本發(fā)明涉及用于檢測游離組蛋白的測定法，并涉及在游離組蛋白檢測的基礎(chǔ)上診斷疾病或醫(yī)學(xué)病癥(condition)例如系統(tǒng)性炎癥。

背景技術(shù)：

核心組蛋白h2a、h2b、h3和h4(各兩個)形成八聚體，其被165個堿基對的dna纏繞，形成染色質(zhì)的基本子單元核小體。每個核小體與其相鄰的核小體相連，通過連接組蛋白h1和h5而穩(wěn)定(felsenfeldg.,groudinem.,nature2003；421(6921):p.448-53)。

所有組蛋白具有共同的緊湊的中心結(jié)構(gòu)：中央為螺旋，側(cè)翼帶有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序。盡管組蛋白帶有高度正電荷，但它們的結(jié)構(gòu)使其能夠與鄰近成員發(fā)生特異性疏水相互作用以形成緊湊的八聚體。上述中心結(jié)構(gòu)外部的區(qū)域是松散的，并含有對核小體形成來說重要的核酸相互作用面。這些區(qū)域也是各種不同的翻譯后修飾(ptm)，通常為n-端乙?；?、瓜氨酸化、甲基化和磷酸化以及c-端遍在蛋白化的對象。ptm對于解開核小體結(jié)構(gòu)來說是必需的，因此在各種細胞過程例如基因轉(zhuǎn)錄、dna損傷修復(fù)、凋亡以及細胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用(kouzaridest.,cell2007；128(4):p.693-705)。

在多種病理生理過程中，也在核的外部檢測到組蛋白(wo2009/061918)。在遭受涉及炎性過程的不同病因例如關(guān)節(jié)炎、嚴重創(chuàng)傷、胰腺炎和膿毒癥的患者的血液中，已描述了細胞外組蛋白的存在。組蛋白從活化的免疫細胞的釋放可以由細胞外誘捕網(wǎng)(extracellulartrap)介導(dǎo)。作為控制和清除感染的最終機制，活化的嗜中性粒細胞可以釋放出細胞外纖維，即所謂的嗜中性粒細胞細胞外誘捕網(wǎng)(net)(brinkmannv.等，science2004；303(5663):p.1532-5)?？梢詫⒔M蛋白釋放到患者血流中的其他機制包括細胞的凋亡、壞死、焦亡或壞死性凋亡。

一旦組蛋白被釋放到細胞外空間中并進入循環(huán)之后，它們激發(fā)出它們的促炎性和毒性潛力(xuj.等，natmed2009；15:1318-1321；abramsst.等，jimmunol2013；191(5):2495-502)。各種研究揭示，循環(huán)組蛋白不僅具有抗微生物性質(zhì)，而且在炎性和傳染性疾病、與創(chuàng)傷相關(guān)的損傷、以無菌性炎癥為特征的病癥、器官損傷、自體免疫疾病、癌癥和視網(wǎng)膜脫落中發(fā)揮病理作用(wo2009/062948；us8,716,218；millerb.f.等，science1942；96(2497):p.428-430.；hirsch,j.g.jexpmed1958；108(6):p.925-44.；allamr.等，jmolmed2014；92:465-472.；xuj.等，natmed2009；15:1318-1321；abramsst.等，jimmunol2013；191(5):2495-502；huangh.等，hepatology2011；54:999–1008.；kangr.等，gastroenterology2014；146:1097–1107.；wenz.等，jcellbiochem2013；114:2384–2391.；xuj.等，jimmunol2011；187:2626–2631.；demeyersf.等，arteriosclerthrombvascbiol2012；32:1884–1891.；barreroca.等，amjrespircritcaremed2013；188:673–683；allamr.等，jamsocnephrol2012；23:1375–1388；bosmannm.等，fasebj2013；27:5010–5021；allamr.等，eurjimmunol2013；43:3336–3342；kawanoh.等，labinvest2014；94:569–585；monachpa.等，procnatlacadsciusa2009；106:15867–15872；hakkima.等，procnatlacadsciusa2010；107:9813–9818；kessenbrockk.等，natmed2009；15:623–625；holdenrieders.等，intjcancer2001；95:114–120)。

組蛋白可以充當生物標志物用于早期疾病識別和/或惡化以及潛在的治療靶點(chenr.等，celldeathanddisease2014；5:e1370；xuj.等，natmed2009；15:1318-1321)。

缺少自由循環(huán)組蛋白的可用且可靠的定量工具，阻礙了對這些潛在生物標志物的臨床用途的評估。血液來源的患者樣品中的循環(huán)組蛋白，僅僅通過使用western印跡分析或通過使用酶聯(lián)免疫測定法測定核小體(與dna結(jié)合的組蛋白八聚體——蛋白質(zhì)dna復(fù)合物)水平來間接測量(zeerleders.等，critcaremed2003；31(7):p.1947-51；kutcherm.e.等，jtraumaacutecaresurg2012；73(6):p.1389-94；zeerleders.,critcare2006；10(3):p.142；wo2009061918)。由于高成本、復(fù)雜的技術(shù)要求和獲得結(jié)果的時間長，western印跡分析在臨床常規(guī)中的使用非常有問題。此外，它需要多個步驟，因此易于產(chǎn)生主觀結(jié)果。也已在病理過程中檢測了核小體水平。盡管組蛋白反映出核小體的基本部分，但完整的核小體是無毒的(abramsst.等，amjrespcritcaremed2013；187:160-169)。核小體測定法檢測與dna復(fù)合的組蛋白。因此，核小體檢測不給出關(guān)于自由循環(huán)的組蛋白或其片段的量的信息。

翻譯后修飾的組蛋白可以通過質(zhì)譜測量技術(shù)來檢測(sidolis.等，jproteomics2012；75(12):3419-3433；villar-gareaa.等，currprotocproteinsci2008；chapter14:unit1410)。對于來自于體外培養(yǎng)的組織培養(yǎng)物的高度純化的樣品來說，也已顯示了通過使用質(zhì)譜(ms)技術(shù)(buschows.i.等，immunolcellbiol2010；88(8):p.851-6)或通過以前的凝膠電泳(xuj.等，natmed2009；15:1318-1321)檢測外泌體中的組蛋白。

使用ms在本源的患者血漿樣品中定量測量組蛋白據(jù)報道是不成功的，這是由于高豐度的血漿蛋白干擾了組蛋白的檢測。此外，即使剝離了主要的豐富蛋白質(zhì)也沒有提高患者血漿樣品中的組蛋白可檢測性(ekaneym.等，critcare2014；18(5):p.543)。

對于質(zhì)譜測量來說，在分析和定量靶蛋白之前通常進行化學(xué)衍生(yuanz.f.等，annurevanalchem(paloaltocalif)2014；7:113-128；garciab.a.等，natprotoc2007；2(4):933-938.；wo2013/148178)。然而，尚未描述在沒有任何化學(xué)修飾或標記的生物流體中的定量方法。

在現(xiàn)有技術(shù)中，已描述了幾種用于區(qū)分sirs與膿毒癥的生物標志物(wo2009/062948)。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及用于生物樣品例如血液來源的樣品中的細胞外組蛋白的定量測量的靈敏的檢測方法。本文中描述的檢測方法可以靶向不是大分子復(fù)合物例如核小體或嗜中性粒細胞細胞外誘捕網(wǎng)(net)的一部分的游離的循環(huán)組蛋白。所述方法不需對所述樣品中蛋白質(zhì)混合物的復(fù)雜度進行任何降低，例如通過免疫沉淀進行初始組蛋白捕獲或通過凝膠電泳進行分離。通過分析“本源”樣品，本發(fā)明的方法避免了結(jié)合到非靶蛋白例如白蛋白的組蛋白或組蛋白來源的肽的非故意移除。因此，所描述的方法能夠通過檢測血清和血漿蛋白質(zhì)組的復(fù)雜本源混合物中的組蛋白來源的肽，進行組蛋白的精確和標準化的定量。此外，所述方法可以應(yīng)用于(危重)患者的臨床評估。本發(fā)明涉及一種檢測游離組蛋白的方法。這種方法檢測例如當組蛋白組裝在核小體中時不可接近的組蛋白的表位或肽片段。此外或可選地，所述組蛋白的待檢測表位或肽片段可能具有或可能不具有翻譯后修飾，優(yōu)選地，所述組蛋白的待檢測表位或肽片段不具有翻譯后修飾。

本發(fā)明的方法可用于疾病或醫(yī)學(xué)病癥的診斷、預(yù)后、風(fēng)險評估、危險分層和/或療法控制。在隨附的實施例中，證實了本發(fā)明的基于免疫測定法和質(zhì)譜法的測定法檢測患有疾病或醫(yī)學(xué)病癥的受試者的樣品中的游離組蛋白；參見說明圖1、2和8。

所述游離組蛋白或其片段的檢測可以使用任何適合的方法例如基于免疫測定法或質(zhì)譜法(ms)的方法來進行。

具體來說，本發(fā)明提供了一種利用本發(fā)明的方法檢測游離組蛋白的免疫測定方法，所述方法包括下述步驟：a)將所述樣品與特異性針對所述游離組蛋白的表位的第一抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物和特異性針對所述游離組蛋白的表位的第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物相接觸，以及b)檢測所述兩種抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物與所述游離組蛋白的結(jié)合。

本發(fā)明還涉及用于檢測游離組蛋白的基于質(zhì)譜法(ms)的方法。

本發(fā)明還涉及抗體和試劑盒及其在本發(fā)明的方法中的應(yīng)用。

附圖說明

圖1：使用免疫測定法確定來自于健康志愿者的血清樣品和來自于被測試為pct陽性的患者的樣品中的組蛋白h4濃度的典型結(jié)果。

圖2：檢測樣品中的組蛋白h4的免疫測定法h4-li-9-ab31830(v1)與h4-rr-13-ab31830(v2)的比較。

圖3：檢測樣品中的組蛋白h4的免疫測定法h4-li-9-ab31830(v1)與h4-rr-13-ab31830(v2)的關(guān)聯(lián)性。

圖4：在零血清中檢測組蛋白h4的免疫測定法h4-li-9-ab31830(v1)與h4-rr-13-ab31830(v2)的劑量響應(yīng)曲線的比較。

圖5：srm與免疫測定法之間的關(guān)聯(lián)性。

圖6：使用與圖1中相同的樣品，使用rochecelldeathdetectionelisa(#11544675001)測定的核小體濃度。

圖7：本發(fā)明的夾心免疫測定法和srm測定法與可商購的rochecelldeathdetectionelisa(#11544675001)之間的比較，顯示出檢測到的是游離組蛋白而不是核小體。

圖8：通過肽vflenvir(seqidno：4)的srm測量，在來自于健康志愿者的血清樣品和來自于患有膿毒癥的患者的樣品中確定的組蛋白h4濃度的結(jié)果。

圖9：來自于患有膿毒癥的患者的血清樣品中組蛋白h4肽vflenvir(seqidno：4)的srm曲線(skyline軟件)。頂部的圖表示內(nèi)源肽的4個躍遷。底部的圖表示重摻雜肽的相應(yīng)的4個躍遷。

圖10：來自于組蛋白h4的肽vflenvir(seqidno：4)的校準曲線。將恒定量的從重組h4消化獲得的輕肽與變化量的相應(yīng)的重肽摻混，以產(chǎn)生一套濃度標準品。

發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及一種用于在受試者的生物樣品中檢測游離組蛋白的方法。所述方法是基于所述組蛋白的表位或肽片段的檢測。

本發(fā)明還涉及一種用于疾病或醫(yī)學(xué)病癥的診斷、預(yù)后、風(fēng)險評估、危險分層和/或療法控制的方法，所述方法包括檢測受試者的生物樣品中的游離組蛋白或其肽片段，其中所述游離組蛋白或其片段的存在指示所述疾病或醫(yī)學(xué)病癥。

當在本文中使用時，術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。

術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及在晚些時候被修飾的氨基酸例如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸絲氨酸。在本文中，氨基酸可以用它們通常已知的三字母符號或由iupac-iub生物化學(xué)命名委員會(iupac-iubbiochemicalnomenclaturecommission)推薦的單字母符號來指稱。

在本發(fā)明的任一方法中待檢測的組蛋白涵蓋了標準的組蛋白及其同工型/變體。優(yōu)選地，待檢測的游離組蛋白或其肽片段選自h1、h2a、h2b、h3、h4及其同工型，更優(yōu)選為h2a或h4。甚至更優(yōu)選地，檢測跨越符合seqidno：23的組蛋白h2a的20至55位或70至118位氨基酸殘基的序列中的表位或肽片段，或跨越符合seqidno：1的游離組蛋白h4的22至102位、更優(yōu)選地46至102位氨基酸殘基的序列中的表位或肽片段。

當在本文中使用時，組蛋白變體是組蛋白的標準或常規(guī)變體。具有一個或幾個(最多2、4、6或8個)氨基酸交換的非標準(非等位基因)組蛋白，與它們的常規(guī)對應(yīng)物相比以非常低的水平表達。組蛋白變體具有特定的表達、定位和種分布情況，并為核小體提供新的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，影響染色質(zhì)重塑和組蛋白翻譯后修飾。在核心組蛋白中，h2a具有最大的變體數(shù)目，包括h2a.z、macroh2a、h2a-bbd、h2avd和h2a.x，而組蛋白h4是進化最慢的蛋白質(zhì)之一，并且組蛋白h4似乎不存在已知的序列變體。

在本發(fā)明的情形中，“游離組蛋白”涵蓋了未組裝在大分子復(fù)合體例如核小體或嗜中性粒細胞細胞外誘捕網(wǎng)(net)中的組蛋白。因此，在本發(fā)明的情形中，游離組蛋白以所述組蛋白的區(qū)域可以利用本發(fā)明的方法來檢測為特征，所述區(qū)域在組裝的化學(xué)計量的大分子復(fù)合體例如單核小體或八聚體中是不可接近的。在這種情形中，“化學(xué)計量的”涉及完整的復(fù)合體，例如單核小體或八聚體?！皀et”是嗜中性粒細胞細胞外誘捕網(wǎng)(brinkmannv.等，science303(5663):p.1532-5,2004)。net的骨架由從自殺的嗜中性粒細胞釋放的染色質(zhì)構(gòu)造而成，并采取基于dna的線纜的形式。除了dna之外，一些蛋白質(zhì)例如組蛋白在這些net中形成球形結(jié)構(gòu)域。微生物被受到刺激產(chǎn)生net的嗜中性粒細胞培養(yǎng)物殺死。“游離組蛋白”還包含未被染色質(zhì)結(jié)合的組蛋白。即“游離組蛋白”還可以包含net中纏結(jié)的單個組蛋白或非八聚體組蛋白復(fù)合體。游離組蛋白被稱為單體、異二聚體或四聚體組蛋白，其未組裝在由結(jié)合到核酸的組蛋白八聚體構(gòu)成的(“化學(xué)計量的”)核小體復(fù)合體中。因此，游離組蛋白被定義為僅僅以單體和/或同二聚體和異二聚體和/或同四聚體和異四聚體的形式存在的單獨的組蛋白，而結(jié)合的組蛋白被定義為并入到由通過疏水相互作用發(fā)生相互作用的各兩個分子的h2a、h2b、h3和h4構(gòu)成的核小體的八聚體核心中的組蛋白。在后一種情況下，組蛋白的中心區(qū)域被覆蓋并且在空間上不可接近，因為這些區(qū)域參與各個組蛋白分子之間的分子內(nèi)相互作用。

