本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，涉及一種以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物及其制備方法。

背景技術(shù)：

常見小分子抗腫瘤藥物如阿霉素、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、順鉑等在腫瘤治療上有良好效果，其中阿霉素的抗腫瘤活性尤為明顯，但另一方面它們都不具有靶向腫瘤細胞的特性，單獨給藥容易在抑制腫瘤細胞的同時殺傷正常細胞，存在一定細胞毒性，副作用明顯。

鐵蛋白由于其自身球形結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并且可以主動靶向到腫瘤細胞表面鐵蛋白受體1的特征被研究人員開始用于裝載小分子抗腫瘤藥物，從而實現(xiàn)腫瘤藥物的靶向遞送。使用以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物不僅可以增強靶向性，還可以降低藥物細胞毒性，減少正常細胞的殺傷，另外由于鐵蛋白生物相容性強，進入人體內(nèi)也沒有免疫原性。

目前已有多種方法用于以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物，以阿霉素為例，Simsek,E等人(Magic ferritin:A novel chemotherapeutic encapsulation bullet，Journal of Magnetism and Magnetic Materials,2005,293(1):509-513)最早開始利用鐵蛋白在pH 2.0下會發(fā)生解離，然后在中性條件恢復(fù)球形結(jié)構(gòu)的特征裝載阿霉素，并且裝載比例為5:1(阿霉素：鐵蛋白)，蛋白收率只有30％。研究人員改進調(diào)節(jié)pH的方法為梯度模式，Kilic,M等人(A novel protein-based anticancer drug encapsulating nanosphere:apoferritin-doxorubicin complex，J Biomed Nanotechnol,2012,8(3):508-514)將鐵蛋白pH調(diào)至2.5后與阿霉素混合均勻，然后先將pH調(diào)至4穩(wěn)定一段時間，接著繼續(xù)調(diào)節(jié)pH至中性，從而實現(xiàn)藥物的裝載。這種方法雖然蛋白收率有一定的提高，達到55％，裝載比例為28：1，但是操作過程繁瑣，而且鐵蛋白與阿霉素依然有損失。這種通過調(diào)節(jié)pH實現(xiàn)藥物裝載的過程使得蛋白回收率低而且阿霉素損失大，Kim,M等人(pH-Dependent Structures of Ferritin and Apoferritin in Solution:Disassembly and Reassembly，Biomacromolecules,2011,12(5):1629-1640)認(rèn)為通過調(diào)節(jié)pH實現(xiàn)鐵蛋白球形結(jié)構(gòu)打開與恢復(fù)的過程會對鐵蛋白亞基造成結(jié)構(gòu)損傷，從而造成蛋白回收率低的問題。為了解決pH調(diào)節(jié)過程蛋白收率過低的問題，研究人員Minmin Liang等人(H-ferritin–nanocaged doxorubicin nanoparticles specifically target and kill tumors with a single-dose injection，PNAS,2014,111(41):14900-14905)和Lei,Y等人(Targeted tumor delivery and controlled release of neuronal drugs with ferritin nanoparticles to regulate pancreatic cancer progression，J Control Release,2016,232:131-142)進一步嘗試通過8M脲變性鐵蛋白，部分打開球形結(jié)構(gòu)，然后通過透析復(fù)性在鐵蛋白恢復(fù)球形結(jié)構(gòu)的過程中實現(xiàn)藥物的裝載，最終裝載比例分別能夠達到33.1:1和32.5:1，鐵蛋白回收率也較高，達到65％，但是整個裝載藥物的過程復(fù)雜繁瑣，樣品中存在殘留脲，透析過程造成阿霉素的大量浪費，生產(chǎn)成本太高。由于鐵蛋白球形結(jié)構(gòu)打開后再恢復(fù)過程的蛋白損失過大，還有部分研究人員試圖在不打開鐵蛋白球形結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進行藥物裝載，Zhen,Z等人(RGD-Modified Apoferritin Nanoparticles for Efficient Drug Delivery to Tumors，Acs Nano,2013,7(6):4830-4837)通過銅離子介導(dǎo)小分子藥物進入鐵蛋白實現(xiàn)裝載的方法雖然可以一定程度提升裝載比例，能夠達到37:1，但是蛋白仍然損失較大，只有33％的收率，而且樣品中殘留重金屬離子存在一定的安全風(fēng)險。

