣品處理管中的信標(biāo)cd4抗體對(duì)樣本進(jìn)行染色，形成信標(biāo)cd4抗體和cd4⁺t細(xì)胞復(fù)合物；然后，將反應(yīng)后的混合物滴加到試紙條上，首先，經(jīng)過樣品墊處理，樣品墊中含有蛋白質(zhì)、緩沖物質(zhì)、封閉劑、親水性大分子物質(zhì)、表面活性劑和抗凝劑等，這些物質(zhì)使得樣本的滲透率下降，調(diào)節(jié)溶液ph并為nc膜上的免疫反應(yīng)提供一個(gè)最佳的反應(yīng)環(huán)境；其次，樣品中的全部細(xì)胞(包括信標(biāo)cd4抗體和cd4⁺t細(xì)胞復(fù)合物)會(huì)被阻隔在濾血層，而樣品中的其他物質(zhì)(包括血漿、樣品處理液和余下的信標(biāo)cd4抗體)通過濾血層到達(dá)nc膜；nc膜上的羊抗鼠二抗捕獲信標(biāo)cd4抗體形成檢測(cè)信號(hào)。當(dāng)檢測(cè)樣本中cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量足夠多，能夠?qū)悠诽幚砉苤械男艠?biāo)cd4抗體大部分或全部結(jié)合時(shí)，檢測(cè)線上的羊抗鼠二抗無法捕獲或只能少量捕獲信標(biāo)cd4抗體而沒有顏色顯示或顏色強(qiáng)度較弱，而質(zhì)控線上的信號(hào)物標(biāo)記的兔igg作為固定的信號(hào)對(duì)比線，檢測(cè)線通過與其對(duì)比而判讀細(xì)胞數(shù)量，在檢測(cè)線顏色強(qiáng)度低于質(zhì)控線顏色強(qiáng)度的這種情況判讀為陰性；當(dāng)血液中cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量較少時(shí)，不足以與樣品處理管中信標(biāo)cd4抗體完全結(jié)合，從而存在信標(biāo)cd4抗體通過濾血層而被檢測(cè)線上的羊抗鼠二抗捕獲，檢測(cè)線有顏色顯示，并且顏色強(qiáng)度大于等于質(zhì)控線顏色強(qiáng)度，這種情況判讀為陽性。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：本發(fā)明能快速檢測(cè)人體血液中的免疫細(xì)胞數(shù)量有利于及時(shí)快速的對(duì)患者免疫功能做出評(píng)價(jià)，對(duì)于各類疾病的診療都具有重大意義。本發(fā)明提供的檢測(cè)血液中cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量的側(cè)向?qū)游鲈噭┖惺窃谀壳皞鹘y(tǒng)的側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行了重新的設(shè)計(jì)與改進(jìn)，并加入了樣品前處理環(huán)節(jié)，此技術(shù)突破了傳統(tǒng)的免疫層析檢測(cè)技術(shù)對(duì)檢測(cè)樣本對(duì)象的局限性，將免疫層析檢測(cè)技術(shù)擴(kuò)展到了一個(gè)全新的檢測(cè)領(lǐng)域，及血液中細(xì)胞的數(shù)量檢測(cè)領(lǐng)域，推動(dòng)了側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)發(fā)展，建立了一種血液中細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)的新方法。本技術(shù)對(duì)原材料要求低，只需要單一的一種細(xì)胞膜表面特異抗體就能建立對(duì)應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量檢測(cè)方法，具有檢測(cè)目標(biāo)的廣泛性。本技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、儀器便攜、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，此發(fā)明將彌補(bǔ)現(xiàn)如今市場(chǎng)上所缺乏的一種可以在非專業(yè)實(shí)驗(yàn)室和非專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員操作下，利用便攜式設(shè)備進(jìn)行的，能簡(jiǎn)便、高效的對(duì)艾滋病患者的免疫狀態(tài)進(jìn)行診斷和治療預(yù)后的產(chǎn)品。此技術(shù)樣品處理時(shí)間為15min，檢測(cè)時(shí)間為15min，根據(jù)cd4抗體標(biāo)記的信號(hào)物不同可以采用目測(cè)(膠體金)和儀器檢測(cè)(熒光微球、量子點(diǎn))兩種結(jié)果讀取方式，可以直接判讀出陰陽性結(jié)果或者通過后期數(shù)據(jù)處理得到具體細(xì)胞數(shù)量。