游離組蛋白可能被短暫地結(jié)合到單個組蛋白，例如組蛋白可能形成同二聚體，或者h3與h4或h2a與h2b可能形成異二聚體。符合本發(fā)明的游離組蛋白也可能形成同四聚體或異四聚體。同四聚體或異四聚體由4個分子的組蛋白例如h2a、h2b、h3和/或h4構(gòu)成。典型的異四聚體由兩個異二聚體形成，其中每個異二聚體由h3和h4構(gòu)成。在本文中還應(yīng)該理解，異四聚體可能由h2a和h2b形成。在本文中還設(shè)想了異四聚體可能由一個由h3和h4構(gòu)成的異二聚體和一個由h2a和h2b構(gòu)成的異二聚體形成。在本文中應(yīng)該理解，所述游離組蛋白可以是組蛋白變體，或者可以被發(fā)現(xiàn)與組蛋白變體相結(jié)合。在本發(fā)明的某些情況下，游離組蛋白例如組蛋白的單體、二聚體或四聚體，與核酸例如dna結(jié)合。因此，本發(fā)明的抗體和方法可以檢測獨立于結(jié)合的核酸的游離組蛋白。

正如上面提到的，在本文中應(yīng)該理解，游離組蛋白不是與核小體相關(guān)的八聚體的一部分。所述八聚體是由兩個h2a和h2b的二聚體和一個h3和h4的四聚體構(gòu)成的核小體的蛋白質(zhì)核心粒子。實施例4證實了基于免疫測定法的方法及其利用的抗體不檢測作為核小體的八聚體核心的一部分時的組蛋白，例如h4。同樣地，通過符合本發(fā)明的基于質(zhì)譜法的方法檢測的肽例如seqidno：3和4，源自于游離組蛋白。這些檢測的肽是當組蛋白作為八聚體的一部分時將被埋藏并因此不可被例如蛋白酶接近的組蛋白部分；參見例如實施例3和7。

游離組蛋白也可以短暫地與高豐度血漿蛋白包括白蛋白、血清淀粉樣肽a、inter-α抑制蛋白、toll樣受體、正五聚蛋白例如血清淀粉樣肽p和c-反應(yīng)蛋白發(fā)生相互作用，其通過主要在組蛋白的n-端處的帶正電荷的殘基的離子相互作用驅(qū)動。因此，當結(jié)合到血漿蛋白時，游離組蛋白仍然可以被針對中央?yún)^(qū)域和c端的抗體接近。

正如在隨附的實施例中證實的，本文中提供了檢測游離組蛋白的測定法、試劑盒和抗體。例如，游離組蛋白通過組蛋白例如h2a和h4的在化學(xué)計量的大分子復(fù)合體例如八聚體中基本上不可接近的區(qū)域來檢測；參見例如實施例3和4。在本文中應(yīng)該理解，組蛋白的區(qū)域是在游離組蛋白中可接近，但在組蛋白處于大分子復(fù)合體例如八聚體中的情況下基本上不可接近的多肽區(qū)段。在隨附的實施例中，證實了方法例如免疫測定法以及基于質(zhì)譜法的測定法適用于檢測游離組蛋白。具體來說，在本文中示出了在所述基于免疫測定法的方法中使用的示例性抗體特異性針對游離組蛋白。因此，與存在于例如八聚體或核小體中的結(jié)合的組蛋白相比，本發(fā)明的抗體對游離組蛋白具有更高的結(jié)合親和性。在隨附的實施例中顯示，所述示例性抗體結(jié)合到組蛋白的僅僅在游離組蛋白中可接近的區(qū)域。具體來說，在實施例4中證明了符合本發(fā)明的基于免疫測定法的方法和其中使用的抗體檢測游離組蛋白例如h4，但是當所述組蛋白是八聚體核心的一部分時不檢測所述組蛋白。

游離組蛋白也可以利用質(zhì)譜測量法來檢測。正如對基于免疫測定法的方法所顯示的，可以通過質(zhì)譜法檢測作為游離組蛋白的切割產(chǎn)物的肽；參見例如說明性實施例4。換句話說，這些肽從游離組蛋白產(chǎn)生。不希望受到理論限制，可以在本發(fā)明的某些情況中用于產(chǎn)生蛋白水解消化物以準備用于質(zhì)譜測量分析的蛋白酶，當組蛋白處于大分子復(fù)合體例如八聚體中時不能接近中央?yún)^(qū)域的肽。換句話說，所述蛋白酶由于空間位阻不能滲透到這些切割位點。因此，這種方法檢測代表游離組蛋白的肽，例如中央?yún)^(qū)域的肽。

在隨附的實施例中證實，本發(fā)明的測定法、試劑盒和抗體檢測在游離組蛋白中可接近的游離組蛋白的肽或表位。這些氨基酸區(qū)段在本文中也被稱為組蛋白的中央?yún)^(qū)域或部分。在下文中，描述了可用于利用本文中提供的方法檢測游離組蛋白的肽或表位?？捎糜谕ㄟ^本文中提供的方法檢測游離組蛋白的示例性的肽或表位是在跨越符合seqidno：1的組蛋白h4的22至102位氨基酸殘基或符合seqidno：23的組蛋白h2a的20至118位氨基酸殘基的序列中的表位或肽片段。此外，可用于通過本文中提供的方法檢測游離組蛋白的示例性的肽或表位可以是在跨越符合seqidno：36的組蛋白h3的27至62位氨基酸殘基或符合seqidno：31的組蛋白h2b的41至69位氨基酸殘基的序列中的表位或肽片段。更優(yōu)選地，游離組蛋白h4通過選自跨越seqidno：1的22至30位殘基、seqidno：1的67至78位殘基、seqidno：1的92至102位殘基、seqidno：1的22至34位殘基、seqidno：1的46至102位殘基、seqidno：1的46至55位殘基、seqidno：1的60至67位殘基、seqidno：1的80至91位殘基、seqidno：1的24至35位殘基和seqidno：1的68至77位殘基的氨基酸序列的肽或表位來檢測。

游離組蛋白h2a優(yōu)選地通過選自跨越seqidno：23的21至53位殘基、seqidno：23的21至29位殘基、seqidno：23的30至53位殘基、seqidno：23的120至129位殘基、seqidno：23的21至29位殘基、seqidno：23的82至88位殘基、seqidno：23的89至95位殘基和seqidno：23的100至118位殘基的氨基酸序列的肽或表位來檢測。

游離組蛋白h2b優(yōu)選地通過跨越seqidno：31的41至69位殘基的肽或表位來檢測。

游離組蛋白h3優(yōu)選地通過跨越seqidno：36的27至37位殘基和/或跨越seqidno：36的52至62位殘基的肽或表位來檢測。

當在本文中使用時，術(shù)語“染色質(zhì)”是指包含細胞基因組的核蛋白結(jié)構(gòu)。細胞染色質(zhì)包含核酸、主要是dna，以及蛋白質(zhì)，包括組蛋白和非組蛋白染色體蛋白質(zhì)。大多數(shù)真核細胞染色質(zhì)以核小體的形式存在，其中核小體核心包含約150個堿基對的dna，其與包含組蛋白h2a、h2b、h3和h4各兩個的八聚體相結(jié)合；并且在核小體核心之間延伸有連接dna(取決于生物體具有可變的長度)。組蛋白h1的分子一般與連接dna相結(jié)合。“染色體”是包含細胞的全部或一部分基因組的染色質(zhì)復(fù)合體。

在本文中，術(shù)語“核小體”或“核小體復(fù)合物”意味著染色質(zhì)的基本單位，其由周圍被約150個堿基對的dna纏繞的四種核心組蛋白h3、h4、h2a和h2b的八聚體構(gòu)成。

所檢測的表位優(yōu)選地可以是當組蛋白組裝在核小體中時不可接近的表位。如上所述，在本發(fā)明的情形中，“不可接近”意味著當組蛋白是核小體復(fù)合物的一部分時，所述表位不能被配體、特別是被抗體特異性結(jié)合。還涵蓋了當組蛋白是核小體復(fù)合物的一部分時由于空間位阻而在結(jié)構(gòu)上不可接近的表位。

在本發(fā)明的情形中，術(shù)語“片段”是指可源自于較大蛋白質(zhì)或肽的較小蛋白質(zhì)或肽，因此其包含所述較大蛋白質(zhì)或肽的部分序列。所述片段可以從較大的蛋白質(zhì)或肽，通過其一個或多個肽鍵的水解來衍生。所述片段優(yōu)選地具有至少6、9、10或12個殘基。

在本文中，術(shù)語“樣品”是生物樣品。當在本文中使用時，“樣品”可以例如是指出于目標受試者例如患者的診斷、預(yù)后或評估的目的而獲得的體液或組織的樣品。

優(yōu)選地，在本文中，樣品是受試者的體液或組織的樣品。體液樣品是優(yōu)選的。優(yōu)選的試驗樣品包括血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液、痰液和胸腔積液。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認識到，某些試驗樣品在分級或純化程序例如將全血分離成血清或血漿組分后，將更容易分析。

因此，優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用的樣品選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品、腦脊液樣品、唾液樣品、尿液樣品、組織樣品或任何上述樣品的提取物。

優(yōu)選地，所述樣品是血液樣品，更優(yōu)選為血清樣品或血漿樣品。在本發(fā)明的情形中，血清樣品是最優(yōu)選的樣品。

在適合的情況下，在本發(fā)明中使用之前，所述樣品可以被均化或用溶劑萃取，以便獲得液體樣品。在本文中，液體樣品可以是溶液或懸液。液體樣品在用于本發(fā)明之前，可以進行一種或多種預(yù)處理。這些預(yù)處理包括但不限于稀釋、過濾、離心、濃縮、沉降、沉淀或透析。預(yù)處理還可以包括向所述溶液添加化學(xué)或生物化學(xué)物質(zhì)，例如酸、堿、緩沖劑、鹽、溶劑、反應(yīng)性染料、去污劑、乳化劑、螯合劑。

在本發(fā)明的情形中，“血漿”是在離心后獲得的含有抗凝劑的血液的事實上無細胞的上清液。示例性的抗凝劑包括鈣離子結(jié)合性化合物例如edta或檸檬酸鹽和凝血酶抑制劑例如肝素鹽或水蛭素。無細胞血漿可以通過抗凝化血液(例如檸檬酸化、edta或肝素化血液)的離心，例如在2000至3000g離心至少15分鐘來獲得。

在本發(fā)明的情形中，“血清”是在允許血液凝結(jié)后收集的全血的液體級分。當將凝結(jié)的血液(凝血)離心時，血清可以作為上清液獲得。

術(shù)語“患者”、“個體”和“受試者”在整個本發(fā)明中可以互換使用。出于本發(fā)明的目的，“患者”、“個體”或“受試者”包括人類和其他動物、特別是哺乳動物，以及其他生物體。因此，所述方法適用于人類診斷和獸醫(yī)應(yīng)用兩者。在優(yōu)選實施方式中，所述患者是哺乳動物，并且在最優(yōu)選實施方式中，所述患者或受試者是人類。當在本文中使用時，術(shù)語“患者”是指未接受醫(yī)療護理或正接受醫(yī)療護理或由于疾病或醫(yī)學(xué)病癥、特別是系統(tǒng)性炎癥而應(yīng)該接受醫(yī)療護理的活的人類或非人類生物體。這包括正被調(diào)查疾病征兆的沒有確定患病的人。因此，本文中描述的方法和測定法適用于人類和獸醫(yī)疾病兩者。

本文中使用的術(shù)語“表位”，也被稱為抗原決定簇，是指抗原的被抗體、b細胞或t細胞識別的部分。因此，“表位”意味著分子的抗體與其結(jié)合的部分，例如多肽區(qū)段。術(shù)語“表位”涵蓋了構(gòu)象表位和線性表位兩者。

在本發(fā)明的情形中，在本發(fā)明的方法中檢測的游離組蛋白或其肽片段可以被看作生物標志物，術(shù)語“生物標志物”是指可測量且可定量的生物學(xué)參數(shù)(例如特定酶的濃度、特定激素的濃度、特定基因表型在群體中的分布、生物物質(zhì)的存在)，其充當指數(shù)用于與健康和生理相關(guān)的評估，例如疾病風(fēng)險、精神障礙、環(huán)境暴露及其影響、疾病診斷、代謝過程、物質(zhì)濫用、妊娠、細胞系發(fā)育、流行病學(xué)研究等。此外，生物標志物被定義為作為正常生物學(xué)過程、病理過程或?qū)χ委熜愿深A(yù)的藥理響應(yīng)的指示物而被客觀測量和評估的特征。生物標志物可以在生物樣品上測量(作為血液、尿液或組織化驗)，并且它可以是從人獲得的記錄(血壓、ecg或holter)。生物標志物可以指示各種不同的健康或疾病特征，包括暴露于環(huán)境因素的水平或類型、遺傳易感性、對暴露的遺傳響應(yīng)、亞臨床或臨床疾病的生物標志物或?qū)Ο煼ǖ捻憫?yīng)的指示物。因此，考慮生物標志物的簡化方式是作為疾病性狀(風(fēng)險因子或風(fēng)險生物標志物)、疾病狀態(tài)(臨床前或臨床)或疾病速率(進展)的指示物。因此，生物標志物可以被分類為先行生物標志物(鑒定發(fā)生疾病的風(fēng)險)、篩查生物標志物(亞臨床疾病的篩查)、診斷生物標志物(識別外顯疾病)、分期生物標志物(對疾病的嚴重性分類)或預(yù)后生物標志物(預(yù)測將來的疾病過程，包括復(fù)發(fā)和對療法的響應(yīng)，以及監(jiān)測療法的效能)。生物標志物也可充當替代終點。替代終點是在臨床試驗中可用作結(jié)果以代替真正的目標結(jié)果的測量來評估療法的安全性和有效性的終點。隱含的原理是替代終點的變化密切追蹤目標結(jié)果的變化。替代終點與諸如發(fā)病率和死亡率這些需要大型臨床試驗來評估的終點相比，具有可以在較短的時間框中并以較少的成本來收集的優(yōu)點。替代終點的其他價值包括它們與更遠的臨床事件相比，更接近目標暴露/干預(yù)并且可以更容易進行因果關(guān)聯(lián)的事實。替代終點的一個重要缺點在于如果目標臨床結(jié)果受到大量因素(除了替代終點之外)影響，則殘留的迷惑性可能降低替代終點的有效性。已建議，如果替代終點可以解釋至少50％的暴露或干預(yù)對目標結(jié)果的影響，則它的有效性更大。例如，生物標志物可以是蛋白質(zhì)、肽或核酸分子。在本發(fā)明的情形中，游離組蛋白可以與其他生物標志物一起使用，即游離組蛋白可以是生物標志物組的一部分。

在本發(fā)明的情形中，“診斷”是指受試者中的疾病或臨床病癥的識別和(早期)檢測，并且也可以包括差異診斷。在某些實施方式中，疾病或臨床病癥的嚴重性的評估，也可以被術(shù)語“診斷”所涵蓋。

“預(yù)后”是指患有特定疾病或臨床病癥的受試者的結(jié)果或特定風(fēng)險的預(yù)測。這可以包括所述受試者的恢復(fù)機會或不利結(jié)果的機會的估算。