因此，在本領(lǐng)域中，需要尋找一種簡便高效，既能提高鐵蛋白收率，同時具有高藥物裝載比例的制備工藝。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物及其制備方法。

為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一方面，本發(fā)明提供一種以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的制備方法，所述方法包括以下步驟：

(1)制備鐵蛋白；

(2)對鐵蛋白和抗腫瘤藥物的混合溶液在200-800MPa壓力下進行高壓處理6-20h；

(3)對步驟(2)處理后的產(chǎn)物進行分離純化得到以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物。

本發(fā)明利用高壓處理高壓作用破壞鐵蛋白三軸通道中負責(zé)通道開關(guān)的Arg72-Asp122離子鍵以及Leu110-Leu134疏水相互作用，促使鐵蛋白通道擴增，增加藥物的裝載比例。高壓過程對鐵蛋白球形結(jié)構(gòu)無影響，整個過程不會造成鐵蛋白的損失，從而實現(xiàn)以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的高效制備，并且通過分離純化可以得到以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物，提升生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。

優(yōu)選地，步驟(1)所述鐵蛋白的制備方法包括熱處理和Superdex 200凝膠過濾層析步驟，具體包括以下步驟：

a、將表達有鐵蛋白的工程菌破碎后收集上清溶液，上清液經(jīng)過熱處理后進行冰浴得到粗樣品；

b、將粗樣品離心去除沉淀，取上清液，經(jīng)層析柱純化得到鐵蛋白。

優(yōu)選地，步驟a所述工程菌的構(gòu)建采用PET-28a作為載體，將鐵蛋白基因克隆至所述載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒，而后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21進行鐵蛋白原核表達。

優(yōu)選地，步驟a所述熱處理在溫度70-80℃下進行，例如在71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃下進行。

優(yōu)選地，步驟a所述熱處理的時間為5-15min，例如6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min或14min。

優(yōu)選地，步驟a所述冰浴的時間為10-25min，例如12min、14min、16min、18min、20min、22min或24min。

優(yōu)選地，步驟b所述離心的轉(zhuǎn)速為8000-15000rpm，例如9000rpm、10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm或14000rpm。

優(yōu)選地，步驟b所述離心的時間為20-40min，例如22min、24min、25min、27min、29min、30min、32min、34min、36min、38min或39min。

優(yōu)選地，步驟b所述離心在4℃下進行。

優(yōu)選地，步驟b所述層析柱為Superdex 200凝膠過濾層析柱。

優(yōu)選地，步驟(2)所述抗腫瘤藥物為小分子抗腫瘤藥物。

優(yōu)選地，步驟(2)所述抗腫瘤藥物為阿霉素(DOX)、5-氟尿嘧啶、紫杉醇或順鉑中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選阿霉素。

優(yōu)選地，步驟(2)所述鐵蛋白與抗腫瘤藥物的質(zhì)量比為1:1-3:1，例如1:1、1.2:1、1.5:1、1.8:1、2:1、2.2:1、2.4:1、2.6:1、2.8:1或3:1。

優(yōu)選地，步驟(2)所述鐵蛋白和抗腫瘤藥物的混合溶液是將鐵蛋白和抗腫瘤藥物加入至緩沖溶液中得到的溶液。

優(yōu)選地，所述緩沖溶液為醋酸緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液(PB)或Tris-HCl緩沖溶液中的任意一種。

優(yōu)選地，所述緩沖溶液為pH值4.5-8.5的緩沖溶液；

優(yōu)選地，所述緩沖溶液為pH 4.5的20mM醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、pH 5.5的20mM醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、pH 6.5的20mM磷酸鹽緩沖液、pH 7.5的20mM磷酸鹽緩沖液或pH 8.5的20mM Tris-HCl緩沖溶液中的任意一種，優(yōu)選為pH5.5的20mM醋酸-醋酸鈉緩沖溶液。

