本發(fā)明涉及屬于中藥技術領域，具體是一種雙和湯標準湯的HPLC指紋圖譜測定方法。

背景技術：

雙和湯首載于南宋時期的《太平惠民和劑局方》卷五中，治諸虛，為寶慶新增方。原方記載為白芍藥(七兩半)，當歸(洗，酒浸)、黃芪(蜜炙)、川芎、熟地黃(凈洗，酒蒸，各三兩)，甘草(炙)、肉桂(去皮，不見火，各二兩二錢半)。上為細末，每服二錢，水一盞半，生姜三片，棗一枚，煎去六分，空心，食前服。治男子、婦人五勞、六極、七傷，心腎俱虛，精血氣少，遂成虛勞。百骸枯瘁，四肢倦怠，寒熱往來，咳嗽咽干，行動喘乏，面色黃，略有所觸，易成他疾?；騻诶洌瑒t宿食不消，脾疼腹痛，瀉痢吐逆；或傷于熱，則頭眩眼暈，痰涎氣促，五心煩熱；或因饑飽動作，喜怒驚恐，病隨而至，或虛脹而不思食，或多食而不生肌肉，心煩則虛汗盜汗，一切虛勞不敢服燥藥者，并宜服之。常服調中養(yǎng)氣，益血育神，和胃進食，補虛損。忌生冷、果子等物。

宋朝時期的《增廣太平惠民和劑局方》卷五·寶慶新增方中，補虛損。組成同《太平惠民和劑局方》。

元朝時期，危亦林的《世醫(yī)得效方》卷第八·十方脈雜醫(yī)科中，虛損。組成同《太平惠民和劑局方》。

明朝時期，董宿的《奇效良方》卷之二十一·諸虛通治方中，治男子婦人，五勞七傷，氣血不足，面色痿黃，四肢倦乏，將為虛勞之證，常服養(yǎng)氣益血。上口父咀，每服三錢，水一盞，生姜三片，棗一枚，煎，空心服。組成同《太平惠民和劑局方》。

清朝時期，吳謙的《醫(yī)宗金鑒》卷二十六·冊補名醫(yī)方論(一)、雜病心法要訣·卷四十·虛勞治法、婦科心法要訣·卷四十四·調經證治和婦科心法要訣·卷四十四·調經門匯方中的雙和飲，治大病之后，虛勞氣乏。補血益氣，不熱不冷，溫而調之。白芍二錢，黃芪炙一錢半，甘草炙七分，中桂七分，當歸一錢，熟地黃一錢，川芎七分，生姜三片，大棗二枚，水二盞，煎一盞，溫服。虛勞，若里不急、腹不痛有是證者，則當以溫養(yǎng)氣血。婦科·調經證治，平補氣血，即十全大補湯減人參、茯苓、白術也。吳謙的《名醫(yī)方論》亦記載雙和飲。

現代王世民的《局方別裁》第六章補益劑中收載雙和湯，“溫補氣血”(1992版)。謝海洲的《中醫(yī)歷代良方全書》中，雙和湯為《太平惠民和劑局方》方，又名雙和飲。白芍、熟地、黃芪、當歸各10克，川芎、炙甘草、肉桂各4.5克。水煎服。功能補陰血，養(yǎng)陽氣。治大病后期，陰血陽氣未復，氣短乏力，暈眩、心悸，舌質淡，脈濡弱。現代臨床上常用于疲勞、久病體質虛弱、精力缺乏的癥狀。近年來雙和湯的臨床應用研究已有報道：韓國韓醫(yī)院研究院的馬珍烈等人利用雙和湯或雙和湯的乳酸桿菌發(fā)酵物制備成兩種保健食品，一種應用于酒精引起的宿醉；另一種用于治療骨質疏松癥。

中藥經典名方湯劑作為傳統的中醫(yī)臨床用藥的主要劑型，具有組方合理、療效確切、易于吸收、起效較快等優(yōu)點,深受廣大患者的信賴。卻因調配、攜帶、臨時煎煮、久置容易發(fā)生霉敗變質、湯液味苦和量大，以及標準難以統一，嚴重影響其臨床療效等缺點，不能適應現代人的生活要求。為了保持湯劑的優(yōu)勢,克服湯劑的種種不足,在國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項項目的大力支持下及院士、行業(yè)專家的反復探討后，以經典名方基準湯的質量屬性為評價指標，生產出與其在質量及藥效基本保持一致的標準顆粒劑。