本發(fā)明的方法也可用于監(jiān)測?！氨O(jiān)測”是指保持追蹤已經(jīng)診斷的疾病、障礙、并發(fā)癥或風(fēng)險，以例如分析所述疾病的進展或特定治療對疾病或障礙的進展的影響。

在本發(fā)明的情形中，術(shù)語“療法控制”是指所述患者的治療性治療的監(jiān)測和/或調(diào)整。

在本發(fā)明中，術(shù)語“風(fēng)險評估”和“危險分層”是指按照受試者的進一步預(yù)后將它們分成不同的風(fēng)險組。風(fēng)險評估還涉及為應(yīng)用預(yù)防性和/或治療性措施而分層。

此外或可選地，在本發(fā)明的方法中，所述待檢測的游離組蛋白的表位或肽片段沒有翻譯后修飾。

在本發(fā)明的情形中，術(shù)語“翻譯后修飾”或“ptm”是指在蛋白質(zhì)被核糖體的翻譯完成后，通過酶的催化在其上發(fā)生的修飾。翻譯后修飾通常是指將官能團共價添加到蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，在本發(fā)明的情形中，組蛋白的“翻譯后修飾”是例如通過乙?；D(zhuǎn)移酶、賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和賴氨酸去甲基化酶引入的修飾。優(yōu)選地，在本發(fā)明的情形中，翻譯后修飾選自乙?；⒐习彼峄?、脫乙?；?、甲基化、去甲基化、脫亞胺化、異構(gòu)化、磷酸化和遍在蛋白化。

在本發(fā)明的診斷、預(yù)后和風(fēng)險評估方法的情形中，可以另外分析至少一種臨床參數(shù)，其中所述臨床參數(shù)選自體溫、血壓、心率、白細胞數(shù)。

在本發(fā)明的診斷、預(yù)后和風(fēng)險評估方法的情形中，可以另外分析至少一種生物標志物，其中所述生物標志物選自降鈣素、腎上腺髓質(zhì)素(adm/proadm)、內(nèi)皮素-1(et-1)、精氨酸加壓素(avp)、心房利鈉肽(anp)、嗜中性粒細胞明膠酶相關(guān)性脂質(zhì)運載蛋白(ngal)、肌鈣蛋白、腦利鈉肽(bnp)、c-反應(yīng)性蛋白(crp)、胰石蛋白(psp)、髓樣細胞上表達的觸發(fā)性受體1(trem1)、白介素-6(il-6)、白介素-20(il-20)、白介素-22(il-22)、白介素-24(il-24)、其他il、presepsin、脂多糖結(jié)合蛋白(lbp)、α-1-抗胰蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶2(mmp2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(mmp9)和腫瘤壞死因子α(tnfα)。優(yōu)選地，至少一種生物標志物選自降鈣素原(pct)、腎上腺髓質(zhì)素(adm/proadm)、presepsin(scd14-st)和c反應(yīng)性蛋白(crp)。

本發(fā)明的任一方法的疾病或醫(yī)學(xué)病癥可以選自涉及個體的系統(tǒng)性炎性響應(yīng)(sirs)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥，所述炎性響應(yīng)涉及感染性和非感染性病因例如由微生物刺激物即細菌、病毒、真菌或寄生蟲引起的膿毒癥、重癥膿毒癥和膿毒性休克，創(chuàng)傷性損傷和/或出血，缺血再灌注損傷，燒傷，急性胰腺炎，以及介入治療例如心肺轉(zhuǎn)流術(shù)、化療和放療，其中個體處于發(fā)生內(nèi)皮組織損傷、血栓栓塞和急性播散性血管內(nèi)凝血(dic)的風(fēng)險，在疾病的過程中造成單一或多個器官機能障礙和衰竭(特別是急性腎損傷、急性肺損傷和肝損傷)。

在本發(fā)明的情形中，“系統(tǒng)性炎癥”優(yōu)選地是指以促炎性細胞因子的釋放和可以由生物因子、化學(xué)因子或遺傳因子引起的先天免疫系統(tǒng)的激活為特征的病癥。嚴重的“系統(tǒng)性炎癥”可以引起器官衰竭和死亡。

在本發(fā)明的情形中，“sirs”是沒有感染跡象的系統(tǒng)性炎性響應(yīng)綜合征。它包括但不限于超過一種下述臨床表象：(1)體溫高于38℃或低于36℃；(2)心率高于每分鐘90次；(3)呼吸急促，表現(xiàn)為呼吸率超過每分鐘20次呼吸，或換氣過度，由低于32mmhg的paco2所指示；以及(4)白細胞計數(shù)的變化，例如計數(shù)超過12,000/mm³，計數(shù)低于4,000/mm³，或存在超過10％的未成熟的嗜中性粒細胞(bone等，chest101(6):1644-55,1992)。

在本發(fā)明的情形中，“膿毒癥”意味著對感染的系統(tǒng)性響應(yīng)?；蛘?，膿毒癥可以被看作sirs與已確認的感染過程的組合。膿毒癥可以被表征為由感染和系統(tǒng)性炎性響應(yīng)兩者的存在所定義的臨床綜合征(levymm等，2001sccm/esicm/accp/ats/sisinternationalsepsisdefinitionsconference.critcaremed.2003apr；31(4):1250-6)。本文中使用的術(shù)語“膿毒癥”包括但不限于膿毒癥、重癥膿毒癥、膿毒性休克。在這種情形中，重癥膿毒癥意味著伴有器官機能障礙、低灌注異?；蚰摱景Y誘導(dǎo)的低血壓的膿毒癥。低灌注異常包括乳酸血癥、少尿和精神狀態(tài)的急性變化。膿毒癥誘導(dǎo)的低血壓由在不存在低血壓的其他原因(例如心源性休克)的情況下出現(xiàn)收縮壓低于90mmhg或從基線降低40mmhg或以上所定義。膿毒性休克被定義為盡管使用足夠的液體復(fù)蘇但膿毒癥誘導(dǎo)的低血壓仍持續(xù)，并伴隨著低灌注異?；蚱鞴贆C能障礙的出現(xiàn)的重癥膿毒癥(bone等，chest101(6):1644-55,1992)。本文中使用的術(shù)語“膿毒癥”涉及膿毒癥發(fā)展中的所有可能階段。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，上述“感染”意味著由病原性或潛在病原性微生物侵入正常情況下無菌的組織或流體而引起的病理過程，并涉及由細菌、真菌、寄生蟲和/或病毒引起的感染。

在本發(fā)明的情形中，“胰腺炎”可以被看作胰腺的炎癥，其發(fā)展從急性(突然發(fā)作；持續(xù)時間<6個月)到復(fù)發(fā)性急性(>1次急性胰腺炎發(fā)作期)到慢性(持續(xù)時間>6個月)。在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括但不限于家族性胰腺炎、遺傳性胰腺炎和特應(yīng)性偶發(fā)胰腺炎。

在本發(fā)明的情形中，術(shù)語“多發(fā)傷”涵蓋在身體的至少兩個區(qū)域中具有兩個或更多個嚴重損傷的病癥，或具有多個損傷、即在一個身體區(qū)域中的兩個或更多個嚴重損傷的病癥。多發(fā)傷可能伴有創(chuàng)傷性休克和/或出血性低血壓和一種或多種生命機能的嚴重危險。兩個或更多個損傷中的至少一個或所有損傷的總和危及具有多發(fā)傷的受傷受試者的生命(kroupaj.,actachirorthoptraumatolcech.1990jul；57(4):347-60)。在本發(fā)明的情形中，所述疾病或病癥優(yōu)選為系統(tǒng)性炎癥，更優(yōu)選為膿毒癥或sirs。

正如上面提到的，游離組蛋白可以使用任何適合的方法來檢測。在本發(fā)明的情形中，基于免疫測定法的方法和基于質(zhì)譜法的方法是特別優(yōu)選的，并且將在下文中更詳細描述：

基于免疫測定法的方法

本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的任何方法的免疫測定法。具體來說，所述免疫測定法包括下述步驟：a)將所述樣品與特異性針對所述游離組蛋白靶的第一表位的第一抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物和特異性針對所述游離組蛋白靶的第二表位的第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物相接觸，以及b)檢測所述兩種抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物與所述游離組蛋白的結(jié)合。這種測定法的一個實例是夾心elisa測定法。

在本文中，除非另有指明，否則術(shù)語“抗體”也包含抗原結(jié)合片段或衍生物。

或者，代替抗體，本發(fā)明的范圍可以涵蓋特異性和/或選擇性識別組蛋白序列、組蛋白表位和組蛋白的結(jié)構(gòu)構(gòu)象的其他捕獲分子或分子支架。

在本文中，術(shù)語“捕獲分子”或“分子支架”包含可用于從樣品結(jié)合靶分子或目標分子、即被分析物(在本發(fā)明的情形中，即游離組蛋白)的分子。因此，捕獲分子必須在空間上和表面特點例如表面電荷、疏水性、親水性、路易斯供體和受體的存在或不存在兩方面充分塑造，以特異性結(jié)合所述靶分子或目標分子。在這里，所述結(jié)合可以例如由所述捕獲分子或分子支架與靶分子或目標分子之間的離子、范德華、π-π、σ-π、疏水或氫鍵相互作用或兩種或更多種上述相互作用的組合或共價相互作用介導(dǎo)。在本發(fā)明的情形中，捕獲分子或分子支架可以例如選自核酸分子、糖類分子、pna分子、蛋白質(zhì)、肽和糖蛋白。捕獲分子或分子支架包括例如適體、darpin(設(shè)計的錨蛋白重復(fù)蛋白)、affimer等。

術(shù)語“抗體”通常包含單克隆抗體、遺傳工程改造的單克隆抗體和多克隆抗體及其結(jié)合片段，特別是fc-片段以及所謂的“單鏈抗體”(birdr.e.等，(1988)science242:423-6)，嵌合的、人源化的、特別是cdr嫁接的抗體，以及雙體或四體抗體(holligerp.等，(1993)proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:6444-8)?？贵w可以是天然存在的和非天然存在的。此外，抗體包括全合成抗體、單鏈抗體及其片段。抗體可以是人類或非人類的。非人類抗體可以通過重組方法人源化，以降低它們在人類中的免疫原性?？贵w片段包括但不限于fab和fc片段?！翱贵w的fc部分”可以是通過免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化獲得的可結(jié)晶片段，其由通過二硫鍵連接的兩條重鏈的c-端半條鏈構(gòu)成，并被稱為免疫球蛋白的“效應(yīng)區(qū)”?！翱贵w的fc部分”也可以意味著重鏈的所有或基本上所有的c-端半條鏈。還包含通過包括例如噬菌體展示的技術(shù)選擇的特異性結(jié)合到樣品中包含的目標分子的免疫球蛋白樣蛋白質(zhì)。在這種情形中，術(shù)語“特異的”和“特異性結(jié)合”指稱針對目標分子或其片段產(chǎn)生的抗體。如果抗體對目標分子(在這里是游離組蛋白)或其提到的片段的親和性比對含有目標分子的樣品中包含的其他分子的親和性高至少50倍、優(yōu)選地高100倍、最優(yōu)選地高至少1000倍，則所述抗體被認為是特異的。如何開發(fā)和選擇具有給定特異性的抗體，在本領(lǐng)域中是公知的。在本發(fā)明的情形中，單克隆抗體是優(yōu)選的。

正如將在下文中更詳細討論的，本發(fā)明的(第一和/或第二)抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物可以例如是多克隆抗體、單克隆抗體或遺傳工程改造的單克隆抗體。

所述抗體與游離組蛋白(或其片段)的結(jié)合發(fā)生在適合的條件下(即允許免疫反應(yīng)，即所述抗體與游離組蛋白的結(jié)合并形成免疫復(fù)合體的條件下)。這些條件對于專業(yè)技術(shù)人員來說是已知的，并且可以使用例如如下所述的免疫測定法的標準格式。這些條件優(yōu)選是在生理溫度、ph和離子強度下，并且可以在介質(zhì)例如磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中發(fā)生。

在說明性實施例1至4中，描述了用于檢測游離組蛋白的抗體和基于免疫測定法的方法。在隨附的實施例中證實，檢測游離組蛋白的表位可以是存在于跨越符合seqidno：1的組蛋白h4的22至102位氨基酸殘基或符合seqidno：23的組蛋白h2a的20至118位氨基酸殘基的序列中的表位。此外，檢測游離組蛋白的表位可以是存在于跨越符合seqidno：36的組蛋白h3的27至62位氨基酸殘基或符合seqidno：31的組蛋白h2b的41至69位氨基酸殘基的序列中的表位。

此外，本發(fā)明的免疫測定法可以優(yōu)選地利用特異性針對游離組蛋白h4的表位的第一抗體和/或第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，其中所述第一表位和/或第二表位是存在于跨越seqidno：1的22至102位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h4的表位。

此外，本發(fā)明的免疫測定法可以利用特異性針對游離組蛋白h2a的表位的第一抗體和/或第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，其中所述第一表位和/或第二表位是存在于跨越seqidno：23的21至53、20至118或120至129位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h2a的表位。

此外，本發(fā)明的免疫測定法可以利用特異性針對游離組蛋白h3的表位的第一抗體和/或第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，其中所述第一表位和/或第二表位是存在于跨越seqidno：36的27至63位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h3的表位。

更優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫測定法利用特異性針對游離組蛋白h4的表位的第一抗體和/或第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，其中所述表位選自跨越seqidno：1的22至30位殘基、seqidno：1的67至78位殘基、seqidno：1的92至102位殘基、seqidno：1的22至34位殘基和seqidno：1的46至102位殘基的氨基酸序列。

此外，本發(fā)明的免疫測定法優(yōu)選地利用特異性針對游離組蛋白h2a的表位的第一抗體和/或第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，其中所述表位選自跨越seqidno：23的21至53位殘基、seqidno：23的21至29位殘基、seqidno：23的30至53位殘基和seqidno：23的120至129位殘基的氨基酸序列。

此外，本發(fā)明的免疫測定法可以利用特異性針對跨越seqidno：31的41至69位殘基的游離組蛋白h2b的表位的第一抗體和/或第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物。

此外，本發(fā)明的免疫測定法可以利用特異性針對跨越seqidno：36的27至37位殘基和/或跨越seqidno：36的52至62位殘基的游離組蛋白h3的表位的第一抗體和/或第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物。

此外，本發(fā)明的免疫測定法優(yōu)選地利用特異性針對游離組蛋白h2a的表位的第一抗體和/或第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，所述表位存在于跨越由seqidno：23表示的組蛋白h2a序列的21至53位和/或120至129位殘基的序列中。換句話說，本發(fā)明的免疫測定法優(yōu)選地可以利用特異性針對存在于跨越由seqidno：23表示的組蛋白h2a序列的21至53位和/或120至129位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h2a的表位的第一抗體和/或第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物。

此外，本發(fā)明的免疫測定法可以利用特異性針對存在于跨越seqidno：1的22至102位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h4的表位的第一抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物，以及特異性針對游離組蛋白h2a、h2b或優(yōu)選地h3的表位的第二抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物。

此外，本發(fā)明的免疫測定法可以利用特異性針對存在于跨越seqidno：23的21至53位、120至129位或20至118位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h2a的表位的第一抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物，以及特異性針對游離組蛋白h3、h4或優(yōu)選地h2b的表位的第二抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物。