優(yōu)選地，步驟(2)所述混合溶液中還包含添加劑。

優(yōu)選地，所述添加劑為氯化鈉、脲或精氨酸中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選精氨酸。

優(yōu)選地，所述添加劑在混合溶液中的濃度為0.01-2mol/L，例如0.01mol/L、0.02mol/L、0.05mol/L、0.08mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L、1mol/L、1.2mol/L、1.4mol/L、1.6mol/L或1.8mol/L。例如混合溶液中所述添加劑為0.01-1M(例如0.01M、0.02M、0.03M、0.05M、0.08M、0.1M、0.3M、0.5M、0.8M或1M，M即mol/L)氯化鈉，0.01-2M(例如0.01M、0.03M、0.05M、0.08M、0.1M、0.3M、0.5M、0.8M、1M、1.2M、1.5M、1.8M或2M)脲或0.01-0.5M(例如0.01M、0.03M、0.05M、0.08M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M或0.5M)精氨酸，優(yōu)選20mM(mM即mmol/L)精氨酸。

在反應(yīng)過程中加入添加劑可以抑制鐵蛋白與阿霉素混合時產(chǎn)生聚集沉淀，同時可以輔助壓力用于鐵蛋白孔道的擴增，提升裝載效率。

步驟(2)所述高壓處理的壓力為200-800MPa，例如220MPa、240MPa、260MPa、280MPa、300MPa、320MPa、350MPa、380MPa、400MPa、450MPa、500MPa、550MPa、600MPa、650MPa、700MPa、750MPa或780MPa。

壓力低于200MPa不會對鐵蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，無法擴增鐵蛋白通道，但是若壓力過大則可能造成鐵蛋白球形結(jié)構(gòu)完全被破壞，蛋白發(fā)生變性，無法繼續(xù)裝載抗腫瘤藥物。

步驟(2)所述高壓處理的時間為6-20h，例如7h、8h、9h、10h、12h、14h、16h、18h或19h。高壓處理時間過短，低于6h的情況下藥物裝載比例較低，此后隨著時間的增加，裝載量逐漸增加并趨于穩(wěn)定，當(dāng)處理時間高于19h基本可以認(rèn)為裝載量不會再繼續(xù)增加，所以無需進一步提升作用時間。優(yōu)選地，所述高壓處理為在650MPa壓力下作用16h。

優(yōu)選地，步驟(3)所述分離純化利用Sephedax G25脫鹽層析來實現(xiàn)。

優(yōu)選地，所述Sephedax G25脫鹽的方法為：將高壓處理后的產(chǎn)物直接上樣，收集蛋白洗脫峰，采用280nm和480nm雙波長檢測，得到裝載藥物的鐵蛋白和游離的抗腫瘤藥物。

優(yōu)選地，所述Sephedax G25脫鹽過程中使用的緩沖液為pH 7.4的200mM PB緩沖液。

優(yōu)選地，經(jīng)Sephedax G25脫鹽后得到的游離的抗腫瘤藥物經(jīng)過凍干、有機溶劑復(fù)溶、冷乙醚沉淀和干燥進行提純回收。即將步驟(3)中Sephedax G25脫鹽分離得到的未被裝載的游離抗腫瘤藥物溶液凍干處理；然后將凍干后的小分子藥物粉末使用有機試劑復(fù)溶，離心去除其中的無機鹽，并且優(yōu)選地，選擇DMF作為溶解試劑；再將復(fù)溶后的小分子藥物使用冷乙醚沉淀并且離心收集，烘干儲存后等待重復(fù)使用。

在本發(fā)明中，對以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物進行載藥定量分析和結(jié)構(gòu)檢測，所述載藥定量分析包括分別根據(jù)鐵蛋白與小分子藥物濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算步驟(3)得到的裝載藥物的鐵蛋白的濃度以及被裝載小分子藥物的濃度，并且由此計算鐵蛋白裝載小分子藥物的裝載比例，公式如下：