“經典名方標準顆?！毕抵敢曰鶞蕼珓┑年P鍵質量屬性為評價指標，對顆粒制備過程的藥材提取、濃縮、干燥等關鍵工藝進行研究，應用現代生產技術制備與基準湯劑的關鍵質量屬性基本一致的顆粒。

根據《經典名方標準顆粒研究專家共識—基準湯劑定義、制備、質量屬性及應用》有關要求，進行雙和湯基準湯的相關考察和研究。

與指標成分含量測定的質量分析方法相比，指紋圖譜能夠比較全面地反映中藥化學成分的種類和數量，在中藥復方制劑有效成分尚未完全闡明的現狀下，可實現對中藥內在質量的綜合評價和對其整體物質的有效控制，是目前中藥及其制劑質量控制的有效手段之一。中藥指紋圖譜的檢測方法有色譜法、光譜法、波譜法等。色譜法主要包括薄層色譜、高效液相色譜、氣相色譜、毛細管電泳等，其中高效液相色譜法具有高效、快速、靈敏、重現性好的特點，與紫外檢測器(UV)、二甲管陣列檢測器(DAD)、蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)和質譜檢測器(MS)等多種檢測器聯用，可用于中藥中多種復雜成分的分析檢測，現已成為中藥指紋圖譜研究的主流方法。

技術實現要素：

有鑒于此，本發(fā)明旨在提供一種雙和湯標準湯的HPLC指紋圖譜測定方法，有效的控制了雙和湯標準顆粒劑的質量，保證了藥物的療效，使經典名方得到了更為正規(guī)的質量控制。

為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是這樣實現的：一種雙和湯標準湯的HPLC指紋圖譜測定方法，包括如下步驟：

(1)供試樣品溶液的制備：精密量取不同批次的雙和湯的標準湯，加載于已活化好的SPE柱，先用30體積份數的純水洗脫，棄去洗脫液，再用10重量份數的甲醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液低溫濃縮至干，最后用2體積份數的甲醇溶解，用微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，得供試樣品溶液，備用；

(2)混合對照品溶液的制備：精密稱取5-HMF、芍藥苷、毛蕊異黃酮苷、甘草苷、阿魏酸、桂皮醛、甘草酸、6-姜酚對照品適量，加甲醇配制成每1體積份數含5-HMF、芍藥苷、毛蕊異黃酮苷、甘草苷、阿魏酸、桂皮醛、甘草酸、6-姜酚分別為0.01、0.12、0.03、0.01、0.01、0.04、0.05和0.03重量份數的混合對照品溶液，搖勻，濾過，備用；

(3)單味藥材陰性對照品溶液的制備：按照3倍處方量稱取各單味藥材粉末，粉碎，過篩得粗粉，取3倍處方量粗粉至全自動煎藥鍋中，精密量取純水，浸泡，煎煮，煎煮期間攪拌，趁熱過濾，濾液混合均勻，取適量用純水定容至250mL容量瓶中即為單味藥材陰性對照品溶液，備用；

(4)分別精密吸取供試樣品溶液、混合對照品溶液和單味藥材陰性對照品溶液注入高效液相色譜儀進行測定，分別得到供試樣品溶液、混合對照品溶液和單味藥材陰性對照品溶液的液相色譜；

(5)采用國家藥典委員會制定的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件，對供試樣品溶液、混合對照品溶液和單味藥材陰性對照品溶液的液相色譜進行數據匹配，即得標準指紋圖譜。

