專(zhuān)利名稱(chēng)：一種半定量檢測(cè)尿微量白蛋白膠體硒試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種半定量檢測(cè)尿微量白蛋白膠體硒試紙，通過(guò)此試紙可以簡(jiǎn)單快速地直接判 定尿液中白蛋白含量是否高于正常水平，可應(yīng)用于糖尿病腎病的早期輔助臨床診斷。屬于疾 病體外檢測(cè)儀器設(shè)備的范疇。二、 背景技術(shù)糖尿病腎病是糖尿病的慢性腎臟并發(fā)癥。糖尿病腎病一般是指糖尿病性腎小球硬化癥， 其臨床表現(xiàn)為蛋白尿、水腫、高血壓或氮質(zhì)血癥，并有空腹血糖增高或糖尿病癥狀。本病 無(wú)明顯地區(qū)差異，糖尿病I型、II型均可引起。據(jù)統(tǒng)計(jì)，病程在l 0-2 0年的糖尿病患者 ，無(wú)論年齡大小，約有5 0%發(fā)生臨床腎臟病變。糖尿病患者約有5%-1 5%死于腎功能 衰竭。到目前為止尚無(wú)特效的治療方法。如能及早診斷和治療，預(yù)防腎功能不全的發(fā)生發(fā)展 ，可延長(zhǎng)患者壽命。1974年尿微量白蛋白(microalbunminuria， MAU)被首次提出并用于臨床，至20世紀(jì) 80年代Mogensen將它作為糖尿病腎病(DN)分期中的亞臨床過(guò)渡階段，MAU從而成為DN早 期診斷的窗口。近年來(lái)MAU已明確作為包括糖尿病(DM)、高血壓及其他慢性腎臟病患者甚 至普通人群心血管并發(fā)癥、腎臟預(yù)后及死亡的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，許多有關(guān)慢性腎臟病和糖尿病 腎病指南中已將尿白蛋白的檢測(cè)列為高危人群的篩査指標(biāo)。尿微量白蛋白(microalbunmi皿ria， MAU )是指尿中白蛋白含量超出健康人參考范圍 ，但不能用常規(guī)的方法檢測(cè)出這種微量的變化。MAU排出增加是疾病早期的改變，對(duì)疾病的 早期診斷，早期治療有重要的參考價(jià)值和臨床意義。MAU是預(yù)測(cè)糖尿病腎病、高血壓、心血 管疾病血管損傷的敏感指標(biāo)，也可在隱匿腎炎及腎炎恢復(fù)期尿中出現(xiàn)，是比較敏感的早期發(fā) 現(xiàn)腎損傷的重要指標(biāo)。尿微量白蛋白(MAU)是公認(rèn)的糖尿病腎病的早期診斷依據(jù)之一。目前MAU檢測(cè)方法很多 ，有放射免疫法、酶免疫法和免疫濁度法，但是RIA利用放射性同位素作為示蹤劑，影響操作 人員的身體健康，并嚴(yán)重污染環(huán)境，使用的儀器較貴，且RIA的測(cè)定流程較長(zhǎng)，在臨床應(yīng)用上 具有局限性；化學(xué)發(fā)光法的成本較高，試劑及儀器皆依賴(lài)于進(jìn)口； ELISA檢測(cè)需要儀器，也不 適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。膠體硒免疫層析法具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需任何儀 器設(shè)備、結(jié)果判斷直觀可靠、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)。本發(fā)明的目的在于提供一種半定量檢測(cè)尿微 量白蛋白膠體硒試紙，其無(wú)需任何儀器設(shè)備、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作 簡(jiǎn)便、結(jié)果判斷直觀可靠，同時(shí)有效地降低了檢測(cè)成本，簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，縮短了檢測(cè)時(shí)間 ，具有經(jīng)濟(jì)適用的特點(diǎn)。