$N=\frac{C_{drug}\×M_{HFn}}{C_{HFn}\×M_{drug}}$

其中，所述N表示每個鐵蛋白裝載小分子藥物的個數(shù)；C_drug表示被裝載小分子藥物的質(zhì)量濃度；C_HFn表示裝載藥物的鐵蛋白的質(zhì)量濃度；M_HFn與M_drug分別表示鐵蛋白與小分子藥物的摩爾分子量。

所述結(jié)構(gòu)檢測包括利用Superdex200凝膠過濾色譜、熒光光譜、圓二色光譜和透射電鏡檢測對產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)檢測。

優(yōu)選地，所述Superdex 200凝膠過濾層析中使用的緩沖液為pH 7.4的200mM磷酸鹽緩沖液。

通過本發(fā)明所述的分離純化可以得到裝載藥物的鐵蛋白，回收未被裝載的抗腫瘤藥物，回收的游離藥物可以重復(fù)利用，提升生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。

在本發(fā)明中所述裝載藥物的鐵蛋白的收率是指裝載了藥物的鐵蛋白占原料鐵蛋白的百分比。

作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明所述以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的制備方法包括以下步驟：

(1)制備鐵蛋白：將表達有鐵蛋白的工程菌破碎后收集上清液，上清液在70-80℃下進行熱處理5-15min，而后進行冰浴10-25min得到粗樣品，將粗樣品8000-15000rpm下離心去除沉淀，取上清液，經(jīng)Superdex 200凝膠過濾層析柱純化得到鐵蛋白；

(2)將質(zhì)量比為1:1-3:1的鐵蛋白和抗腫瘤藥物加入至pH值4.5-8.5的緩沖溶液中，混合均勻，并向其中加入添加劑，得到混合溶液，將混合溶液在200-800MPa壓力下進行高壓處理6-20h；

(3)利用Sephedax G25脫鹽層析對步驟(2)處理后的產(chǎn)物進行分離純化得到以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物。

另一方面，本發(fā)明提供了如上所述的制備方法制備得到的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明利用高壓處理得到以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物，本發(fā)明的方法既能提高藥物的裝載比例，使得藥物裝載比例可以達到10:1-22:1(藥物與鐵蛋白的摩爾比)，不會造成蛋白損失，還能夠回收游離的未被裝載的抗腫瘤藥物，提升生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的制備流程示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例1中進行Sephedax G25脫鹽的結(jié)果圖，其中Cond表示溶液電導(dǎo)值；

圖3為本發(fā)明實施例1中制備的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的Superdex200凝膠過濾層析圖，其中Cond表示溶液電導(dǎo)值；

圖4為本發(fā)明實施例1制備的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的熒光光譜圖；

圖5為本發(fā)明實施例1制備的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的圓二色光譜圖；

圖6A為鐵蛋白原樣的透射電鏡圖，其中標(biāo)尺為100nm；

圖6B為本發(fā)明實施例1制備的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的透射電鏡圖,其中標(biāo)尺為100nm；

圖7為本發(fā)明實施例1在使用不同添加劑下的鐵蛋白的藥物裝載比例和載藥鐵蛋白收率結(jié)果圖；

圖8為本發(fā)明實施例2中對鐵蛋白和抗腫瘤藥物混合溶液進行不同處理時鐵蛋白的藥物裝載比例和載藥鐵蛋白收率結(jié)果圖。

具體實施方式

下面通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。

實施例1

在本實施例中，通過以下方法制備以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物(總體流程示意圖如圖1所示)，具體包括以下步驟：

(1)制備鐵蛋白：將表達有鐵蛋白的工程菌(工程菌的構(gòu)建采用PET-28a作為載體，將鐵蛋白基因克隆至載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒，而后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21進行鐵蛋白原核表達)破碎后收集上清液，上清液在75℃下進行熱處理10min，而后進行冰浴15min得到粗樣品，將粗樣品12000rpm下離心30min去除沉淀，取上清液，經(jīng)一步Superdex 200凝膠過濾層析柱純化得到鐵蛋白；