所述重量份數與所述體積份數的關系為g/mL。

進一步地，所述步驟(4)的色譜條件如下：

色譜柱：Accurasil C18色譜柱，4.6mm×250mm，5μm；

流動相：乙腈-0.1％磷酸水溶液；

流速：1.0mL/min；

波長：280nm；

進樣量：10μL；

柱溫：30℃；

理論塔板數按芍藥苷峰計算不低于7000；

梯度洗脫程序見表1：

表1指紋圖譜梯度洗脫程序

進一步地，所述標準指紋圖譜包括16個共有峰：峰2、3、4來自白芍，峰5來自炙黃芪，峰6、11、14來自炙甘草，峰7、8、9、16來自酒當歸和川芎，峰10、12、13來自肉桂，峰15來自生姜，峰1來自酒熟地、川芎，以4號峰為參照峰。

進一步地，所述標準指紋圖譜中1號峰為5-HMF，4號峰為芍藥苷，5號峰為毛蕊異黃酮苷，6號峰為甘草苷，7號峰為阿魏酸，13號為桂皮醛，14號峰為甘草酸，15號為6-姜酚。

進一步地，所述步驟(1)中用0.22μm微孔濾膜過濾。

進一步地，所述單味藥材陰性對照品溶液的制備方法如下：按照3倍處方量稱取各單味藥材粉末，粉碎，過10-40目篩得粗粉；取3倍處方量粗粉至全自動煎藥鍋中，精密量取900mL純水倒入，浸泡30min，煎煮75min，煎煮期間攪拌三次，趁熱用300目濾布過濾，濾液體積約為500mL，濾液混合均勻，取三分之一用純水定容至250mL容量瓶中即為單味藥材陰性對照品溶液，備用。

進一步地，所述雙和湯的標準湯的制備方法如下：按照處方比例稱取九味藥材，粉碎，過10-40目篩得粗粉；取三倍處方量粗粉至全自動煎藥鍋中，精密量取900mL純水倒入，浸泡30min，煎煮75min，煎煮期間攪拌三次，趁熱用300目濾布過濾，濾液體積約為500mL，濾液混合均勻，取三分之一用純水定容至250mL容量瓶中即為標準湯原液，備用。

本發(fā)明還提供了上述方法在雙和湯的藥物制劑的質量檢測和質量控制中的應用。

本發(fā)明還提供了一種雙和湯標準顆粒的質量控制方法，包括以下步驟：

(1)按照上述測定方法建立雙和湯標準湯的標準指紋圖譜；

(2)取待檢的雙和湯標準顆粒，按照上述測定方法得到指紋圖譜；

(3)將步驟(2)得到的指紋圖譜與步驟(1)得到的標準指紋圖譜進行對比，符合即為合格產品，不符合即為不合格產品。

雙和湯標準顆粒供試樣品溶液的制備：取裝量差異項下的雙和湯標準顆粒，研細，取約5g，精密稱定，置100mL量瓶中，加水適量，超聲處理(功率250W，頻率50kHz)10min使溶解，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取4ml混懸液至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲處理(功率250W，頻率50kHz)10min，然后離心(轉速為每分鐘8000轉)15min，精密移取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

相對于現有技術，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢：

(1)本發(fā)明在建立雙和湯標準顆粒的指紋圖譜過程中，確認了16個共有特征峰，并對其相對保留時間和相對峰面積進行了研究，保證了制劑的化學組成穩(wěn)定性和使用安全性。

(2)雙和湯標準顆粒中化學成分復雜，要實現其特征指紋峰的分離難度大，本發(fā)明在建立起指紋圖譜的過程中，采用了梯度洗脫的方法，解決了指紋特征峰難以分開和雜質峰的干擾問題。

(3)建立雙和湯標準顆粒的指紋圖譜，克服了單一成分含量測定難以反映整體含量的缺陷，可以從整體上、宏觀上控制雙和湯標準顆粒劑的內在質量，保證了藥物的療效，使經典名方得到了更為正規(guī)的質量控制。

(4)以雙和湯標準顆粒中各有效成分指紋圖形作為一個整體看待，注重各個特征峰的前后順序和相互關系，既避免了因只測定一、二個化學成分而判定雙和湯標準顆粒整體質量的片面性，又減少了為質量達標而人為處理的可能性。為完整、準確評價雙和湯標準顆粒的質量提供了新的方法和手段。