附圖說明

圖1是本發(fā)明提供的檢測(cè)血液中cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量的側(cè)向?qū)游鲈噭┖械慕Y(jié)構(gòu)示意圖；其中，1-反應(yīng)管、2-樣品墊、3-濾血層、4-層析膜層、5-檢測(cè)線、6-質(zhì)控線、7-吸水墊、8-底板；箭頭表示層析液流動(dòng)方向。

圖2是本發(fā)明提供的試紙條檢測(cè)比例稀釋的血液樣本，并通過檢測(cè)線上熒光強(qiáng)度和質(zhì)控線上熒光強(qiáng)度的比值和樣本稀釋比例得到的曲線圖；其中，不規(guī)則曲線為檢測(cè)值得到的曲線，斜直線為擬合曲線。

圖3是本發(fā)明提供的試紙條檢測(cè)通過比例稀釋得到的cd4細(xì)胞數(shù)量梯度樣本，并通過檢測(cè)線上熒光強(qiáng)度和質(zhì)控線上熒光強(qiáng)度的比值和細(xì)胞數(shù)量得到的曲線圖；其中，內(nèi)嵌不規(guī)則曲線圖為檢測(cè)得到的曲線，外部斜直線圖為以50個(gè)細(xì)胞/μl～500個(gè)細(xì)胞/μl細(xì)胞梯度的檢測(cè)熒光強(qiáng)度的比值得到的擬合曲線。

圖4是本發(fā)明全血樣品墊處理液配方優(yōu)化結(jié)果圖；其中圖a為四種樣品墊的測(cè)試結(jié)果圖；圖b為全血樣品墊4處理液中肝素鈉含量?jī)?yōu)化結(jié)果圖；圖c為全血樣品墊4處理液中peg-400含量?jī)?yōu)化結(jié)果圖；圖d為全血樣品墊4處理液中bsa含量?jī)?yōu)化結(jié)果圖；圖e為全血樣品墊4處理液中tween-20含量?jī)?yōu)化結(jié)果圖；圖f為全血樣品墊4處理液中海藻糖含量?jī)?yōu)化結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

檢測(cè)血液中cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量的側(cè)向?qū)游鲈噭┖械闹苽浞椒皯?yīng)用：

1、主要試劑材料，如表1所示：

表1

2、主要使用儀器，如表2所示：

表2

3、主要溶液的配制：

(1)1％(m/v)檸檬酸三鈉溶液：稱取1g檸檬酸三鈉溶解于100ml超純水；

(2)1％(m/v)氯金酸溶液：將1g氯金酸溶解于100ml超純水；

(3)0.25mol/lk2co3溶液：稱取3.45gk2co3溶解于100ml超純水；

(4)1‰(m/v)edc溶液：稱取1mgedc溶解于1ml超純水；

(5)1‰(m/v)nhs：稱取1mgnhs溶解于1ml超純水；

(6)10％(m/v)bsa溶液：稱取10gbsa溶于100ml超純水中；

(7)0.15mol/l，pbs緩沖液(10×)，ph7.4：nacl80g、kh2po42g、kcl2g、na2hpo4·12h2o29g，加入1000ml雙蒸水中溶解；

(8)0.2mol/l，pb緩沖液(10×)，ph7.4：kh2po44g、na2hpo4·12h2o29g，加入1000ml雙蒸水中溶解，ph調(diào)節(jié)到7.4；

(9)0.2mol/l，pb緩沖液(10×)，ph8.4：kh2po44g、na2hpo4·12h2o29g，加入1000ml雙蒸水中溶解，ph調(diào)節(jié)到8.4；

(10)復(fù)溶液：

加入到20ml0.02mol/lph＝8.4的pb緩沖液中溶解；

(10)飽和硫酸銨：硫酸銨500g，用500ml雙蒸水水浴60℃攪拌溶解，冷卻到室溫，瓶底有晶體析出即可。

(11)全血樣品墊1處理液：100mlph＝7.4、0.015mpbs緩沖液(1×)中加入1gbsa、1g海藻糖、1gpeg-4000、1mltween-20、20mgnan3。