(2)將質(zhì)量比為1.5:1的鐵蛋白和抗腫瘤藥物DOX加入至pH值5.5的20mM醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，混合均勻，分別向其中加入不同添加劑(20mM NaCl、30mM NaCl、300mM脲(Urea)、400mM脲、20mM精氨酸(Arg)或30mM精氨酸，所述濃度為添加劑在所得到的混合溶液中的摩爾濃度)，得到混合溶液，將混合溶液在450MPa壓力下進行高壓處理16h；

(3)利用Sephedax G25脫鹽，所用緩沖溶液為200mM PB，pH 7.4，將高壓處理后的產(chǎn)物直接上樣，收集蛋白洗脫峰，采用280nm和480nm雙波長檢測，收集鐵蛋白洗脫峰，并且將未被裝載的游離小分子藥物分離收集，將脫鹽處理收集的蛋白洗脫樣品直接上樣，緩沖溶液為200mM PB，pH 7.4，采用280nm和480nm雙波長檢測，得到以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物。

圖2是Sephedax G25脫鹽圖，其中Cond表示溶液電導(dǎo)值，圖2表明Sephedax G25脫鹽方法可以將裝載藥物的鐵蛋白與未被裝載的游離小分子藥物完全分離。

分別利用Superdex200凝膠過濾色譜，熒光光譜和圓二色光譜分析裝載藥物后鐵蛋白的結(jié)構(gòu)特征，以比較鐵蛋白原樣以及本制備工藝獲得樣品的分子量大小，三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)。圖3為本實施例制備的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的Superdex凝膠過濾色譜圖，其結(jié)果表明裝載藥物后鐵蛋白的分子量與原樣一致，而且藥物被裝載在鐵蛋白內(nèi)部；圖4為本實施例制備的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的熒光光譜圖(其中HFn代表鐵蛋白，HFn+DOX HP代表裝載藥物后鐵蛋白)，其結(jié)果表明裝載藥物后鐵蛋白的三級結(jié)構(gòu)與鐵蛋白原樣一致；圖5為本實施例制備的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的圓二色光譜圖(其中HFn代表鐵蛋白，HFn+DOX HP代表裝載藥物后鐵蛋白)，其結(jié)果表明裝載藥物后鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)與鐵蛋白原樣一致；以上兩點說明本發(fā)明得到的裝載藥物的鐵蛋白結(jié)構(gòu)正確。

透射電鏡分析檢測裝載藥物后鐵蛋白的球形結(jié)構(gòu)，圖6A為鐵蛋白原樣透射電鏡圖，圖6B為裝載藥物的鐵蛋白的透射電鏡圖，由圖6A和圖6B的比較可以得知，本發(fā)明制備得到的裝載藥物的鐵蛋白維持完整球形結(jié)構(gòu)，與鐵蛋白原樣一致，粒徑大小在12nm，符合理論值，說明本發(fā)明得到的裝載藥物后的鐵蛋白結(jié)構(gòu)正確。

根據(jù)鐵蛋白與小分子藥物濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算步驟(3)得到的裝載藥物的鐵蛋白的濃度以及被裝載小分子藥物的濃度，并且由此計算鐵蛋白裝載小分子藥物的裝載比例，公式如下：

$N=\frac{C_{drug}\×M_{HFn}}{C_{HFn}\×M_{drug}}$

其中，所述N表示每個鐵蛋白裝載小分子藥物的個數(shù)；C_drug表示被裝載小分子藥物的質(zhì)量濃度；C_HFn表示裝載藥物的鐵蛋白的質(zhì)量濃度；M_HFn與M_drug分別表示鐵蛋白與小分子藥物的摩爾分子量。

在加入不同添加的情況下，裝載藥物的鐵蛋白收率以及藥物裝載比例見圖7，由圖7可以看出，20mm Arg作為添加劑時，450MPa作用16h后獲得最高裝載比例，達到14.7:1，并且具有高的載藥鐵蛋白收率，接近100％。