此外，本發(fā)明的免疫測定法可以利用特異性針對存在于跨越seqidno：36的27至62位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h3的表位的第一抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物，以及特異性針對游離組蛋白h4或優(yōu)選地h2a或h2b的表位的第二抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物。

在本文中理解，在本文中提供的免疫測定法的情形中，與“第一”和“第二”抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物相關(guān)的接觸步驟的順序可以改變。因此，在本文中理解，可以首先將所述“第二”抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物與所述樣品相接觸，隨后可以將所述“第一”抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物與所述樣品相接觸。在本文中還理解，可以將所述兩種抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物同時與所述樣品相接觸。

本發(fā)明的免疫測定法可以利用特異性針對存在于跨越seqidno：23的21至29位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h2a的表位的第一抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，和/或特異性針對存在于跨越seqidno：23的30至53位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h2a的表位的第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物。

本發(fā)明的免疫測定法優(yōu)選地也可以利用特異性針對存在于跨越seqidno：1的22至30位氨基酸殘基(對應(yīng)于肽h4-li-9，seqidno：10)或seqidno：1的46至102位殘基(對應(yīng)于seqidno：2)或seqidno：1的22至34位殘基的序列中存在的組蛋白h4的表位的第一抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，以及特異性針對跨越組蛋白h4(seqidno：1)的46至102位氨基酸殘基的序列中的表位的第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物。

本發(fā)明的免疫測定法可以利用特異性針對存在于跨越seqidno：1的20至30位氨基酸殘基或seqidno：1的67至78位殘基或seqidno：1的92至102位殘基或seqidno：1的22至34位殘基、優(yōu)選為seqidno：1的67至78位殘基的序列中的組蛋白h4的表位的第一抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，和/或特異性針對存在于跨越seqidno：1的46至102位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h4的表位的第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物。

優(yōu)選的檢測方法包括采取各種不同格式的免疫測定法，例如放射免疫測定法(ria)、化學(xué)發(fā)光和熒光免疫測定法、酶免疫測定法(eia)、酶聯(lián)免疫測定法(elisa)、基于發(fā)光的珠子陣列、基于磁珠的測定法、蛋白質(zhì)微陣列測定法、快速測試格式例如免疫層析試條測試。

本發(fā)明的測定法可以是均相或非均相測定法、競爭和非競爭測定法。在特別優(yōu)選的實施方式中，所述測定法采取夾心測定法的形式，這是一種非競爭免疫測定法，其中待檢測和/或定量的分子被結(jié)合到第一抗體并結(jié)合到第二抗體。所述第一抗體可以被結(jié)合到固相例如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或試條，并且所述第二抗體是例如用染料、放射性同位素或反應(yīng)性或催化活性組成部分標記的抗體，或反之亦然。然后通過適合的方法測量結(jié)合到被分析物的標記抗體的量。涉及“夾心測定法”的一般性組成和程序是已確立的，并且為專業(yè)技術(shù)人員所知(《免疫測定法手冊》(theimmunoassayhandbook)，ed.davidwild,elsevierltd,oxford；第三版(may2005),isbn-13:978-0080445267；hultschigc等，curropinchembiol.2006feb；10(1):4-10.pmid:16376134，通過參考并入本文)。

在本發(fā)明的情形中，所述測定法可以包含兩種捕獲分子、優(yōu)選為抗體，其兩者都作為在液體反應(yīng)混合物中的分散系存在，其中第一標記組分被附連到第一捕獲分子，其中所述第一標記組分是基于熒光或化學(xué)發(fā)光-淬滅或擴增的標記系統(tǒng)的一部分，并且所述標記系統(tǒng)的第二標記組分被附連到第二捕獲分子，使得在兩種捕獲分子結(jié)合到所述被分析物后，產(chǎn)生可測量的信號，其允許在包含所述樣品的溶液中檢測形成的夾心復(fù)合物。

優(yōu)選地，所述標記系統(tǒng)包含稀土穴狀化合物或稀土螯合物與熒光染料或化學(xué)發(fā)光染料、特別是花青素類型的染料的組合。

在本發(fā)明的情形中，基于熒光的測定法可以包括使用染料，其可以例如選自fam(5-或6-羧基熒光素)、vic、ned、熒光素、熒光素異硫氰酸酯(fitc)、ird-700/800、花青染料例如cy3、cy5、cy3.5、cy5.5、cy7、占噸、6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯熒光素(hex)、tet、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基熒光素(joe)、n,n,n’,n’-四甲基-6-羧基羅丹明(tamra)、6-羧基-x-羅丹明(rox)、5-羧基羅丹明-6g(r6g5)、6-羧基羅丹明-6g(rg6)、羅丹明、羅丹明綠、羅丹明紅、羅丹明110、bodipy染料例如bodipytmr、俄勒岡綠、香豆素類例如傘形酮、苯甲亞胺類例如hoechst33258、菲啶類例如德克薩斯紅、yakima黃、alexafluor、pet、溴乙菲啶、吖啶染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉燃料、聚甲炔染料等。

在本發(fā)明的情形中，基于化學(xué)發(fā)光的測定法包括使用基于在下述文獻中為化學(xué)發(fā)光材料所描述的物理原理的染料：kirk-othmer，《化學(xué)技術(shù)百科全書》(encyclopediaofchemicaltechnology)，第四版，執(zhí)行主編j.i.kroschwitz，主編m.howe-grant，johnwiley&sons,1993,vol.15,p.518-562，通過參考并入本文，包括在第551-562頁上的引用文獻。優(yōu)選的化學(xué)發(fā)光染料是吖啶酯。游離組蛋白可以例如在b.r.a.h.m.skryptor緊湊型plus儀器(thermoscientificb.r.a.h.m.sgmbh,hennigsdorf/berlin,germany)上，使用全自動夾心免疫測定法系統(tǒng)來檢測。這種隨機存取分析儀利用基于兩種熒光團之間的非放射活性轉(zhuǎn)移的靈敏的時間分辨擴增穴狀化合物發(fā)射(trace)技術(shù)。

本發(fā)明還涉及一種方法，其中所述抗體之一(例如第一抗體)被標記，并且另一種抗體(例如第二抗體)被結(jié)合到固相或者可以被選擇性結(jié)合到固相。然而，正如上面提到的，在本發(fā)明的方法的情形中，優(yōu)選地所述第一和第二抗體分散地存在于液體反應(yīng)混合物中，并且其中作為基于熒光或化學(xué)發(fā)光消光或擴增的標記系統(tǒng)的一部分的第一標記組分被結(jié)合到所述第一抗體，并且所述標記系統(tǒng)的第二標記組分被結(jié)合到所述第二抗體，使得在兩種抗體結(jié)合到組蛋白(或其片段)之后，產(chǎn)生可測量的信號，其允許檢測在測量溶液中得到的夾心復(fù)合物。

正如本文中提到的，“測定法”或“診斷測定法”可以是在診斷學(xué)領(lǐng)域中使用的任何類型。這種測定法可以基于待檢測的被分析物與具有一定親和性的一種或多種捕獲探針的結(jié)合。對于抗體與靶分子或目標分子之間的相互作用來說，親和常數(shù)優(yōu)選地高于10⁸m^-1。

本發(fā)明還涉及特異性針對上面已經(jīng)詳細描述的游離組蛋白或其片段的表位的如上所述的抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物。

隨附的實施例記錄了成功地用于檢測符合本發(fā)明的游離組蛋白的示例性抗體。因此，本發(fā)明涉及特異性針對游離組蛋白h4、h2a、h2b和/或h3的表位的抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物。此外，本發(fā)明涉及特異性針對游離組蛋白h4的表位的抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物，所述表位包含在跨越符合seqidno：1的組蛋白h4的22至102位氨基酸殘基的序列中。

此外，本發(fā)明涉及特異性針對游離組蛋白h4的表位的抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物，所述表位包含在跨越符合seqidno：1的組蛋白h4的46至102位氨基酸殘基的序列中。

更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及特異性針對游離組蛋白h4的表位的抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物，所述表位包含在選自跨越seqidno：1的22至30位殘基、seqidno：1的67至78位殘基、seqidno：1的92至102位殘基、seqidno：1的22至34位殘基、seqidno：1的46至102位殘基、seqidno：1的46至55位殘基、seqidno：1的60至67位殘基、seqidno：1的80至91位殘基、seqidno：1的24至35位殘基和seqidno：1的68至77位殘基的氨基酸序列的序列中。

此外，本發(fā)明涉及特異性針對游離組蛋白h2a的表位的抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物，所述表位包含在跨越符合seqidno：23的組蛋白h2a的20至118位氨基酸殘基的序列中。

更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及特異性針對游離組蛋白h2a的表位的抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物，所述表位包含在選自跨越seqidno：23的21至53位殘基、seqidno：23的21至29位殘基、seqidno：23的30至53位殘基、seqidno：23的120至129位殘基、seqidno：23的21至29位殘基、seqidno：23的82至88位殘基、seqidno：23的89至95位殘基和seqidno：23的100至118位殘基的氨基酸序列的序列中。

此外，本發(fā)明涉及特異性針對游離組蛋白h3的表位的抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物，所述表位包含在跨越符合seqidno：36的組蛋白h3的27至62位氨基酸殘基的序列中。

更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及特異性針對游離組蛋白h3的表位的抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物，所述表位包含在跨越seqidno：36的27至37位殘基和/或seqidno：36的52至62位殘基的序列中。

此外，本發(fā)明涉及特異性針對游離組蛋白h2b的表位的抗體、其抗原結(jié)合片段或衍生物，所述表位包含在跨越符合seqidno：31的組蛋白h2b的41至69位氨基酸殘基的序列中。

在本發(fā)明的情形中，特別優(yōu)選的是特異性針對跨越符合seqidno：23的游離組蛋白h2a的22至55位或70至118位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h2a的表位的抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，或特異性針對存在于跨越seqidno：1的46至102位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h4的表位的抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物。換句話說，在本發(fā)明的優(yōu)選情況下，所述抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物特異性針對seqidno：2中給出的表位。

本發(fā)明還涉及表達本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物的宿主細胞。

在本發(fā)明的情形中，術(shù)語“宿主細胞”是指表達本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物的任何細胞。因此，原核以及真核細胞在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物的試劑盒。上面提到的本發(fā)明的抗體可用于本發(fā)明的試劑盒中。

本發(fā)明還涵蓋了本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物的用途或本發(fā)明的試劑盒的用途，其用于疾病或醫(yī)學(xué)病癥的診斷、預(yù)后、風(fēng)險評估和/或療法控制的方法中，所述疾病或醫(yī)學(xué)病癥選自涉及個體的系統(tǒng)性炎性響應(yīng)(sirs)的疾病或醫(yī)學(xué)病癥，所述炎性響應(yīng)涉及感染性和非感染性病因例如由微生物刺激物即細菌、病毒、真菌和/或寄生蟲引起的膿毒癥、重癥膿毒癥和膿毒性休克，創(chuàng)傷性損傷和/或出血，缺血再灌注損傷，燒傷，急性胰腺炎，以及介入治療例如心肺轉(zhuǎn)流術(shù)、化療和放療，其中個體處于發(fā)生內(nèi)皮組織損傷、血栓栓塞和急性播散性血管內(nèi)凝血(dic)的風(fēng)險，在疾病的過程中造成單一或多個器官機能障礙和衰竭(特別是急性腎損傷、急性肺損傷和肝損傷)。

基于質(zhì)譜法的方法

根據(jù)本發(fā)明，所述游離組蛋白分子可以使用質(zhì)譜法(ms)方法來檢測。因此，本發(fā)明還提供了一種用于上面定義的疾病或醫(yī)學(xué)病癥的診斷、預(yù)后、風(fēng)險評估、危險分層和/或療法控制的方法，所述方法包括通過質(zhì)譜法(ms)檢測樣品中的至少一種游離組蛋白或其肽片段。因此，本發(fā)明涉及將ms用于患者中的上面提到的障礙或醫(yī)學(xué)病癥的診斷、預(yù)后、風(fēng)險評估、篩查和療法監(jiān)測。

本發(fā)明還涉及一種用于測量生物樣品中游離組蛋白的量的方法，所述方法包括檢測所述生物樣品或來自于所述樣品的蛋白質(zhì)消化物(例如胰蛋白酶消化物)中一種或多種修飾或未修飾的組蛋白片段肽的存在或量，以及任選地使用層析方法分離所述樣品，并對所述制備并任選地分離的樣品進行ms分析。例如，在ms分析中可以使用選擇反應(yīng)監(jiān)測(srm)、多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)或平行反應(yīng)監(jiān)測(prm)質(zhì)譜法，以特別是確定至少一種組蛋白肽的量。

在本發(fā)明的ms分析方法的一種情況下，在蛋白水解消化之前不需預(yù)先分離所述樣品中的蛋白質(zhì)。游離組蛋白及其肽的可靠檢測，可以在不使用包含脫脂、層析、離心或剝離豐富蛋白質(zhì)的親和基質(zhì)的分離方法的情況下實現(xiàn)。

在本文中，術(shù)語“質(zhì)譜法”或“ms”是指通過質(zhì)量鑒定化合物的一種分析技術(shù)。ms是指基于離子的質(zhì)荷比或“m/z”來過濾、檢測和測量離子的方法?！癿s”技術(shù)的特征在于：(1)將化合物電離以產(chǎn)生帶電荷的化合物，以及(2)檢測所述帶電荷化合物的質(zhì)荷比。所述化合物通常通過電離器電離并通過離子檢測器檢測。電離器和離子檢測器被并入到質(zhì)譜儀中。一般來說，將一個或多個目標分子電離，隨后將離子引入到質(zhì)譜儀中，在其中離子按照它們的m/z分離。這種分離可以在離子在電場(或電場與磁場的組合)中的m/z依賴性行為或具有m/z依賴性動力學(xué)能量的離子在無場區(qū)域中的飛行時間可變性的基礎(chǔ)上進行。參見例如題為“來自于表面的質(zhì)譜法”(massspectrometryfromsurfaces)的美國專利號6,204,500；題為“用于串聯(lián)質(zhì)譜法的方法和裝置”(methodsandapparatusfortandemmassspectrometry)的美國專利號6,107,623；題為“基于質(zhì)譜法的dna診斷”(dnadiagnosticsbasedonmassspectrometry)的美國專利號6,268,144；題為“用于被分析物的解吸和檢測的表面增強的光不穩(wěn)定性附連和釋放”(surface-enhancedphotolabileattachmentandreleasefordesorptionanddetectionofanalytes)的美國專利號6,124,137；wright等，prostatecancerandprostaticdiseases2:264-76(1999)；以及merchant和weinberger，electrophoresis21:1164-67(2000)。

一般來說，取決于分析的目的，ms檢測和分析可以以不同方式進行。自上而下的蛋白質(zhì)組學(xué)涉及完整分析，其維持蛋白質(zhì)完整性用于降解產(chǎn)物、序列變體和翻譯后修飾的組合的檢測。自下而上的肽分析涉及純化的蛋白質(zhì)樣品的還原、烷基化和消化，以接近并分析肽片段。