(12)全血樣品墊2處理液：100mlph＝7.4、0.015mpbs緩沖液(1×)中加入0.8gnacl、1g酸水解酪素、1g海藻糖、1gpeg-4000、1gpvp-40k、20mgnan3。

(13)全血樣品墊3處理液：100mlph＝7.4、0.015mpbs緩沖液(1×)中加入0.8gnacl、1gbsa、1g海藻糖、1gpeg-4000、1mltween-20、100mg肝素鈉、20mgnan3。

(14)全血樣品墊4處理液：100mlph＝7.4、0.015mpbs緩沖液(1×)中加入1gbsa、1g海藻糖、1gpeg-4000、1mltween-20、100mg肝素鈉、20mgnan3。

(15)優(yōu)化后的全血樣品墊處理液：ph值＝7.4、0.015mpbs緩沖液中加入0.5％(w/v)bsa、2％(w/v)海藻糖、2％(w/v)peg-4000、0.5％(v/v)tween-20、0.1％(w/v)肝素鈉、0.02％(w/v)nan3。

(16)全血樣品處理液：100mlph＝7.4、0.02mpb緩沖液中加入0.9gnacl、1gbsa、1gpeg-4000、20ml飽和硫酸銨(22±3℃)、100mg肝素鈉、20mgnan3。

4、試劑盒的制備

4.1熒光微球

購于為度生物有限公司，粒徑130nm，固含量1mg/ml，激發(fā)波長(zhǎng)468nm，發(fā)射波長(zhǎng)508nm。

4.2熒光微球標(biāo)記的兔igg的制備

100μl羧基化的熒光微球溶液中加入400μlddh2o，然后加入20μl(w/v)edc和10μl(w/v)nhs，混合反應(yīng)30min；然后加入60μl兔igg(1mg/ml)混合均勻，在攪拌的條件下反應(yīng)2h；加入60μl10％牛血清白蛋白封閉，攪拌反應(yīng)1h；最后12000rpm離心15min棄上清，加入10000μl復(fù)溶液重懸沉淀，并用超聲清洗儀高頻和低頻各清洗6min使溶液充分重懸，獲得熒光微球標(biāo)記的兔igg(fnps-兔igg)，4℃保存。

4.3熒光微球標(biāo)記的cd4抗體的制備

100μl羧基化的熒光微球溶液中加入400μlddh2o，然后加入20μl(w/v)edc和10μl(w/v)nhs，混合反應(yīng)30min；然后加入60μlcd4抗體(1mg/ml)混合均勻，在攪拌的條件下反應(yīng)2h；加入60μl10％牛血清白蛋白封閉，攪拌反應(yīng)1h；最后12000rpm離心15min棄上清，加入10000μl復(fù)溶液重懸沉淀，并用超聲清洗儀高頻和低頻各清洗6min使溶液充分重懸，獲得熒光微球標(biāo)記的cd4抗體，4℃保存。

4.4樣品墊的處理

樣品墊處理：每條長(zhǎng)×寬＝30cm×2cm的樣品墊原材料加入5ml優(yōu)化后的全血樣品墊處理液，37℃干燥過夜，濕度低于30％、常溫保存。

5、基于熒光微球信號(hào)系統(tǒng)的檢測(cè)人體血液中的cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量的免疫層析試紙條的組裝

如圖1所示，基于熒光微球信號(hào)系統(tǒng)的檢測(cè)人體血液中的cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量的側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l檢測(cè)系統(tǒng)包括反應(yīng)管1、樣品墊2、濾血層3、層析膜4、檢測(cè)線5、質(zhì)控線6、吸水墊7、底板8。

反應(yīng)管1加入50μl全血樣品處理液，然后用微量移液器量取1μl熒光微球標(biāo)記的cd4抗體加入到反應(yīng)管1中；把羊抗鼠igg(1mg/ml)和稀釋14倍的fnps-兔igg用噴金劃膜儀以1μl/cm的量包被到層析膜(硝酸纖維素膜)4上，作為檢測(cè)線5和質(zhì)控線6，并且在37℃烘箱烘3h。在底板8上順次相互搭接樣品墊2、濾血層3、層析膜4和吸水墊7，得到的試紙板按要求切割成3.51mm(寬度)的試紙條。再裝進(jìn)塑料卡殼(塑料卡殼開有加樣孔和檢測(cè)孔，加樣孔的位置位于樣品墊位置；檢測(cè)孔的位置位于檢測(cè)線所在區(qū)域)組成完整的基于熒光微球信號(hào)系統(tǒng)的的cd4⁺t細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)的免疫層析試紙條。