實施例2

在本實施例中，通過以下方法制備以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物(總體流程示意圖如圖1所示)，具體包括以下步驟：

(1)制備鐵蛋白：將表達有鐵蛋白的工程菌(工程菌的構(gòu)建同實施例1)破碎后收集上清液，上清液在75℃下進行熱處理10min，而后進行冰浴15min得到粗樣品，將粗樣品12000rpm下離心30min去除沉淀，取上清液，經(jīng)一步Superdex 200凝膠過濾層析柱純化得到鐵蛋白；

(2)將質(zhì)量比為1.5:1的鐵蛋白和抗腫瘤藥物DOX加入至pH值5.5的20mM醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，混合均勻，向其中加入添加劑精氨酸，得到混合溶液，精氨酸在混合溶液中的摩爾濃度為20mM，將混合溶液分別在250、350、450、500、600和650MPa壓力下進行高壓處理16h，以常壓下常溫放置鐵蛋白與DOX混合溶液16h的處理方式作為對照1(以Atmo RT表示)，以常壓下先調(diào)節(jié)鐵蛋白溶液pH到2，然后將其與DOX混合溶液調(diào)回pH7的處理方式作為對照2(以pH2-pH7表示)；

(3)利用Sephedax G25脫鹽層析對步驟(2)處理后的產(chǎn)物進行分離純化得到以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物(具體處理條件和方法與實施例1相同)。

根據(jù)鐵蛋白與小分子藥物濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算步驟(3)得到的裝載藥物的鐵蛋白的濃度以及被裝載小分子藥物的濃度，并且由此計算鐵蛋白裝載小分子藥物的裝載比例，公式如下：

$N=\frac{C_{drug}\×M_{HFn}}{C_{HFn}\×M_{drug}}$

其中，所述N表示每個鐵蛋白裝載小分子藥物的個數(shù)；C_drug表示被裝載小分子藥物的質(zhì)量濃度；C_HFn表示裝載藥物的鐵蛋白的質(zhì)量濃度；M_HFn與M_drug分別表示鐵蛋白與小分子藥物的摩爾分子量。

在不同處理條件下得到的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的藥物裝載比例以及載藥鐵蛋白收率結(jié)果如圖8所示。

從圖8可以看出，使用壓力處理的樣品最后的裝載藥物的鐵蛋白收率接近100％，遠高于常規(guī)使用pH調(diào)節(jié)的方法。而且隨著作用壓力的增加，藥物裝載比例逐漸增加，當(dāng)壓力為500MPa，作用16h后的藥物裝載比例為16.7:1，稍低于常規(guī)使用pH調(diào)節(jié)方法的結(jié)果，而當(dāng)壓力為650MPa，作用16h后的藥物裝載比例與pH調(diào)節(jié)方法的結(jié)果相似，為22:1。

實施例3

在本實施例中，通過以下方法制備以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物(總體流程示意圖如圖1所示)，具體包括以下步驟：

(1)制備鐵蛋白：將表達有鐵蛋白的工程菌(工程菌的構(gòu)建同實施例1)破碎后收集上清液，上清液在70℃下進行熱處理15min，而后進行冰浴10min得到粗樣品，將粗樣品8000rpm下離心40min去除沉淀，取上清液，經(jīng)一步Superdex 200凝膠過濾層析柱純化得到鐵蛋白；

(2)將質(zhì)量比為1:1的鐵蛋白和抗腫瘤藥物DOX加入至pH 4.5的20mM醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，混合均勻，向其中加入添加劑精氨酸，得到混合溶液，精氨酸在混合溶液中的摩爾濃度為20mM，將混合溶液在500MPa壓力下進行高壓處理20h；

(3)利用Sephedax G25脫鹽層析對步驟(2)處理后的產(chǎn)物進行分離純化得到以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物(具體處理條件和方法與實施例1相同)。