為了增強質(zhì)譜法的質(zhì)量分辨和質(zhì)量確定能力，可以在ms分析之前對樣品進行加工。因此，本發(fā)明涉及ms檢測方法，其可以與免疫富集技術(shù)、與樣品制備相關(guān)的方法和/或?qū)游龇椒ㄏ嘟M合，優(yōu)選地與液相色譜(lc)、更優(yōu)選地與高效液相色譜(hplc)或超高效液相色譜(uhplc)相結(jié)合。樣品制備方法包括用于將樣品裂解、分級、消化成肽、剝離、富集、透析、脫鹽、烷基化和/或肽還原的技術(shù)。然而，這些步驟是任選的。在本發(fā)明的一種情況下，為了測量片段例如seqidno：2，不需蛋白水解(例如胰蛋白酶)消化。在ms分析之前可以對樣品進行免疫富集。質(zhì)譜免疫測定法技術(shù)例如thermofishermsia^tm技術(shù)可以在消化之前使用，或者可以在消化后使用技術(shù)。

單維度或多維度hplc可用于分離蛋白質(zhì)或肽?？梢詫⒌鞍踪|(zhì)或肽混合物通過一系列層析固定相或維度，其提供更高的分辨力。hplc可適應(yīng)于許多實驗方法，并且可以對各種不同的固定相和流動性進行選擇，以獲得它們在分辨特定目標蛋白質(zhì)或肽類別中的適合性和彼此之間以及與下游質(zhì)譜測量檢測和鑒定方法的相容性。hplc可用于分離已被或未被產(chǎn)生相應(yīng)酶產(chǎn)物、即肽混合物的蛋白水解酶消化的臨床樣品?？梢詫⑺鱿鄳?yīng)的肽混合物通過一系列層析固定相或維度，其提供更高的分辨力。肽和蛋白質(zhì)的分離是基于肽序列、肽序列的官能團以及物理性質(zhì)。

因此，質(zhì)譜檢測可以與在質(zhì)譜檢測之前進行的液相色譜(lc)的應(yīng)用相結(jié)合。更優(yōu)選地，在質(zhì)譜檢測之前進行高效液相色譜(hplc)。

在本發(fā)明的優(yōu)選情況下，所述基于ms的方法不依賴于蛋白水解消化之前的預(yù)備性蛋白純化。此外，在蛋白水解消化之前，可能不需除去生物化學(xué)化合物例如脂類、蛋白質(zhì)或dna。在優(yōu)選情況下，在蛋白水解消化之前，可能不需按照物理性質(zhì)分離蛋白質(zhì)的純化步驟，即層析或離心。此外，在蛋白水解消化之前，可能不需剝離豐富或中等豐富的蛋白質(zhì)。豐富蛋白可以通過諸如ig-y12柱的基質(zhì)來去除。在本發(fā)明的情形中，這些預(yù)先分離步驟被稱為蛋白水解消化之前的預(yù)分離。因此，在生物樣品例如血清或血漿中的游離組蛋白可以在蛋白水解消化之前不進行任何預(yù)處理或預(yù)分離的情況下檢測。

在某些情況下，可以在沒有預(yù)先分離程序的情況下對生物樣品進行ms分析，在所述預(yù)先分離程序中可以進行免疫富集技術(shù)和預(yù)處理程序。在這種實施方式中，樣品優(yōu)選地通過使用靜態(tài)電噴霧原理的直接輸注、流動注入分析或帶有樣品富集的流動注入來分析。

當在本文中使用時，術(shù)語樣品分子的“電離”或“離子化”是指產(chǎn)生具有等于一個或多個電子單位的凈電荷的被分析物離子的不同技術(shù)。所述技術(shù)可以是化學(xué)電離(ci)、電子電離(ei)、快原子轟擊(fab)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(maldi)、電噴霧電離(esi)、表面增強激光解吸電離(seldi)、大氣壓化學(xué)電離(apci)、大氣壓光致電離(appi)、電感耦合等離子體(icp)、場解吸(fd)、熱噴霧、硅上的解吸/電離(dios)、二次離子質(zhì)譜法(sims)、火花放電電離、熱電離或離子附著電離。

被分析物離子的選擇性檢測可以使用串聯(lián)質(zhì)譜法(ms/ms)進行。串聯(lián)質(zhì)譜法的特征在于質(zhì)量選擇步驟(當在本文中使用時，術(shù)語“質(zhì)量選擇”是指具有特定m/z或狹窄的m/z范圍的離子的分離)，隨后進行所選離子的片段化和得到的產(chǎn)物(片段)離子的質(zhì)量分析。

所述前體被分析物離子可以使用不同技術(shù)片段化，所述技術(shù)可以選自碰撞誘導(dǎo)的解離(cid)、多階段激活(msa)、脈沖式q解離(pqd)、電子轉(zhuǎn)移解離(etd)、熱毛細管解離(htd)、電子捕獲解離(ecd)或紅外多光子解離(irmpd)、高能c-阱解離(hcd)。

當在本文中使用時，串聯(lián)質(zhì)譜法優(yōu)選地通過使用三級串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀來進行。串聯(lián)質(zhì)譜儀的特征在于第一和第三四極桿是質(zhì)量過濾器，即能夠選擇性傳送所需m/z或狹窄m/z范圍的離子。第二四極桿被用于碰撞誘導(dǎo)的解離。前體被分析物離子在第一四極桿中被選擇，并在第二四極桿中通過與中性氣體的碰撞而發(fā)生解離。第三四極桿過濾電離的片段，其通過任選地包括電子倍增器的檢測系統(tǒng)進一步檢測(hoffmanne.,journalofmassspectrometry,vol.31,1996,129-137)。

正如本文中概括的，三級串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀可用于進行選擇反應(yīng)監(jiān)測(srm)，也被稱為多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)，以及定量選擇反應(yīng)監(jiān)測(qsrm)。

或者，測定法可以利用平行反應(yīng)監(jiān)測(prm)來檢測和定量靶被分析物。與下文中所描述的通過在特征性躍遷之間切換來連續(xù)檢測和定量不同產(chǎn)物離子的mrm相反，prm同時檢測并定量由共同前體離子的片段化產(chǎn)生的兩種或更多種產(chǎn)物。一般來說，prm需要不同產(chǎn)物離子物質(zhì)的積累和隨后的質(zhì)量分析。在一個非限制性實例中，prm可以在可以從thermofisherscientific(bremen,germany)獲得的qexactive質(zhì)譜儀上進行。在qexactive質(zhì)譜儀中，特定m/z的前體離子被四極桿質(zhì)量過濾器選擇性傳送到碰撞室，在其中它們以相對高的能量與中性氣體的分子或原子碰撞，因此經(jīng)歷碰撞誘導(dǎo)的解離以形成產(chǎn)物離子。收集到的包括具有各種不同的m/z的不同離子物質(zhì)的產(chǎn)物離子，隨后被遞送到軌道靜電阱(orbitrap)質(zhì)量分析儀，其對產(chǎn)物離子進行質(zhì)量分析，以產(chǎn)生代表多種產(chǎn)物離子物質(zhì)中每一種的個體豐度(強度)的質(zhì)譜圖。

所述檢測方法可以包含采取例如選擇/多反應(yīng)監(jiān)測(srm/mrm)格式的測定法。

在這種情形中，優(yōu)選地使用三級串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀來進行srm/mrm。srm或定量選擇反應(yīng)監(jiān)測(qsrm)是用于精確分析和定量復(fù)雜生物樣品中的化合物(蛋白質(zhì))的技術(shù)，產(chǎn)生高水平的選擇性和靈敏度。當在本文中使用時，“qsrm”是指如下所述的選擇反應(yīng)監(jiān)測，其中通過使用同位素標記的參比肽或全長蛋白質(zhì)來定量所選的肽。

當在本文中使用時，術(shù)語“srm”定義了一種技術(shù)，在其中在質(zhì)譜儀中選擇并分離特定前體被分析物(作為待檢測的靶蛋白、在這里是游離組蛋白的替代物的肽)。將所述電離的前體被分析物片段化，并在質(zhì)荷比的基礎(chǔ)上監(jiān)測所述電離的片段，用于檢測和定量。與所述前體和片段離子相關(guān)的特定的一對m/z值，被稱為“躍遷”。

所述“躍遷”是指第一和第三四極桿被調(diào)制到的一對特定的前體/片段離子m/z值。所述“躍遷”對于作為復(fù)雜的蛋白質(zhì)消化物中的目標蛋白的替代物的特定肽的鑒定和定量來說是必不可少的。平均來說，在qsrm測定法中測量替代物與合成的同位素標記的參比肽的2-4個躍遷。為了使用srm/qsrm測量值，建議為每個肽使用至少兩個躍遷以確保特異性并且不錯誤鑒定靶物質(zhì)。

一般來說，srm/mrm測定法的建立始于在目標蛋白被消化后選擇一個或多個肽。適合的肽(前體被分析物)顯示出明顯高的質(zhì)譜信號響應(yīng)。其次，選擇對所述前體被分析物特異的肽片段。對于每個前體被分析物-片段來說，可以進行特定ms參數(shù)包括碰撞能量、離子光學(xué)設(shè)置和停留時間的優(yōu)化。隨后的躍遷驗證確認了生物樣品(例如血漿/血清)中的可檢測性并評估背景。通過添加同位素標記的標準肽，可以對前體被分析物定量，對于肽和片段的選擇來說，可以使用預(yù)測工具(例如具有算法預(yù)測、數(shù)據(jù)庫的軟件程序)來幫助選擇最適的躍遷。

正如上面概述的，本發(fā)明在一種情況下涉及生物樣品中游離組蛋白的檢測和/或定量，其中使用包括應(yīng)用液相色譜和srm和/或qsrm測定法的方法，所述測定法特異性檢測作為游離組蛋白的替代肽的組蛋白肽。

在某些實施方案中，利用高分辨/準確質(zhì)量(hram)質(zhì)量分析儀來檢測和測量從游離組蛋白或由其衍生的肽形成的前體和/或產(chǎn)物離子，可能是有益的。hram質(zhì)量分析儀是能夠以通常超過15k的分辨力和通常小于5百萬分數(shù)(ppm)的質(zhì)量準確度獲取質(zhì)譜圖的質(zhì)量分析儀。hram質(zhì)量分析儀的實例包括傅里葉變換/離子回旋共振(ft-icr)分析儀、orbitrap軌道靜電阱分析儀和某些多反射或長路徑飛行時間(tof)分析儀。合并有hram質(zhì)譜儀的質(zhì)譜儀器包括可以從thermofisherscientific(bremen,germany)獲得的exactive和qexactive產(chǎn)品系列。一般來說，hram質(zhì)量分析儀能夠在質(zhì)譜圖中將靶被分析物與具有緊密相近的m/z的干擾性離子物質(zhì)區(qū)分開，從而促進靶被分析物(例如從游離組蛋白或其替代肽形成的離子)的可信的鑒定和定量。通過這種方式，可以在復(fù)雜的生物基質(zhì)例如血漿中以高選擇性檢測和測量靶被分析物。hram質(zhì)量分析儀的使用可以允許忽略或簡化樣品制備和分離技術(shù)，所述技術(shù)旨在將所述靶被分析物與樣品中存在的可以混淆通過質(zhì)譜法進行的靶被分析物測量的干擾性組分分離開。在某些應(yīng)用中，hram分析儀的使用可以允許使用前體離子豐度(例如基于在完整ms譜圖中出現(xiàn)的強度)可信地檢測和定量靶被分析物，消除了對片段化步驟的需求。

相對定量“rsrm”可以通過下述方法實現(xiàn)：

1.通過將在生物樣品中檢測到的來自于給定組蛋白肽的srm特征峰面積與至少第二、第三、第四或更多生物樣品中相同組蛋白片段肽的同一srm特征峰面積進行比較，確定游離組蛋白存在的增加或減少。

2.通過將在生物樣品中檢測到的來自于給定組蛋白肽的srm特征峰面積與源自于不同且分開的生物來源的其他樣品中從來自于其他蛋白的片段肽產(chǎn)生的srm特征峰面積進行比較，確定游離組蛋白存在的增加或減少，其中所述兩種樣品的肽片段之間的srm特征峰面積的比較被歸一化至例如在每個樣品中分析的蛋白質(zhì)的量。

3.通過將同一生物樣品中給定組蛋白肽的srm特征峰面積與源自于不同蛋白質(zhì)的其他片段肽的srm特征峰面積進行比較，以便將組蛋白的變化水平歸一化到在各種不同的細胞條件下不改變其表達水平的其他蛋白質(zhì)的水平，來確定組蛋白存在的增加或減少。

4.這些測定法可以應(yīng)用于所述組蛋白的未修飾的片段肽和修飾的片段肽兩者，其中所述修飾包括但不限于磷酸化和/或糖基化、乙?；?、甲基化(單、二、三)、瓜氨酸化、遍在蛋白化，并且其中修飾肽的相對水平以與確定未修飾肽的相對量相同的方式來確定。

給定肽的絕對定量可以通過下述方法實現(xiàn)：

1.將個體生物樣品中來自于組蛋白的給定片段肽的srm/mrm特征峰面積與摻雜在來自于所述生物樣品的蛋白質(zhì)裂解物中的內(nèi)部片段肽標準品的srm/mrm特征峰面積進行比較。

所述內(nèi)部標準品可以是來自于正在被質(zhì)詢的組蛋白的片段肽的標記的合成版本或標記的重組蛋白。這種標準品在消化之前(對于重組蛋白來說強制性的)或之后以已知的量摻入到樣品中，并且可以分開地確定生物樣品中內(nèi)部片段肽標準品和本源片段肽兩者的srm/mrm特征峰面積，然后將兩個峰面積進行比較。這可以應(yīng)用于未修飾的片段肽和修飾的片段肽，其中所述修飾包括但不限于磷酸化和/或糖基化、乙?；?、甲基化(單、二、三)、瓜氨酸化、遍在蛋白化，并且其中修飾肽的絕對水平可以以與確定未修飾肽的絕對水平相同的方式來確定。

2.肽也可以使用外部校準曲線來定量。正常曲線法使用恒定量的作為內(nèi)部標準品的重肽和可變量的摻入到樣品中的輕的合成肽。需要使用與測試樣品的基質(zhì)相似的代表性基質(zhì)來構(gòu)建標準曲線，以解釋基質(zhì)效應(yīng)。此外，反向曲線法克服了基質(zhì)中的內(nèi)源被分析物的問題，其中將恒定量的輕肽摻入到內(nèi)源被分析物頂上以產(chǎn)生內(nèi)部標準品，并摻入可變量的重肽以產(chǎn)生一組濃度標準品。將要與正?；蚍聪蚯€比較的測試樣品摻有與摻入到基質(zhì)中用于產(chǎn)生校準曲線的內(nèi)部標準品相同量的標準肽。

正如上面解釋的，生物樣品中游離組蛋白的量可以通過檢測來自于所述生物樣品的蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾或未修飾的組蛋白片段肽的量，任選地使用層析方法分離所述樣品，并對所述制備且任選分離的樣品進行選擇反應(yīng)監(jiān)測(srm)串聯(lián)質(zhì)譜法以確定至少一種組蛋白肽的量，來測量。

本發(fā)明還涉及一種用于測量樣品中游離組蛋白的量的方法，所述方法包括檢測來自于所述生物樣品的蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾或未修飾的組蛋白片段肽的量，任選地使用層析方法分離所述樣品，并對所述制備且任選分離的樣品進行選擇反應(yīng)監(jiān)測(srm)串聯(lián)質(zhì)譜法以確定至少一種組蛋白肽的量。所述組蛋白片段肽的定量可以是通過rsrm的相對定量或絕對定量。