一個(gè)效果更佳的試紙條，是濾血層3為三層，長(zhǎng)度為1.25cm的濾膜、長(zhǎng)度為1cm的濾膜和長(zhǎng)度為0.75cm的濾膜從上到下依次疊加，其中挨著層析膜層的濾血層一端是平整的。

6、基于熒光試紙條檢測(cè)cd4細(xì)胞數(shù)量

6.1試紙條檢測(cè)流程

取50μl抗凝全血加入到樣品處理管中，輕微吸打混勻，反應(yīng)15min；從樣品處理管中取75μl反應(yīng)后的液體加入到試紙條的加樣孔，15min用熒光讀卡儀判讀。

6.2檢測(cè)比例稀釋的血液樣本

將正常人的全血樣本進(jìn)行比例稀釋到不同百分濃度(0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％)，相應(yīng)細(xì)胞也會(huì)隨此呈現(xiàn)出不同的濃度梯度，然后按照試紙檢測(cè)流程操作。結(jié)果如圖2所示：通過計(jì)算檢測(cè)線上熒光強(qiáng)度和質(zhì)控線上熒光強(qiáng)度的比值，繪制曲線，并擬合。本試紙條條可以明顯的區(qū)分不同比例稀釋下的全血樣本。

6.3檢測(cè)不同cd4細(xì)胞濃度數(shù)量的稀釋樣本

a：絕對(duì)計(jì)數(shù)：1)、用肝素鈉真空抗凝管抽取正常人的靜脈血樣本；2)、用移液器吸取20μl熒光抗體混合染色液(流式絕對(duì)計(jì)數(shù)自帶的流式抗體染色液cd3cd4cd45三色流式抗體)加到bdtrucounttmtubes上方，請(qǐng)勿接觸到顆粒；3)、用移液器吸取50μl抗凝全血加到bdtrucounttmtubes上方，請(qǐng)勿接觸到管壁；4)、蓋上計(jì)數(shù)管蓋，并輕輕地進(jìn)行渦旋混合，在室溫(20～30℃)避光環(huán)境下孵育15min；5)、向計(jì)數(shù)管中添加450μl的1×facs溶血素，蓋上計(jì)數(shù)管蓋，并輕輕地進(jìn)行渦旋混合，在室溫避光反應(yīng)15min；6)、將樣本上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

b：試紙條檢測(cè)：1)、通過流式得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析計(jì)算，得到樣本的細(xì)胞數(shù)為689個(gè)細(xì)胞/μl；2)、按照cd4細(xì)胞數(shù)量梯度(0個(gè)細(xì)胞/μl、50個(gè)細(xì)胞/μl、100個(gè)細(xì)胞/μl、200個(gè)細(xì)胞/μl、300個(gè)細(xì)胞/μl、400個(gè)細(xì)胞/μl、500個(gè)細(xì)胞/μl、600個(gè)細(xì)胞/μl)對(duì)樣本進(jìn)行稀釋，制備得到不同的cd4細(xì)胞數(shù)量的全血樣本；3)、按照試紙條檢測(cè)流程進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖3所示：通過計(jì)算檢測(cè)線上熒光強(qiáng)度和質(zhì)控線上熒光強(qiáng)度的比值，繪制曲線，并得到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)性良好可用于全血中cd4細(xì)胞數(shù)量的定量分析。

7、結(jié)果觀察

陽性結(jié)果為檢測(cè)線和質(zhì)控線出現(xiàn)熒光，陰性結(jié)果為只有質(zhì)控線出現(xiàn)熒光；若質(zhì)控線沒有熒光，則該試紙條無效。膠體金試紙條的靈敏度太低無法滿足檢測(cè)要求，熒光試紙條在50～500個(gè)細(xì)胞/μl的范圍內(nèi)具有良好的相關(guān)性，滿足檢測(cè)要求。