三、發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明通過(guò)雙抗夾心法建立一種測(cè)定尿液中白蛋白含量的膠體硒試紙。通過(guò)對(duì)檢測(cè)區(qū)顯 色條帶數(shù)目來(lái)判定尿液中白蛋白是否高于正常水平，從而實(shí)現(xiàn)了糖尿病腎病、高血壓、心血 管疾病血管損傷疾病、隱匿腎炎的預(yù)警作用及早期輔助診斷。本發(fā)明在塑料底板上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體硒標(biāo)記部分、檢測(cè)反應(yīng)部分及吸水 部分。其中，所述樣液吸收部分為濾紙或玻璃纖維膜，檢測(cè)時(shí)起吸收樣品溶液的作用，便于樣 品溶液向上移動(dòng)。所述膠體硒標(biāo)記部分為玻璃纖維膜或醋酸纖維膜或尼龍膜，其上標(biāo)記的物質(zhì)為MAU單克 隆抗體l。所述檢測(cè)反應(yīng)部分為硝酸纖維膜，其上具有兩條檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，其中檢測(cè)帶T1結(jié)合有 精確定量的MAU單克隆抗體2， T2結(jié)合一定量的MAU單克隆抗體2，質(zhì)控帶包被抗鼠IgG。依據(jù) 顯色條帶數(shù)目來(lái)判斷是否患有糖尿病腎病等。所述吸水部分為濾紙或玻璃纖維膜，用于引流樣品溶液。試紙條的組裝在塑料底板上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體硒標(biāo)記部分、檢測(cè)反應(yīng)部 分及吸水部分，即成為尿微量白蛋白半定量檢測(cè)試紙。本發(fā)明的原理是玻璃纖維膜上包被一定量硒標(biāo)MAU單克隆抗體1，當(dāng)尿液中白蛋白含量低 于正常量時(shí)，尿液中的白蛋白首先與硒標(biāo)單抗l結(jié)合，即白蛋白+硒標(biāo)單抗l復(fù)合物將隨同尿 液在膜上運(yùn)行至檢測(cè)帶T1，與其上精確定量的正常量的MAU單克隆抗體2發(fā)生結(jié)合，檢測(cè)帶 Tl顯色，檢測(cè)帶T1顯色，T2不顯色，硒標(biāo)單抗l繼續(xù)隨同尿液在膜上運(yùn)行至質(zhì)控帶，質(zhì)控帶 顯色，此后此為陰性結(jié)果。當(dāng)尿液中白蛋白含量高于正常量時(shí)，白蛋白與膠體硒標(biāo)記的單抗 l結(jié)合，即白蛋白+硒標(biāo)單抗l復(fù)合物將隨同尿液在膜上運(yùn)行至檢測(cè)帶l，與其上精確定量的正 常量的MAU單克隆抗體2發(fā)生結(jié)合，檢測(cè)帶T1顯色，多余的白蛋白+硒標(biāo)單抗l復(fù)合物會(huì)與檢測(cè) 帶T2上的MAU單克隆抗體2發(fā)生結(jié)合，檢測(cè)帶T2顯色，硒標(biāo)單抗l繼續(xù)隨同尿液在膜上運(yùn)行至質(zhì)控帶，質(zhì)控帶顯色，此后此為陽(yáng)性結(jié)果。本發(fā)明的積極意義和效果在于本發(fā)明的尿微量白蛋白半定量檢測(cè)試紙通過(guò)硒標(biāo)試劑的 免疫層析作用進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了對(duì)臨床檢測(cè)更有意義的半定量檢測(cè)。檢測(cè)全過(guò)程在io分鐘內(nèi)判定 結(jié)果，可以方便地實(shí)現(xiàn)家庭檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，具有特異性高，檢測(cè)程序簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠 ，操作人員無(wú)需專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，按說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)即可得到檢測(cè)結(jié)果，從而有助于糖尿病腎病的早期 診斷和改善，還可以實(shí)現(xiàn)早期腎損傷的及時(shí)監(jiān)測(cè)與跟蹤。四