(5)本發(fā)明方法穩(wěn)定性好、精密度高、重現性好、便捷且易于掌握。

附圖說明

圖1為不同廠家色譜柱HPLC對比圖譜。

圖2為不同柱溫HPLC對比圖譜。

圖3為200-400nm全波長掃描圖。

圖4為不同波長HPLC對比圖譜。

圖5為不同梯度HPLC對比圖譜。

圖6為不同前處理HPLC對比圖譜。

圖7為10批標準湯HPLC對比圖譜。

圖8為10批標準湯指紋圖譜(匹配后)。

圖9為10批標準湯指紋圖譜(共有模式圖譜)。

圖10為混合對照品和全方HPLC對比圖譜。

圖11為全方與單味藥材陰性對照指紋圖譜比較圖譜。

具體實施方式

實施例一雙和湯標準湯的HPLC指紋圖譜測定方法

1.1儀器和試劑

儀器：

試劑：

1.2樣品制備：

1.2.1樣品及供試樣品溶液的制備

(1)樣品的制備：按照處方比例稱取九味藥材，粉碎，過10-40目篩得粗粉；取三倍處方量粗粉至全自動煎藥鍋中，精密量取900mL純水倒入，浸泡30min，煎煮75min，煎煮期間攪拌三次，趁熱用300目濾布過濾，濾液體積約為500mL，濾液混合均勻，取三分之一用純水定容至250mL容量瓶中即為標準湯原液，備用，根據此方法制備10批各不同批次的標準湯。

(2)供試樣品溶液的制備：從10批標準湯中分別精密量取4mL，加載于已活化好的SPE柱，先用30mL純水洗脫，棄去洗脫液，再用10mL甲醇洗脫，收集洗脫液，將洗脫液低溫濃縮至干，最后用2mL甲醇溶解，用0.22μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，得供試品溶液，備用。

1.2.2混合對照品溶液的制備：精密稱取5-HMF、芍藥苷、毛蕊異黃酮苷、甘草苷、阿魏酸、桂皮醛、甘草酸、6-姜酚對照品適量，加甲醇配制成每1mL含5-HMF、芍藥苷、毛蕊異黃酮苷、甘草苷、阿魏酸、桂皮醛、甘草酸、6-姜酚分別為0.01、0.12、0.03、0.01、0.01、0.04、0.05和0.03mg的混合對照品溶液，搖勻，濾過，備用。

芍藥苷(批號：110736-201539純度≥96.4％)，阿魏酸(批號：110773-201313純度≥99.6％)，甘草苷(批號：11610-201106純度≥93.7％)，甘草酸(批號：110731-201418純度≥93.1％)，桂皮醛(批號：110710-201408純度≥99.4％)均購自中國食品藥品檢定研究院；5-HMF(批號：h40807純度≥99.0％)，毛蕊異黃酮苷(批號：AB019C純度≥98.0％)，6-姜酚(批號：AW025G01純度≥99.0％)均購自天津市一方科技有限公司。

1.2.3單味藥材陰性對照品溶液的制備：按照3倍處方量稱取各單味藥材粉末，粉碎，過10-40目篩得粗粉；取3倍處方量粗粉至全自動煎藥鍋中，精密量取900mL純水倒入，浸泡30min，煎煮75min，煎煮期間攪拌三次，趁熱用300目濾布過濾，濾液體積約為500mL，濾液混合均勻，取三分之一用純水定容至250mL容量瓶中即為單味藥材陰性對照品溶液，備用。

1.3色譜條件

色譜柱：Accurasil C18色譜柱，4.6mm×250mm，5μm；

流動相：乙腈-0.1％磷酸水溶液；

流速：1.0mL/min；

波長：280nm；

進樣量：10μL；

柱溫：30℃；

理論塔板數按芍藥苷峰計算不低于7000；

梯度洗脫程序見表1：

表1指紋圖譜梯度洗脫程序

1.3.1色譜柱的選擇

分別比較資生堂C18，Cosmosil C18，Accurasil C18三個廠家的色譜柱，結果見圖1。(A：PAK C18色譜柱B：Cosmosil C18色譜柱C：Accurasil C18色譜柱)