經(jīng)過Superdex200凝膠過濾色譜分析可以得出本實例制備得到以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物分子量正確，而且藥物被裝載在鐵蛋白內(nèi)部。經(jīng)過熒光光譜和圓二色光譜分析可以得出本實施例制備得到的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物中鐵蛋白的三級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)與鐵蛋白原樣的三級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)一致，證明到的裝載藥物的鐵蛋白結(jié)構(gòu)正確。并且通過透射電鏡分析得出，制備得到的裝載藥物的鐵蛋白維持完整球形結(jié)構(gòu)，與鐵蛋白原樣一致，粒徑大小約12nm，符合理論值，說明得到的裝載藥物后的鐵蛋白結(jié)構(gòu)正確。

本實施例獲得的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的藥物裝載比例為20:1，裝載藥物的鐵蛋白的收率接近100％。

實施例4

在本實施例中，通過以下方法制備以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物(總體流程示意圖如圖1所示)，具體包括以下步驟：

(1)制備鐵蛋白：將表達有鐵蛋白的工程菌(工程菌的構(gòu)建同實施例1)破碎后收集上清液，上清液在80℃下進行熱處理5min，而后進行冰浴25min得到粗樣品，將粗樣品15000rpm下離心20min去除沉淀，取上清液，經(jīng)一步Superdex 200凝膠過濾層析柱純化得到鐵蛋白；

(2)將質(zhì)量比為3:1的鐵蛋白和抗腫瘤藥物紫杉醇加入至pH 8.5的20mM Tris-HCl緩沖溶液中，混合均勻，向其中加入添加劑精氨酸，得到混合溶液，精氨酸在混合溶液中的摩爾濃度為20mM，將混合溶液在800MPa壓力下進行高壓處理10h；

(3)利用Sephedax G25脫鹽層析對步驟(2)處理后的產(chǎn)物進行分離純化得到以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物(具體處理條件和方法與實施例1相同)。

經(jīng)過Superdex200凝膠過濾色譜分析可以得出本實例制備得到以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物分子量正確，而且藥物被裝載在鐵蛋白內(nèi)部。經(jīng)過熒光光譜和圓二色光譜分析可以得出本實施例制備得到的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物中鐵蛋白的三級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)與鐵蛋白原樣的三級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)一致，證明到的裝載藥物的鐵蛋白結(jié)構(gòu)正確。并且通過透射電鏡分析得出，制備得到的裝載藥物的鐵蛋白維持完整球形結(jié)構(gòu)，與鐵蛋白原樣一致，粒徑大小約12nm，符合理論值，說明得到的裝載藥物后的鐵蛋白結(jié)構(gòu)正確。

本實施例獲得的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的藥物裝載比例為16.2:1，裝載藥物的鐵蛋白的收率接近100％。

實施例5

本實施例與實施例4不同之處僅在于，步驟(2)中不加入添加劑，其余制備方法以及條件的選擇均與實施例4相同。本實施例獲得的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物中鐵蛋白的結(jié)構(gòu)也能夠與鐵蛋白原樣保持一致，其獲得的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的藥物裝載比例為10:1，裝載藥物的鐵蛋白的收率接近100％。

對比例1

與實施例3不同之處僅在于，步驟(2)中高壓處理的壓力為180MPa，其余制備方法以及條件的選擇均與實施例3相同。本實施例獲得的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物中鐵蛋白的結(jié)構(gòu)也能夠與鐵蛋白原樣保持一致，其獲得的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的藥物裝載比例為7:1。

對比例2

與實施例4不同之處僅在于，步驟(2)中高壓處理的壓力為900MPa，其余制備方法以及條件的選擇均與實施例4相同。本實施例中鐵蛋白的結(jié)構(gòu)遭到破壞，裝載藥物的鐵蛋白的收率僅為45％。

對比例3

與實施例3不同之處僅在于，步驟(2)中高壓處理的時間為5h，其余制備方法以及條件的選擇均與實施例3相同。本實施例獲得的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物中鐵蛋白的結(jié)構(gòu)也能夠與鐵蛋白原樣保持一致，其獲得的以鐵蛋白為載體的抗腫瘤藥物的藥物裝載比例為8:1。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述工藝步驟才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。