圖l為本發(fā)明結(jié)構(gòu)的正面示意圖。l是樣液吸收部分、2是膠體硒標(biāo)記部分、3是檢測(cè)反應(yīng)部分，由檢測(cè)帶T1、檢測(cè)帶T2、 質(zhì)控帶C組成；4是吸水部分。圖2為本發(fā)明的使用結(jié)果說(shuō)明圖。圖2中a檢測(cè)帶l顯色，檢測(cè)帶2不顯色，質(zhì)控帶顯色， 為陰性結(jié)果，表明尿液中白蛋白的含量低于20ug/ml，正常。圖2中b檢測(cè)帶l顯色，檢測(cè)帶2 顯色，質(zhì)控帶顯色，為陽(yáng)性結(jié)果，表明尿液中白蛋白的含量高于20ug/ml，患病。圖2中c檢 測(cè)帶l、 2和質(zhì)控帶均不顯色，表明試紙條失效。五具體實(shí)施方式
實(shí)施例一 尿微量白蛋白單克隆抗體的制備用人血清白蛋白(美國(guó)Sigma產(chǎn)品)免疫小鼠。選取效價(jià)達(dá)到要求的小鼠脾細(xì)胞與小鼠 骨髓瘤細(xì)胞雜交融合，制備雜交瘤細(xì)胞。挑選陽(yáng)性高的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行多次亞克隆，直到篩 選出能穩(wěn)定分泌MAU單克隆抗體的細(xì)胞株。采用接種雜交瘤細(xì)胞至小鼠腹腔的方法誘生腹水，提取腹水并將其純化得到單克隆抗體 1、 2，證明針對(duì)抗原上不同的抗原決定簇。實(shí)施例二膠體硒的制備在反應(yīng)器中加入10%殼聚糖，2min后依次加入抗壞血酸、亞硒酸、抗壞血酸，從反應(yīng)開(kāi) 始第四分鐘起間隔滴加亞硒酸、抗壞血酸，然后進(jìn)行光譜掃描，以500 600nm間出現(xiàn)最大吸 收峰為宜，收集產(chǎn)物備用。實(shí)施例三半定量檢測(cè)MAU膠體金試紙的制備及裝配1.樣液吸收部分處理將濾紙或玻璃纖維紙浸入O. 1 mo1/1 pH7. 4的PBS中2min，取出，8(TC烘干或其它方式干燥，即成樣液吸收部分。2.膠體硒標(biāo)記部分的制備和處理將膠體硒與MAU單克隆抗體1按一定比例混勻，使其形成MAU單克隆抗體1擔(dān)禾邐曇俏鎩 2. 1待標(biāo)記MAU單克隆抗體1的預(yù)處理將MAU單克隆抗體l預(yù)先在O. 005mol/lNaCl ， pH7. 0溶液中4。C透析過(guò)夜，除去多余的電 解質(zhì)，然后6500 13000r/min 4"C離心60min，去除沉淀，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至lmg/ml即可用 于標(biāo)記。優(yōu)化膠體硒標(biāo)記MAU單克隆抗體1的實(shí)驗(yàn)條件調(diào)整pH值用O. lmolK2C03將MAU單克隆抗體l溶液調(diào)至5. 0;通過(guò)光電比色法確定MAU單 克隆抗體l的最適用量比制備一系列不同濃度的等體積單抗溶液(lml)，分別加入5ml膠 體硒中，迅速混勻，然后，各加入lml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測(cè)各管。