從圖1可知：樣品在AccurasilC18色譜柱下各色譜峰的分離度良好，特征峰明顯且峰形較好。因此最終選擇AccurasilC18色譜柱作為HPLC指紋圖譜的色譜柱。

1.3.2柱溫的選擇

分別對20℃、30℃和40℃的柱溫條件進行篩選和優(yōu)化，結果見圖2。(A：20℃B：40℃C：30℃)

從圖2可知：柱溫30℃條件下色譜峰分離度良好，受干擾因素影響小。因此最終選擇柱溫30℃作為HPLC指紋圖譜的最佳柱溫條件。

1.3.3檢測波長的選擇

采用PDA檢測器對樣品進行200-400nm范圍內全波長掃描，對230、254、280nm波長下的色譜圖進行比較，結果見圖3、圖4。(A：波長230nm B：波長254nm C：波長280nm)

從上圖3、圖4可知：三個波長下色譜峰的數目、吸收強度、分離度存在差異，綜合考慮，當波長在280nm時，色譜峰數目最多，各個色譜峰吸收強度較平均，且分離度良好，因此最終選用280nm波長為最佳檢測波長。

1.3.4流動相的選擇

首先對流動相系統水-乙腈、0.1％磷酸水溶液-乙腈、1％醋酸-乙腈、水-甲醇、0.1％磷酸水溶液-甲醇、1％醋酸水溶液-甲醇進行篩選。結果0.1％磷酸水溶液-乙腈分離度良好，特征峰明顯，最終確定0.1％磷酸水溶液-乙腈為流動相系統。其次又優(yōu)化了不同比例洗脫梯度，洗脫梯度1、2、3如下表2-1、表2-2、表2-3，結果見圖5。(A：梯度1B：梯度2C：梯度3)

表2-1雙和湯HPLC指紋圖譜梯度1洗脫表

表2-2雙和湯HPLC指紋圖譜梯度2洗脫表

表2-3雙和湯HPLC指紋圖譜梯度3洗脫表

從圖5可知：洗脫梯度3條件下色譜峰分離度良好，保留時間適宜，因此最終選擇梯度3作為最佳洗脫梯度。

1.3.5樣品前處理的選擇

對樣品原液、60％甲醇醇沉法及SPE固相萃取法進行了篩選，結果見圖6。(A：SPE固相萃取B：60％甲醇沉法2C：樣品原液)

從圖6可知：SPE固相萃取取法富集樣品在色譜條件下色譜峰數目較多，且各色譜峰紫外吸收和分離度良好，因此最終選擇SPE固相萃取法富集法為最佳前處理法。

1.4方法學考察

1.4.1儀器精密度試驗

取1.2.2項下方法制備混合對照品溶液，按1.3項下的色譜條件，連續(xù)進樣5次，每次進樣10μL，以芍藥苷色譜峰(4號峰)的保留時間和峰面積作為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，RSD分別為0.4％和2.2％，均小于3.0％，表明本儀器精密度良好。

1.4.2穩(wěn)定性試驗

取1.2.1(2)項下方法制備供試樣品溶液，按1.3項下的色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24h進樣1次，每次進樣10μL，以芍藥苷色譜峰的保留時間和色譜峰作為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，RSD分別為0.7％和2.8％，均小于3.0％，表明該樣品在24h內穩(wěn)定性良好。

1.4.3重復性試驗

按雙和湯原處方組成，平行稱取各味藥5份，按1.2.1(1)項下方法制備，且按1.2.1(2)項下方法制備供試樣品溶液5份，按1.3項下的色譜條件，每份供試品溶液進樣10μL，以芍藥苷色譜峰的保留時間和峰面積作為參照，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差RSD值，RSD分別為1.3％和2.5％，均小于3.0％，表明本方法重復性良好。

1.5 HPLC指紋圖譜的建立及技術參數分析

1.5.1圖譜采集

取1.2.1(1)項下方法制備的10批標準湯，按1.2.1(1)項下方法制備供試樣品溶液，按1.3項下的色譜條件進行測定，進樣量10μL，記錄HPLC指紋圖譜，結果見圖7。