實(shí)施例2濾血膜的設(shè)計(jì)優(yōu)化

首先從市場(chǎng)上挑選了幾種常見的濾血膜，進(jìn)行了材料性價(jià)比的評(píng)價(jià)，最后選定上海捷寧生物科技有限公司的v-9型濾血膜。將v-9型濾血膜裁剪成不同長(zhǎng)度(0.5cm、0.75cm、1.0cm、1.25cm、1.5cm、1.75cm、2.0cm)，按實(shí)施例1進(jìn)行試紙條組裝，然后加入75μl全血樣本，當(dāng)濾血膜長(zhǎng)度達(dá)到2.0cm能將75μl全血樣本中的血細(xì)胞過濾干凈，nc膜上不會(huì)出現(xiàn)血細(xì)胞的干擾免疫反應(yīng)和信號(hào)發(fā)生。然而實(shí)驗(yàn)室的試紙條全長(zhǎng)只有6.0cm，吸水墊長(zhǎng)1.5cm、nc膜長(zhǎng)2.5cm、前端(樣品墊、濾血層)只剩2.0cm，這種試紙條結(jié)構(gòu)無法滿足要求。因此采用了一種一端對(duì)齊的三層疊加結(jié)構(gòu)(0.75cm、1.0cm、1.25cm)，疊加后的濾血層長(zhǎng)度為1.25cm，結(jié)構(gòu)滿足要求，同時(shí)能將75μl全血樣本中的血細(xì)胞過濾干凈，不會(huì)干擾免疫反應(yīng)和信號(hào)發(fā)生

實(shí)施例3對(duì)樣品墊及全血樣品墊處理液進(jìn)行優(yōu)化

(1)樣品墊的處理和組裝

①選擇4種廣泛使用得血液檢測(cè)樣品墊處理液配方配置樣品墊處理液，用選用玻璃纖維膜(上海捷寧公司提供)作為樣品墊原材，用全血樣品墊1處理液、全血樣品墊2處理液、全血樣品墊3處理液和全血樣品墊4處理液分別處理玻璃纖維膜，得到4種全血樣品墊(樣品墊1、2、3、4)，同時(shí)設(shè)置空白組，即不用處理液處理的玻璃纖維膜。

全血樣品墊處理液處理玻璃纖維膜的步驟如下：玻璃纖維膜按照每條長(zhǎng)×寬＝30cm×2cm的切割成空白樣品墊，每條空白樣品墊對(duì)應(yīng)加入5ml全血樣品墊處理液，37℃干燥過夜，濕度低于30％、常溫保存。

②按實(shí)施例1組裝成試紙條。

③按實(shí)施例1中6.1試紙條檢測(cè)流程，進(jìn)行試紙條測(cè)試，檢測(cè)血漿樣本得到的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)為最優(yōu)。結(jié)果如圖4a所示，4種樣品墊處理處理后的樣品墊的效果比較，樣品墊4的效果最優(yōu)，可見，全血樣品墊4的處理液的效果較優(yōu)。接著對(duì)全血樣品墊4處理液的各組分進(jìn)一步優(yōu)化。

(2)全血樣品墊4處理液的優(yōu)化

對(duì)全血樣品墊4處理液的配方進(jìn)行優(yōu)化，第一組是肝素鈉的濃度分別設(shè)置為0、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％，其他成分和濃度同全血樣品墊4處理液；第二組是peg-4000的濃度分別設(shè)置為0、0.5％、1％、1.5％、2％，其他成分和濃度同全血樣品墊4處理液；第三組是bsa的濃度分別設(shè)置為0、0.5％、1％、1.5％、2％，其他成分和濃度同全血樣品墊4處理液；第四組是tween-20的濃度分別設(shè)置為0、0.5％、1％、1.5％、2％，其他成分和濃度同全血樣品墊4處理液；第五組是海藻糖的濃度分別設(shè)置為0、0.5％、1％、1.5％、2％，其他成分和濃度同全血樣品墊4處理液。結(jié)果如圖4b～f所示，得到了優(yōu)化后的全血樣品墊處理液：0.015m、ph＝7.4的pbs緩沖液中加入0.5％(w/v)bsa、2％(w/v)海藻糖、2％(w/v)peg-4000、0.5％(w/v)tween-20、0.1％(w/v)肝素鈉、0.02％(w/v)nan3。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。