本發(fā)明還提供了一種用于測量樣品中的游離組蛋白的量的方法，所述方法包括在蛋白水解消化之前不對所述樣品進行預(yù)先分離的情況下檢測來自于所述生物樣品的蛋白質(zhì)消化物中一種或多種組蛋白片段肽的量，并對分離的肽進行選擇反應(yīng)監(jiān)測(srm)串聯(lián)質(zhì)譜法以確定至少一種組蛋白肽的量。

本發(fā)明還涉及一種用于測量樣品中的游離組蛋白的量的方法，所述方法包括在蛋白水解消化之前不對所述樣品進行預(yù)先分離的情況下檢測來自于所述生物樣品的蛋白質(zhì)消化物中一種或多種修飾或未修飾的組蛋白片段肽的量，并對分離的肽進行選擇反應(yīng)監(jiān)測(srm)串聯(lián)質(zhì)譜法以確定至少一種組蛋白肽的量。

此外，本發(fā)明涉及一種用于測量樣品中的游離組蛋白的量的方法，所述方法包括在蛋白水解消化之前不對所述樣品進行預(yù)先分離的情況下檢測來自于所述生物樣品的蛋白質(zhì)消化物中一種或多種未修飾的組蛋白片段肽的量，并對分離的肽進行選擇反應(yīng)監(jiān)測(srm)串聯(lián)質(zhì)譜法以確定至少一種組蛋白肽的量。

此外，本發(fā)明涉及一種用于測量樣品中的游離組蛋白的量的方法，所述方法包括檢測來自于所述生物樣品的沒有進行蛋白水解消化但在所述樣品的預(yù)分離之前進行了預(yù)處理程序或免疫富集程序的一種或多種未修飾的組蛋白片段肽的量，并對分離的肽進行選擇反應(yīng)監(jiān)測(srm)串聯(lián)質(zhì)譜法以確定至少一種游離組蛋白肽的量。

因此，本發(fā)明還涉及一種用于測量尚未進行蛋白水解(例如胰蛋白酶)消化的樣品中游離組蛋白的量的方法，所述方法包括通過選擇反應(yīng)監(jiān)測(srm)串聯(lián)質(zhì)譜法檢測一種或多種組蛋白片段肽的量以確定至少一種游離組蛋白肽的量，其中所述樣品在檢測之前已經(jīng)歷預(yù)處理程序或免疫富集程序。

下面的說明性和示例性測定法也可用于本發(fā)明的情形中，然而，其他測定法也可以同樣地使用。將所述樣品蛋白水解消化，優(yōu)選地通過添加蛋白酶(例如胰蛋白酶)，這產(chǎn)生含有對組蛋白特異的組蛋白肽(替代肽)的樣品。對于替代肽的精確定量來說，以確定的量向樣品添加內(nèi)部標準品。因此，同位素標記的合成肽被添加并代表替代肽的對應(yīng)物。所述內(nèi)部標準品也可以在蛋白水解消化之前添加。含有替代肽和相應(yīng)的內(nèi)部標準品的消化的樣品現(xiàn)在使用適合的lc/hplc方案(hplc柱、梯度、洗脫時間)進行層析分離。當在本文中使用時，所述層析分離在線進行，其中將柱洗脫液直接轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜儀的第一電離裝置?；蛘?，可以首先收集不同的洗脫液并隨后分析。除了液相層析之外，可以使用用于樣品分離的不同技術(shù)，例如在前一段中描述的技術(shù)。在分離步驟后，將使用質(zhì)譜儀、優(yōu)選地使用串聯(lián)質(zhì)譜儀來確定所選替代肽和相應(yīng)片段的質(zhì)量。所述含有組蛋白肽的樣品在質(zhì)譜儀中被電離，并將得到的離子遞送到第一質(zhì)量過濾器。正如以前描述的，僅僅具有所需質(zhì)荷比(m/z)的電離肽被選擇性地引入到碰撞單元中，在其中所述前體肽由于與碰撞氣體的碰撞而經(jīng)歷片段化。所選的肽片段離子被進一步傳送到第二質(zhì)量過濾器。在檢測后產(chǎn)生信號，其代表了傳送的組蛋白肽片段離子的量。

在本發(fā)明的免疫測定法的背景中描述的抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，也可用于在ms分析之前對游離組蛋白進行免疫沉淀/免疫純化，其中可以使用或不使用蛋白酶消化。

因此，本發(fā)明涉及一種測量生物樣品中游離組蛋白的存在或量的方法，其中所述方法包括使用特異性針對包含在組蛋白中的表位的抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物對游離組蛋白進行免疫純化，使用層析方法分離所述樣品，檢測來自于所述生物樣品的一種或多種修飾或未修飾的組蛋白片段肽的量，并對制備的樣品進行ms分析。

正如上文中概述的，在本發(fā)明的基于ms的方法中，可以在ms分析之前對所述樣品進行蛋白酶消化，優(yōu)選為胰蛋白酶消化。然而，在本發(fā)明的其他情況下，在ms分析之前不對所述樣品進行蛋白酶消化，優(yōu)選為胰蛋白酶消化。

根據(jù)上述解釋，本發(fā)明的基于ms的方法可以任選地包括一個或多個下述步驟：

(i)對所述樣品進行預(yù)處理例如添加化學(xué)或生物化學(xué)物質(zhì)；

(ii)對所述樣品進行還原和/或烷基化反應(yīng)；

(iii)在ms分析之前和胰蛋白酶消化之后使用層析方法分離所述樣品；

(iv)使用免疫親和裝置(例如thermoscientificmsia^tm技術(shù))富集所述樣品或使用剝離柱剝離不想要的組分；

(v)添加至少一種內(nèi)部參比標準品，其中所述參比標準品是待檢測的肽或蛋白質(zhì)的同位素標記的版本。

在本發(fā)明的基于ms的方法中，所述游離組蛋白可以是組蛋白h2a，并且至少其選自seqidno：24、28、29和30的肽片段、優(yōu)選地選自seqidno：24和28的肽片段被檢測并任選地被定量。

在本發(fā)明的基于ms的方法中，所述游離組蛋白也可以是組蛋白h4，并且至少其選自seqidno：2、3、4、5、6和7的肽片段、優(yōu)選地選自seqidno：3和4的肽片段被檢測并任選地被定量。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的情形中的肽片段和躍遷被列于表4和5中。

本文中引用的所有參考文獻包括科學(xué)文獻和專利文獻，通過參考并入本文。

序列

seqidno：1(人類組蛋白h4的氨基酸序列，uniprotidp62805.2，未包括起始甲硫氨酸)

1sgrgkggkglgkggakrhrkvlrdniqgitkpairrlarrggvkrisgli

51yeetrgvlkvflenvirdavtytehakrktvtamdvvyalkrqgrtlygf

101gg

seqidno：2(seqidno：1的46-102位殘基的氨基酸序列)

1isgliyeetrgvlkvflenvirdavtytehakrktvtamdvvyalkrqgr

51tlygfgg

seqidno：3(seqidno：1的46-55位殘基的氨基酸序列)

1isgliyeetr

seqidno：4(seqidno：1的60-67位殘基的氨基酸序列)

1vflenvir

seqidno：5(seqidno：1的80-91位殘基的氨基酸序列，具有乙?；膋91)

1tvtamdvvyalk

seqidno：6(seqidno：1的24-35位殘基的氨基酸序列)

1dniqgitkpair

seqidno：7(seqidno：1的68-77位殘基的氨基酸序列)

1davtytehak

seqidno：8(h4-gr-17的氨基酸序列，seqidno：1的2-17位)

1grgkggkglgkggakr

seqidno：9(h4-gh-18的氨基酸序列，seqidno：1的2-18位)

1grgkggkglgkggakrh

seqidno：10(h4-li-9的氨基酸序列，seqidno：1的22-30位)

1lrdniqgit

seqidno：11(h4-lr-15的氨基酸序列，seqidno：1的22-35位)

1lrdniqgitkpair

seqidno：12(h4-ll-17的氨基酸序列，seqidno：1的22-37微)

1lrdniqgitkpairrl

seqidno：13(h4-pr-15的氨基酸序列，seqidno：1的32-45位)

1pairrlarrggvkr

seqidno：14(h4-ps-17的氨基酸序列，seqidno：1的32-47位)

1pairrlarrggvkris

seqidno：15(h4-ee-13的氨基酸序列，seqidno：1的52-63位)

1eetrgvlkvfle

seqidno：16(h4-en-14的氨基酸序列，seqidno：1的52-64位)

1eetrgvlkvflen

seqidno：17(h4-rr-13的氨基酸序列，seqidno：1的67-78位)

1rdavtytehakr

seqidno：18(h4-rk-14的氨基酸序列，seqidno：1的67-79位)

1rdavtytehakrk

seqidno：19(h4-tk-13的氨基酸序列，seqidno：1的80-91位)

1tvtamdvvyalk

seqidno：20(h4-tr-14的氨基酸序列，seqidno：1的80-92位)

1tvtamdvvyalkr

seqidno：21(h4-rg-9的氨基酸序列，seqidno：1的92-99位)

2rqgrtlyg

seqidno：22(h4-rg-12的氨基酸序列，seqidno：1的92-102位)

3rqgrtlygfgg

seqidno：23(1型人類組蛋白h2a的氨基酸序列，uniprotidq96qv6，未包括起始甲硫氨酸)

1sgrgkqggkaraksksrssraglqfpvgrihrllrkgnyaerigagapvy

51laavleyltaeilelagnasrdnkktriiprhlqlairndeelnkllggv

101tiaqggvlpniqavllpkkteshhhkaqsk

seqidno：24(ha-ar-10的氨基酸序列，seqidno：23的21-29位)

1aglqfpvgr

seqidno：25(ha-ah-12的氨基酸序列，seqidno：23的21-31位)

1aglqfpvgrih

seqidno：26(ha-il-23的氨基酸序列，seqidno：23的30-51位)

1ihrllrkgnyaerigagapvyl

seqidno：27(ha-ia-25的氨基酸序列，seqidno：23的30-53位)

1ihrllrkgnyaerigagapvylaa

seqidno：28(seqidno：23的82-88位殘基的氨基酸序列)

1hlqlair

seqidno：29(seqidno：23的89-95位殘基的氨基酸序列)

1ndeelnk

seqidno：30(seqidno：23的100-118位殘基的氨基酸序列)

1vtiaqggvlpniqavllpk

seqidno：31(人類組蛋白h2b的氨基酸序列，uniprotidp62807)

1mpepaksapapkkgskkavtkaqkkdgkkrkrsrkesysvyvykvlkqvh

51pdtgisskamgimnsfvndiferiageasrlahynkrstitsreiqtavr

101lllpgelakhavsegtkavtkytssk

seqidno：32(seqidno：31的94-100位殘基的氨基酸序列)

1eiqtavr

seqidno：33(seqidno：31的101-109位殘基的氨基酸序列)

1lllpgelak

seqidno：34(人類組蛋白h2b的氨基酸序列，uniprotidq6dn03.3，未包括起始甲硫氨酸)

seqidno：35(seqidno：34的181-193位殘基的氨基酸序列)

1lvnfrrahntkhr

seqidno：36(人類組蛋白h3.1的氨基酸序列，uniprotidp68431.2，未包括起始甲硫氨酸)

1artkqtarkstggkaprkqlatkaarksapatggvkkphryrpgtvalre

51irryqkstellirklpfqrlvreiaqdfktdlrfqssavmalqeaceayl

101vglfedtnlcaihakrvtimpkdiqlarrirgera

seqidno：37(seqidno：36的57-63位殘基的氨基酸序列)

1stellir

seqidno：38(seqidno：36的117-122位殘基的氨基酸序列)

1vtimpk

seqidno：39(seqidno：36的41-49位殘基的氨基酸序列)

1yrpgtvalr

seqidno：40(3型人類組蛋白h2a的氨基酸序列，uniprotidq7l7l0.3，未包括起始甲硫氨酸)，sigma重組h2asrp0406

1sgrgkqggkarakaksrssraglqfpvgrvhrllrkgnyservgagapvy

51laavleyltaeilelagnaardnkktriiprhlqlairndeelnkllgrv

101tiaqggvlpniqavllpkkteshhkakgk

seqidno：41(人類組蛋白h1的氨基酸序列，uniprotidp07305，未包括起始甲硫氨酸)

實施例

下面的實施例和圖被用于本發(fā)明的更詳細解釋，但是不將本發(fā)明限制到所述實施例和圖。

實施例1：抗體的產(chǎn)生

a.肽

與組蛋白h4的氨基酸序列相關(guān)的肽由thermofisherscientificgmbh,ulm,germany、newenglandpeptideinc,gardner,ma,usa或jptpeptidetechnologiesgmbh化學(xué)合成并純化(>90％)。免疫接種肽使用磺基-mbs(間馬來酰亞胺基苯甲?；?n-羥基琥珀酰亞胺酯)偶聯(lián)到牛血清白蛋白(bsa，sigmaaldrich)或通過附加的n-端半胱氨酸偶聯(lián)到鑰孔戚血藍蛋白(klh，thermofisherscientific)。用于抗體的親和純化的肽與用于免疫接種的肽相比含有一個或兩個附加的c-端氨基酸和用于固定化到sulfolink偶聯(lián)樹脂的附加的n-端半胱氨酸。

b.多克隆抗體的生成

按照標準程序(參見ep1488209a1、ep1738178a1)產(chǎn)生針對h4-li-9(組蛋白h4的22-30位氨基酸，seqidno：10)、h4-ee-13(組蛋白h4的52-63位氨基酸，seqidno：15)、h4-rr-13(組蛋白h4的67-78位氨基酸，seqidno：17)和h4-rg-9(組蛋白h4的92-99位氨基酸，seqidno：21)的綿羊多克隆抗體。簡單來說，通過額外的n-端半胱氨酸，使用mbs將肽偶聯(lián)到載體蛋白klh。按照下述流程將偶聯(lián)物用于免疫接種綿羊：將綿羊首先用100μg偶聯(lián)物免疫接種(質(zhì)量是指所述偶聯(lián)物的肽組成部分)，隨后以4周的間隔用50μg加強。在初次免疫接種后4個月，從所述綿羊獲得300ml抗血清。

按照標準程序產(chǎn)生針對的ha-ar-10(1型組蛋白h2a的21-29位氨基酸，seqidno：24)和ha-il-23(1型組蛋白h2a的30-51位氨基酸，seqidno：26)的兔多克隆抗體。簡單來說，通過額外的n-端半胱氨酸，使用mbs將肽偶聯(lián)到klh。按照下述流程將偶聯(lián)物用于免疫接種：將兔首先用800μg偶聯(lián)物免疫接種(質(zhì)量是指所述偶聯(lián)物的肽組成部分)，并在第4周開始隨后以一周的間隔用500μg加強3次。在初次免疫接種后2個月，從所述兔獲得各20ml抗血清。

抗原特異性抗體如下所述從相應(yīng)的抗血清純化：將5mg純化肽(參見下面的表1)偶聯(lián)到5mlsulfolink凝膠(pierce,rockford,il,usa)。將50ml抗血清逐批與所述凝膠在室溫下溫育4小時。將懸液轉(zhuǎn)移到柱(空的nap25柱，gehealthcarelifesciences)中。在將穿流液舍棄并將柱用100ml清洗緩沖液(100mmkpi，0.1％tween-20，ph6.8)清洗后，用ph2.7的50mm檸檬酸洗脫特異性結(jié)合的抗體。將洗脫液針對50mmnapi，100mmnacl，ph8.0透析。