1.5.2參照峰的選擇

首先芍藥苷為君藥白芍的主要活性成分，其次從供試品溶液指紋圖譜可知，芍藥苷為已知化學成分，且化學性質穩(wěn)定，其色譜峰在各色譜峰中，分離度較好和峰面積較大的，故選取4號峰(芍藥苷)作為指紋圖譜的參照峰。

1.5.3共有峰的標定和共有峰的相對保留時間和相對峰面積的計算

采用國家藥典委員會制定的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2012版)，對10批湯劑圖譜進行數據匹配，結果見圖8。由圖8可見，其中16個峰為10批湯劑所共有，因此確定16個峰為共有色譜峰，以中位數法確定共有模式，結果見圖9，以芍藥苷峰(4號峰)的保留時間和色譜峰面積為參照峰，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表3、表4。

表3雙和湯標準湯劑共有峰相對保留時間

表4雙和湯標準湯劑共有峰相對峰面積

從表3、表4可見：10批雙和湯標準湯劑的共有峰的相對保留時間RSD≤0.82％，相對峰面積RSD≤0.82％，兩者均小于3％，因此該方法可用于雙和湯的HPLC指紋圖譜測定。

1.5.4特征峰的指認

首先采用混合對照品比較法進行特征峰指認，分別精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結構見圖10。A(1：5-HMF 4：芍藥苷5：毛蕊異黃酮苷6：甘草苷7：阿魏酸13：桂皮醛14：甘草酸15：6-姜酚)

從圖10可見，確定1號峰為5-HMF，4號峰為芍藥苷，5號峰為毛蕊異黃酮苷，6號峰為甘草苷，7號峰為阿魏酸，13號為桂皮醛，14號峰為甘草酸，15號為6-姜酚，因此確定這8個峰為雙和湯HPLC指紋圖譜的特征峰。

1.5.5藥材歸屬分析

取1.2.1(2)項下的1號湯劑供試樣品溶液和1.2.3項下方法制備的單味藥材陰性對照品溶液各10μL，按照1.3項下的色譜條件進行測定，得到全方和方中各單味藥材陰性對照液的HPLC圖譜，結果見圖11。(A：全方B：白芍陰性對照C：當歸陰性對照D：川芎陰性對照E：熟地陰性對照F：黃芪陰性對照G：甘草陰性對照H：肉桂陰性對照I：生姜陰性對照J：大棗陰性對照)

從圖11可見：通過對比相對保留時間，對雙和湯標準湯劑中共有峰的來源進行追溯，得出峰2、3、4來自君藥白芍，峰5來自炙黃芪，峰6、11、14來自炙甘草，峰7、8、9、16來自酒當歸和川芎，峰10、12、13來自肉桂，峰15來自生姜，峰1來自酒熟地、川芎。

3.7.6 10批雙和湯標準湯樣品相似度評價

采用國家藥典委員會制定的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2012版)，以對照譜圖上標示的色譜峰作為匹配點，進行多點校正，并計算結果相似度，結果見表5。

表5 10批雙和湯標準湯劑相似度計算結果

從表5可見：10批雙和湯標準湯指紋圖譜的相似度在0.938-0.983之間，平均值為0.978，結果表明：10批雙和湯標準湯劑質量一致性較高。

實施例二雙和湯標準顆粒的質量控制方法

一種雙和湯標準顆粒的質量控制方法，包括以下步驟：

(1)按照實施例一中1.2.1(1)中的方法制備雙和湯標準湯，采用實施例一中的測定方法建立雙和湯標準湯的標準指紋圖譜；

(2)取待檢的雙和湯標準顆粒，按照實施例一中的測定方法得到指紋圖譜；

(3)將步驟(2)得到的指紋圖譜與步驟(1)得到的標準指紋圖譜進行對比，符合即為合格產品，不符合即為不合格產品。

雙和湯標準顆粒供試樣品溶液的制備：取裝量差異項下的雙和湯標準顆粒，研細，取約5g，精密稱定，置100mL量瓶中，加水適量，超聲處理(功率250W，頻率50kHz)10min使溶解，放冷，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取4ml混懸液至10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲處理(功率250W，頻率50kHz)10min，然后離心(轉速為每分鐘8000轉)15min，精密移取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。