表1.用于組蛋白h4和組蛋白h2a多克隆抗體產(chǎn)生的肽

c.單克隆抗體的產(chǎn)生

通過標準程序(lane,r.d.jimmunolmethods,1985,81(2):223-228)產(chǎn)生針對h4-gr-17(組蛋白h4的2-17位氨基酸，seqidno：8)、h4-li-9(組蛋白h4的22-30位氨基酸，seqidno：10)、h4-ee-13(組蛋白h4的52-63位氨基酸，seqidno：15)、h4-rr-13(組蛋白h4的67-78位氨基酸，seqidno：17)、h4-tk-13(組蛋白h4的80-91位氨基酸，seqidno：19)、h4-rg-12(組蛋白h4的92-102位氨基酸，seqidno：22)和全長組蛋白h3(sigmaaldrichsrp0177，seqidno：36)的單克隆抗體。在本研究中，評估淋巴細胞-骨髓瘤細胞混合物向促融劑的暴露時長對總的雜交瘤集落和分泌單克隆抗體的集落的得率的影響。將sp2/0和fox-ny骨髓瘤細胞與用綿羊紅細胞免疫的鼠脾淋巴細胞融合不同的時長。最適的融合時長由在37℃下在45s的時長內(nèi)向細胞混合物添加促融劑(5.0mlkodak1450peg，0.5ml二甲亞砜和4.5ml磷酸鹽緩沖鹽水，ph7.0)構(gòu)成。所述融合過程通過將所述混合物在50mlrpmi-1640中逐漸稀釋來停止。10min后，將細胞離心，重懸浮在含有飼養(yǎng)巨噬細胞的選擇培養(yǎng)基中并培養(yǎng)。與常用的更長的融合技術(shù)相比，這種程序?qū)е庐斒褂胹p2/0細胞時產(chǎn)生的雜交瘤數(shù)目約5倍的提高，并且當使用fox-ny細胞作為融合配偶體時產(chǎn)生的雜交瘤數(shù)目30倍的提高。在兩種情況下，事實上所有的孔都含有分泌單克隆抗體的雜交瘤集落。這種高效率融合技術(shù)可以最有利地用于產(chǎn)生針對弱免疫原的單克隆抗體或減少用較強免疫原免疫接種所需的時間。

簡單來說，在這里，使用磺基-mbs(間馬來酰亞胺基苯甲?；?n-羥基琥珀酰亞胺酯)將肽偶聯(lián)到bsa。使用這些偶聯(lián)物和組蛋白h3對balb/c小鼠進行免疫接種和加強，并將脾細胞與sp2/0骨髓瘤細胞融合，以產(chǎn)生雜交瘤細胞系。篩選細胞系分泌結(jié)合于包被在聚苯乙烯固相上的篩選肽(參見表2)和重組全長組蛋白的抗體的能力。產(chǎn)生了分泌單克隆抗體ak654/f3和654/h10(針對h4-gr-17)、ak602/f11和602/g3(針對h4-li-9)以及ak660/d2、ak660/g9、ak660/f6、ak660/e9、ak660/g3和ak660/f7(針對組蛋白h3)的細胞系。

此外，針對組蛋白h4的50-102位殘基內(nèi)的區(qū)域的小鼠單克隆抗體購自abcam(#ab31830)。

表2.用于組蛋白h4和組蛋白h3單克隆抗體產(chǎn)生的肽

d.抗體的標記

抗體按照標準程序(ep1488209a1、ep1738178a1)進行標記：將相應(yīng)的純化的抗體的濃度調(diào)整到1g/l，并將所述抗體通過與化學(xué)發(fā)光標記物macn-吖啶-nhs-酯(1g/l；inventgmbh,hennigsdorf,germany)以1:5的摩爾比在室溫下溫育20min來標記。通過添加1/10體積的50mm甘氨酸在室溫下10min，將反應(yīng)停止。在nap-5柱(gehealthcarelifesciences)和sec-400-5hplc柱(bio-rad)上，通過尺寸排阻層析將標記的抗體與游離標記物分離開。

實施例2：游離組蛋白免疫測定法的開發(fā)

a.抗體的包被

抗體按照標準程序(ep1488209a1、ep1738178a1)進行包被：將聚苯乙烯管(greiner)用純化的抗體在22℃下包被(每管2μg抗體，在300μl10mmtris，100mmnacl，ph7.8中)過夜。然后將管用含有30g/lkarionfp(merck)、5g/l無蛋白酶bsa(sigmaaldrich)的10mmnapi(ph6.5)阻斷并冷凍干燥。

b.使用多克隆和單克隆和可商購的單克隆抗體進行的參比組蛋白h4測定法

組蛋白h4：使用上面描述的多克隆和單克隆組分并使用重組人類全長組蛋白h4(sigmaaldrich#srp0178，seqidno：1)設(shè)置了幾種夾心組蛋白免疫測定法。在血清和edta血漿樣品中，使用包被在管中的抗h4-li-9抗體(變體v1)和抗h4-rr-13抗體(變體v2)和abcam的針對組蛋白h4的50-102位氨基酸內(nèi)的殘基的抗組蛋白h4ab31830的組合，觀察到最佳信號。在來自于健康志愿者的樣品中沒有看到信號(信號低于功能測定法靈敏度)，然而，來自于降鈣素原水平提高、表明嚴重細菌感染或膿毒癥的患者的樣品，都高于功能測定法靈敏度(fas)(圖1)。兩種測定法組合相關(guān)聯(lián)，但是當使用組合h4-li-9時測量到更低的水平，可能是由于被分析物(seqidno：1)在h4-li-9區(qū)域(seqidno：10)與h4-rr-13區(qū)域(seqidno：17)之間的蛋白水解，引起較長的組蛋白h4片段與較小的c-端片段相比濃度較低(圖2和3)。

將50μl標準品(重組人類全長組蛋白h4，來自于sigmaaldrich#srp0178，seqidno：1)或來自于患者的樣品和200μl含有macn標記的抗體的緩沖液在包被的管中混合(300mmkpi，ph7.0，50mmnacl，10mmedta，0.09％nan3，0.1％bsa，0.1％非特異性牛igg，0.1％非特異性igg，0.01％非特異性小鼠igg)，并且每200μl含有0.5x10⁶個相對光單位(rlu)的macn標記的抗體。將所述管在室溫下溫育18-24小時。然后，將管用1mlb.r.a.h.m.s50x通用清洗溶液(tris400mm，nacl3m，tween201％，硅酮消泡劑0.001％)(thermofisherscientific,b.r.a.h.m.sgmbh,hennigsdorf,germany)清洗4次，并使用lb925t照度計(berthold)對每個管的結(jié)合的化學(xué)發(fā)光進行1s的測量。使用軟件multicalc(樣條擬合)計算樣品的濃度。

c.劑量響應(yīng)曲線

在上述兩種免疫測定法中，通過使用重組組蛋白h4(sigmaaldrich#srp0178，seqidno：1)作為標準材料來產(chǎn)生劑量響應(yīng)曲線。典型的劑量響應(yīng)曲線示出在圖4中。

實施例3：srm與免疫測定法之間的相關(guān)性

使用在下文中描述的本發(fā)明的srm測定法，評估了在本發(fā)明的免疫測定法中試驗的同樣的樣品。

圖5示出了本發(fā)明的組蛋白h4lia和srm測定法相關(guān)性非常好，皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.95，表明兩種測定法測量同一被分析物。出于與當組蛋白復(fù)合成八聚體時特異性針對位于組蛋白h4的中央部分中的殘基的抗體不能結(jié)合相同的原因，胰蛋白酶不能到達該區(qū)域中的潛在切割位點。因此，只有游離組蛋白可以在所述中央部分處被切開，并且源自于該區(qū)域的可檢測的肽例如seqidno：3和4只能從游離組蛋白產(chǎn)生。

實施例4：本發(fā)明的夾心免疫測定法和srm測定法與來自于roche的針對核小體的可商購elisa之間的比較

在來自于roche的可商購elisa系統(tǒng)中試驗了用于產(chǎn)生圖4中所示的標準曲線的重組全長組蛋白h4：盡管roche細胞死亡檢測elisa(#11544675001)被設(shè)計用于特異性確定細胞裂解物的細胞質(zhì)級分中的單核小體和寡核小體這一事實，但我們試驗了它在血清和edta血漿樣品中的性能，這是因為組蛋白h2a、h2b、h3和h4形成核小體的八聚體核心。所述測定法含有用針對哺乳動物組蛋白h2a、h2b、h3和h4的抗體包被的微量滴定板和針對dna的檢測抗體。由于所述試劑盒不包括標準材料，因此我們使用本源核小體(bpsbioscience#52015)來估算基質(zhì)濃度。使用與圖1中所示用于組蛋白h4濃度試驗的相同的樣品，在降鈣素原水平提高的患者中核小體水平升高或不可檢測(圖6)。因此，可以得出結(jié)論，在核小體與游離組蛋白h4水平之間沒有相關(guān)性(圖7)。此外，我們試驗了摻入到零血清中的可商購的被分析物：重組人類組蛋白h2a(sigmaaldrich#srp0406，seqidno：23)，重組人類組蛋白h3(sigmaaldrich#srp0177，seqidno：36)和組蛋白h4(sigmaaldrich#srp0178，seqidno：1)，以及本源人類核小體(bpsbioscience#52015)。表3列出了可以通過brahms組蛋白h4lia或roche細胞死亡檢測elisa來檢測的被分析物。所述組蛋白h4lia特異性針對人類組蛋白h4，不檢測組蛋白h2a和h3，并且重要的是不檢測本源核小體。這表明被在本發(fā)明中描述的免疫測定法中使用的抗體識別的組蛋白h4的表位，當組蛋白h4作為核小體的八聚體核心的一部分時不可接近。然而，當組蛋白h4在溶液中游離時，組蛋白h4lia能夠檢測基質(zhì)包括血清和edta血漿中的組蛋白h4水平。相反，roche細胞死亡檢測elisa檢測核小體，但不檢測任一種組蛋白。

表3：通過brahms組蛋白h4免疫測定法和roche細胞死亡試劑盒進行的被分析物檢測的比較。

實施例5：基于質(zhì)譜法的選擇反應(yīng)監(jiān)測(srm)

srm是一種基于ms的技術(shù)，用于可以在高度復(fù)雜背景例如血液來源的血清或血漿中檢測的具有確定片段化性質(zhì)的先前選擇的蛋白水解肽的定向檢測和定量。

通過lc-ms/ms技術(shù)(tsqvantage質(zhì)譜儀(ms)；thermofisherscientific)檢測被稱為h4和h2a的源自于組蛋白h4和組蛋白h2a的特定肽。發(fā)現(xiàn)的結(jié)果通過srm分析得以證實，顯示h4來源的肽隨著演變的血流感染過程而變。發(fā)現(xiàn)對于每種肽來說，鑒定到的肽序列及其片段化離子、即所謂的躍遷，是用于監(jiān)測血液樣品中h4和h2a蛋白水平的有用替代物。

開發(fā)了下文中描述的定量srm測定法來測量通過血漿或血清蛋白的胰蛋白酶消化產(chǎn)生的未修飾的組蛋白來源的肽的相對定量水平。

對從sigma購買的重組蛋白進行了優(yōu)化。對所有可能的胰蛋白酶消化的肽進行篩選，并選擇在信噪比方面最好的肽(參見表4和5)。對至少4個最佳躍遷，設(shè)立最適保留時間、停留時間和碰撞能。

肽的實例vflenvir(seqidno：4)被示出在圖9中。

實施例6：用于組蛋白的srm/mrm測定法的設(shè)立

在三級串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀上用于單個片段肽的srm/mrm測定法

srm是一種基于ms的技術(shù)，用于可以在高度復(fù)雜背景例如血液來源的血清或血漿中檢測的具有確定片段化性質(zhì)的先前選擇的蛋白水解肽的定向檢測和定量。

開發(fā)了下文中描述的定量srm測定法來測量通過血漿或血清蛋白的胰蛋白酶消化產(chǎn)生的未修飾的組蛋白來源的肽的定量水平。

通過lc-ms/ms技術(shù)(tsqvantage和tsqquantiva質(zhì)譜儀(ms)；thermofisherscientific)檢測被稱為h4和h2a的源自于組蛋白h4和組蛋白h2a的特定肽。發(fā)現(xiàn)對于每種肽來說，鑒定到的肽序列及其片段化離子、即所謂的躍遷，是用于監(jiān)測血液樣品中h4和h2a蛋白水平的有用替代物。

對從sigma購買的重組蛋白進行了優(yōu)化。對所有可能的胰蛋白酶消化的肽進行篩選，并選擇在信噪比方面最好的肽(參見表4和5)。對至少4個最佳躍遷，設(shè)立最適保留時間、停留時間和碰撞能。

可以對臨床樣品進行相對定量和/或絕對定量，并使用正常曲線或反向曲線評估測定法的性能。

實施例7：ms定量/肽和躍遷的選擇的演示

a.樣品制備

將血漿樣品(12μl)在冰上融化，并與50μl的8m尿素/2.5％正丙醇/200mmtris-hcl/10mmdttph8.5混合。將樣品在37℃溫育1小時。然后將樣品用5μl溶解在1m碳酸氫銨中的500mm碘乙酸烷基化，并在室溫下在暗處溫育1小時。然后將殘留的烷基化試劑與3.3μl500mmdtt反應(yīng)。然后將樣品用260μlph8的50mmtris-hcl、5mmcacl2緩沖液稀釋。然后向每個樣品添加150μl胰蛋白酶(pierce，20μg，在25mm乙酸中)，提供1:50的胰蛋白酶：蛋白質(zhì)比例。允許樣品在37℃消化18小時。對于發(fā)現(xiàn)運行來說，在質(zhì)譜分析之前將300ng樣品載樣到50mm×1mm1.9μmhypersilgold柱(thermofisherscientific)上。

在vantage三級四極桿質(zhì)譜儀、surveyorms泵、ctcpal自動進樣器和裝備有高流速金屬針的ionmax源(thermofisherscientific)上，或者在與hplcultimate3000偶聯(lián)的三級四極桿質(zhì)譜儀tsqquantiva(thermofisherscientific)上，開發(fā)srm測定法。反相分離在從5％至40％b的20min線性梯度中進行，總運行時間為40min(溶劑a：水，0.2％fa(甲酸)；溶劑b：acn(乙腈)，0.2％fa)。在線性梯度期間的流速被設(shè)定到240μl/min。對于曲線上的所有樣品和點來說，總進樣體積為160μl。accucore2.6μmaq150x2.1mm柱(thermofisherscientific)在50℃的溫度下運行。

將5μl每種臨床血漿樣品添加到20μl8m尿素/2.5％正丙醇/300mmtris-hcl/10mmdttph8.5，并在37℃溫育1小時。向每個樣品孔添加在1m碳酸氫銨中制備的500mm碘乙酸，并在室溫下在暗處溫育1小時。向每個孔添加113μl50mmtris-hcl/5mmcacl2ph8.0。將胰蛋白酶(pierce，thermofisherscientific)用150μl25mm乙酸重新水合，以1:10的比例(總蛋白含量：蛋白酶)添加，并在37℃下溫育20小時。最后通過添加2μl甲酸來淬滅所述消化。然后在進樣之前添加胰高血糖素(1ng/μl)和標準的重肽。

同位素標記的肽c-端賴氨酸或精氨酸由thermofisherscientificgmbh,ulm,germany或newenglandpeptideinc,gardner,ma,usa化學(xué)合成并純化(>95％肽純度，>99％同位素純度)。

將從發(fā)現(xiàn)ms實驗獲得的保留時間信息輸入到pinpoint(thermofisherscientific)中，以建立初步安排的srm方法用于優(yōu)化。為每個躍遷自動試驗各個儀器參數(shù)例如碰撞能、鏡筒透鏡、停留時間和預(yù)測的保留時間。在多次迭代后，最終確定肽和躍遷的優(yōu)化的(即強度信號最高并且與其他躍遷重疊最少的)名單，并選擇每個蛋白至少兩個蛋白水解肽和每個肽至少四個片段躍遷。

表4和5列出了為人類h4和h2a蛋白分析的所有肽。為組蛋白h4篩選的總共6個肽，并且為組蛋白h2a篩選了總共6個肽。

對于組蛋白h4來說，對5個肽進行了詳細的躍遷分析。將符合seqidno：3和4的肽作為重標記的肽進行分析，并且為每個肽監(jiān)測4至5個躍遷。

對于組蛋白h2a來說，對4個肽進行了詳細的躍遷分析。將符合seqidno：24和28的肽作為重標記的肽進行分析，并且為每個肽監(jiān)測4至5個躍遷。

通過在色譜分離中共同洗脫輕和重標記的躍遷來鑒定肽。將pinpoint軟件(thermofisherscientific)或skyline軟件(開源)用于時間配準、躍遷的相對定量和定向蛋白質(zhì)定量。

表4.為h4監(jiān)測的示例性肽和躍遷。

表5.為h2a監(jiān)測的示例性肽和躍遷。

b.ms分析

進行srm/mrm分析，使得作為來自于srm/mrm質(zhì)譜分析的獨特的srm/mrm特征峰面積的函數(shù)的被檢測的組蛋白片段肽的量，指示了特定樣品中蛋白質(zhì)的相對和絕對量兩者。

實施例8：用于評估靈敏度的校準曲線的產(chǎn)生

將恒定量的輕肽摻入到內(nèi)源被分析物頂上以產(chǎn)生內(nèi)部標準品，并摻入可變量的重肽以產(chǎn)生一組濃度標準品。由于用于產(chǎn)生曲線的變化的重肽信號對于內(nèi)源被分析物的未知量沒有貢獻，因此可以確定定量極限(loq)值，這是指測量值在定量上變得有意義的點。在該loq處被分析物的響應(yīng)是可識別的、離散的且可重復(fù)的，精確度為20％，準確度為80-120％。

反向校準曲線使用血漿樣品合并物作為背景基質(zhì)來產(chǎn)生。校準曲線上的每個點(以及被分析的每個樣品)包含100fmol的重標記的肽。柱上背景基質(zhì)的量，對于校準曲線上的每個點以及在所有被分析的樣品中是20μg。標準重肽(c-端賴氨酸或精氨酸同位素標記的肽，由thermofisherscientificgmbh,ulm,germany或newenglandpeptideinc,gardner,ma,usa化學(xué)合成并純化，>95％肽純度，>99％同位素純度)在消化后摻入。此外，將所有樣品溶解在1μg/ml胰高血糖素水溶液/0.2％fa中，以最小化與塑料表面的結(jié)合。

圖10示出了來自于組蛋白h4的肽vflenvir(seqidno：4)的校準曲線。摻入恒定量的從重組h4消化獲得的輕肽和可變量的相應(yīng)的重肽，以產(chǎn)生一組濃度標準品。

實施例9：在人類數(shù)據(jù)集上rsrm的相對定量

進行srm/mrm分析，使得作為來自于srm/mrm質(zhì)譜分析的獨特的srm/mrm特征峰面積的函數(shù)的被檢測的組蛋白片段肽的量，指示了特定蛋白質(zhì)裂解物中蛋白質(zhì)的相對和絕對量兩者。

相對定量rsrm可以通過下述方法實現(xiàn)：

1.通過將在生物樣品中檢測到的來自于給定組蛋白肽的srm特征峰面積與至少第二、第三、第四或更多生物樣品中相同組蛋白片段肽的同一srm特征峰面積進行比較，確定組蛋白存在的增加或減少。

2.通過將在生物樣品中檢測到的來自于給定組蛋白肽的srm特征峰面積與源自于不同且分開的生物來源的其他樣品中從來自于其他蛋白的片段肽產(chǎn)生的srm特征峰面積進行比較，確定組蛋白存在的增加或減少，其中所述肽片段的兩種樣品之間的srm特征峰面積的比較被歸一化至例如在每個樣品中分析的蛋白質(zhì)的量。

3.通過將同一生物樣品中給定組蛋白肽的srm特征峰面積與源自于不同蛋白質(zhì)的其他片段肽的srm特征峰面積進行比較，以便將組蛋白的變化水平歸一化到在各種不同的細胞條件下不改變其表達水平的其他蛋白質(zhì)的水平，來確定組蛋白存在的增加或減少。

4.這些測定法可以應(yīng)用于所述組蛋白的未修飾的片段肽和修飾的片段肽兩者，其中所述修飾包括但不限于磷酸化和/或糖基化、乙?；?、甲基化(單、二、三)、瓜氨酸化、遍在蛋白化和蘇素化，并且其中修飾肽的相對水平以與確定未修飾肽的相對量相同的方式來確定。

通過將在生物樣品中檢測到的來自于給定組蛋白肽的srm特征峰面積與至少第二、第三、第四或更多生物樣品中相同組蛋白片段肽的同一srm特征峰面積進行比較，確定組蛋白存在的增加或減少來實現(xiàn)相對定量rsrm；參見圖9。

給定肽的絕對定量可以通過下述方法來實現(xiàn)：

將個體生物樣品中來自于組蛋白的給定片段肽的srm/mrm特征峰面積與摻雜在來自于所述生物樣品的蛋白質(zhì)裂解物中的內(nèi)部片段肽標準品的srm/mrm特征峰面積進行比較。

所述內(nèi)部標準品可以是來自于正在質(zhì)詢的組蛋白的片段肽的標記的合成版本或標記的重組蛋白。這種標準品在消化之前(對于重組蛋白來說強制性的)或之后以已知的量摻入到樣品中，并且可以分開地確定生物樣品中內(nèi)部片段肽標準品和本源片段肽兩者的srm/mrm特征峰面積，然后將兩個峰面積進行比較。

這可以應(yīng)用于未修飾的片段肽和修飾的片段肽，其中所述修飾包括但不限于磷酸化和/或糖基化、乙?；?、甲基化(單、二、三)、瓜氨酸化、遍在蛋白化，并且其中修飾肽的絕對水平可以以與確定未修飾肽的絕對水平相同的方式來確定。

圖8示出了在來自于20位健康志愿者的血清樣品和來自于患有膿毒癥的患者的29個樣品中，通過肽vflenvir(seqidno：4)的srm測量確定的組蛋白h4濃度的結(jié)果。

本發(fā)明的某些條目

下文中列出了本發(fā)明的某些條目：

1.一種用于檢測受試者的生物樣品中游離組蛋白的方法，其中檢測所述組蛋白的表位或肽片段。

2.一種用于疾病或醫(yī)學(xué)病癥的診斷、預(yù)后、風(fēng)險評估、危險分層和/或療法控制的方法，

所述方法包括檢測受試者的生物樣品中的游離組蛋白或其肽片段，

其中所述游離組蛋白或其片段的存在指示所述疾病或醫(yī)學(xué)病癥。

3.條目1或2任一項的方法，其中當所述組蛋白組裝在核小體中時，待檢測的表位不可接近。

4.條目1至3任一項的方法，其中所述表位不具有翻譯后修飾。

5.符合前述條目任一項的方法，其中所述疾病或醫(yī)學(xué)病癥選自涉及炎性響應(yīng)的疾病和醫(yī)學(xué)病癥，所述炎性響應(yīng)與感染性和非感染性病因例如非感染性sirs、細菌、病毒、真菌膿毒癥、重癥膿毒癥、膿毒性休克、腹膜炎、與創(chuàng)傷相關(guān)的損傷包括出血和/或組織損傷、燒傷、急性胰腺炎、缺血再灌注損傷、心肌梗塞、心源性休克、中風(fēng)、急性中毒、血栓栓塞以及介入治療例如心肺轉(zhuǎn)流術(shù)和腫瘤療法相關(guān)。

6.符合前述條目任一項的方法，其中所述生物樣品是體液或組織樣品。

7.條目6的方法，其中所述體液選自血液、血清、血漿、腦脊液、尿液和唾液，優(yōu)選為血漿或血清。

8.符合前述條目任一項的方法，其中所述游離組蛋白或其肽片段源自于典型組蛋白或其同工型。

9.符合條目8的方法，其中所述游離組蛋白或其肽片段選自h1、h2a、h2b、h3、h4及其同工型，優(yōu)選為組蛋白h2a或組蛋白h4。

10.條目9的方法，其中檢測跨越符合seqidno：23的游離組蛋白h2a的20至118位氨基酸殘基的序列中的表位或肽片段。

11.符合條目9的方法，其中檢測跨越符合seqidno：1的游離組蛋白h4的22至102位氨基酸殘基的序列中的表位或肽片段。

12.符合前述條目任一項的方法，其中所述方法是免疫測定法，其包括下述步驟：

a)將所述樣品與下述物質(zhì)相接觸：

(i)特異性針對所述游離組蛋白的第一表位的第一抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，以及

(ii)特異性針對所述游離組蛋白的第二表位的第二抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，

b)檢測所述兩種抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物與所述游離組蛋白的結(jié)合。

13.符合條目12的方法，其中所述第一表位和/或第二表位是存在于跨越seqidno：23的21至53位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h2a的表位。

14.符合條目13的方法，其中所述第一表位存在于跨越seqidno：23的21至29位氨基酸殘基的序列中，和/或所述第二表位存在于跨越seqidno：23的30至53位氨基酸殘基的序列中。

15.符合條目12的方法，其中所述第一表位和/或第二表位是存在于跨越seqidno：1的22至102位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h4的表位。

16.符合條目12的方法，其中所述第一表位存在于跨越seqidno：1的22至30位氨基酸殘基或seqidno：1的67至78位殘基或seqidno：1的92至102位殘基的序列中，和/或所述第二表位存在于跨越seqidno：1的46至102位氨基酸殘基的序列中。

17.符合條目12至16任一項的方法，其中所述方法選自線性免疫測定法(lia)、放射免疫測定法(ria)、化學(xué)發(fā)光和熒光免疫測定法、酶免疫測定法(eia)、酶聯(lián)免疫測定法(elisa)、基于發(fā)光的珠子陣列、基于磁珠的陣列、蛋白質(zhì)微陣列測定法、快速測試格式和稀土穴狀物測定法。

18.符合條目17的方法，其中所述測定法在均相或非均相中進行。

19.符合條目18的方法，其中所述抗體之一被標記，并且另一個抗體被結(jié)合到固相或能夠被選擇性地結(jié)合到固相。

20.符合條目19的方法，其中所述第一抗體和第二抗體分散存在于液體反應(yīng)混合物中，其中作為基于熒光或化學(xué)發(fā)光消光或擴增的標記系統(tǒng)的一部分的第一標記組分被結(jié)合到所述第一抗體，并且所述標記系統(tǒng)的第二標記組分被結(jié)合到所述第二抗體，使得在兩種抗體結(jié)合到待檢測的游離組蛋白或其片段之后，產(chǎn)生可測量的信號，其允許檢測在測量溶液中得到的夾心復(fù)合物。

21.符合條目20的方法，其中所述標記系統(tǒng)包含稀土穴狀物或螯合物與熒光或化學(xué)發(fā)光染料、特別是花青類型的染料的組合。

22.符合條目1至11任一項的方法，其中所述游離組蛋白或其肽片段通過質(zhì)譜法(ms)檢測。

23.符合條目12的方法，其中所述ms分析方法是反應(yīng)監(jiān)測(srm)、多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)或平行反應(yīng)監(jiān)測(prm)。

24.符合條目22或23的方法，所述方法包括下述步驟：

a)對所述樣品進行胰蛋白酶消化；以及

b)在所述ms分析之前和胰蛋白酶消化之后，使用層析方法分離所述樣品。

25.符合條目22至24任一項的方法，其包括使用免疫親和裝置富集所述樣品或使用剝離柱剝離不想要的組分的步驟。

26.符合條目22至25任一項的方法，其包括添加至少一種內(nèi)部參比標準品的步驟，其中所述參比標準品是待檢測的肽或蛋白質(zhì)的同位素標記的版本。

27.符合條目22至26的方法，其中所述方法不包括所述樣品的預(yù)處理步驟和/或蛋白水解消化。

28.符合條目22至27任一項的方法，其中所述游離組蛋白是組蛋白h2a，并且至少對其選自seqidno：24、28、29和30的肽片段進行檢測和定量。

29.符合條目22至27任一項的方法，其中所述游離組蛋白是組蛋白h4，并且至少對其選自seqidno：2、3、4、5、6和7的肽片段進行檢測和定量。

30.一種抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，其特異性針對包含在跨越符合seqidno：23的20至55位或70至118位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h2a的表位。

31.一種抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，其特異性針對存在于符合seqidno：2的、跨越seqidno：1的46至102位氨基酸殘基的序列中的組蛋白h4的表位。

32.一種宿主細胞，其表達符合條目30或31任一項的抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物。

33.一種試劑盒，其包含符合條目30或31任一項的抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物。

34.符合條目30或31任一項的抗體或符合條目33的試劑盒的用途，其用于疾病或醫(yī)學(xué)病癥的診斷、預(yù)后、風(fēng)險評估和/或療法控制的方法中，所述疾病或醫(yī)學(xué)病癥選自涉及炎性響應(yīng)的疾病和醫(yī)學(xué)病癥，所述炎性響應(yīng)與感染性和非感染性病因例如非感染性sirs、細菌、病毒、真菌膿毒癥、重癥膿毒癥、膿毒性休克、腹膜炎、與創(chuàng)傷相關(guān)的損傷包括出血和/或組織損傷、燒傷、急性胰腺炎、缺血再灌注損傷、心肌梗塞、心源性休克、中風(fēng)、急性中毒、血栓栓塞以及介入治療例如心肺轉(zhuǎn)流術(shù)和腫瘤療法相關(guān)。

序列表

<110>b.r.a.h.m.s有限公司

<120>作為生物標志物的游離組蛋白

<130>x3493pctbln

<150>ep15155599.2

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proalaileargargleualaargargglyglyvallysargileser

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ilehisargleuleuarglysglyasntyralagluargileglyala

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151015

argserserargalaglyleuglnpheprovalglyargvalhisarg

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65707580

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leuglyargvalthrilealaglnglyglyvalleuproasnilegln

100105110

alavalleuleuprolyslysthrgluserhishislysalalysgly

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lys

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alaalaileglnalaglulysasnargalaglyserserargglnser

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lysglnthrlysglyvalglyalaserglyserpheargleualalys

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ilelyslysvalalathrprolyslysalaserlysprolyslysala

115120125

alaserlysalaprothrlyslysprolysalathrprovallyslys

130135140

alalyslyslysleualaalathrprolyslysalalyslysprolys

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lys