根據(jù)膠體 金顆粒的大小，OD在520 580nm之間測(cè)定，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)用量為橫坐標(biāo)作一曲線(xiàn) ，取曲線(xiàn)最先與橫軸相接近的那一點(diǎn)處的蛋白質(zhì)用量為最適穩(wěn)定量。2. 2抗體硒探針的制備當(dāng)單抗的最適穩(wěn)定量及標(biāo)記的最佳pH值被確定以后便可進(jìn)行標(biāo)記。具體步驟如下 根據(jù)用以標(biāo)記的膠體硒的總量計(jì)算出所需要的待標(biāo)記單抗的總量；在電磁攪拌下，將單 抗溶液加入膠體硒溶液中，lmg的蛋白質(zhì)大約5min加完；在磁性攪拌下加入5%的牛血清白蛋 白(BSA)使其終濃度為1%;繼續(xù)攪拌10min。制成的溶液即為膠體硒標(biāo)記的MAU單克隆抗體 l溶液，測(cè)量體積備用。2. 3抗體硒探針的純化將膠體硒標(biāo)記MAU單克隆抗體1溶液用放入蔗糖或硅膠中，濃縮到原體積的1/10，再以 1500r/min離心20 min吸出上清加至丙烯葡聚糖S-400層析拄純化；用O. 02 mol/1 pH8. 2TBS 洗脫，收集顏色峰值時(shí)的液體，4"C保存?zhèn)溆谩?. 4膠體硒標(biāo)記MAU單克隆抗體1部分處理將純化好的膠體硒標(biāo)記MAU單克隆抗體1溶液倒入一槽中，將玻璃纖維紙浸入lmin，取出 ，室溫干燥或真空冷凍干燥，即為膠體硒標(biāo)記部分。3. 檢測(cè)反應(yīng)部分處理用O. 8。/。的戊二醛溶液浸泡硝酸纖維膜30min，取出，37'C烘干，其上用噴涂機(jī)噴涂包被 2條單克隆抗體2作為檢測(cè)帶T1和T2， Tl為精確定量的單克隆抗體2，質(zhì)控帶包被抗鼠IgG，即 為檢測(cè)反應(yīng)部分。4. 吸水部分處理
將濾紙室溫干燥后，即為吸水部分。
5. 半定量檢測(cè)MAU膠體硒試紙的裝配
在塑料底板上依次粘貼樣液吸收部分、膠體硒標(biāo)記部分、檢測(cè)反應(yīng)部分和吸水部分，即 為半定量檢測(cè)MAU膠體硒試紙。
實(shí)施例四膠體硒試紙條的使用細(xì)則 采樣收集晨尿即可。
檢測(cè)將試紙帶有箭頭標(biāo)志的一端浸入裝有尿液的容器中，液面不要超過(guò)MAX線(xiàn)標(biāo)貼， 約有5秒鐘后取出平放，5 10分鐘后肉眼觀察結(jié)果。
觀察如果檢測(cè)帶T1顯色，T2不顯色，質(zhì)控帶顯色則證明樣品中的白蛋白沒(méi)有超過(guò)了限 定值，為陰性。如果檢測(cè)帶T1顯色，T2顯色，質(zhì)控帶顯色則證明樣品中的白蛋白超過(guò)了限定 值，為陽(yáng)性。如果檢測(cè)帶l、 2和質(zhì)控帶均不顯色，則證明試紙條實(shí)效。
權(quán)利要求
權(quán)利要求1一種半定量檢測(cè)尿微量白蛋白膠體硒試紙，它包括塑料底板、樣液吸收部分、膠體硒標(biāo)記部分、檢測(cè)反應(yīng)部分及吸水部分。其特征在于，所述膠體硒標(biāo)記部分由玻璃纖維膜或醋酸纖維膜或尼龍膜構(gòu)成，膜上包被膠體硒標(biāo)記的MAU單克隆抗體1，檢測(cè)反應(yīng)部分由硝酸纖維膜構(gòu)成，具有兩條檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，檢測(cè)帶T1結(jié)合有精確定量的MAU單克隆抗體2，檢測(cè)帶T2結(jié)合有一定濃度的單克隆抗體2，質(zhì)控帶包被抗鼠IgG。
2 根據(jù)權(quán)利l所述的一種半定量檢測(cè)尿微量白蛋白膠體硒試紙，其特 征在于所述的檢測(cè)反應(yīng)部分由硝酸纖維膜構(gòu)成，檢測(cè)帶T1上結(jié)合的單克隆抗體是經(jīng)過(guò)精確 定量的MAU單克隆抗體2，檢測(cè)帶T2結(jié)合有一定濃度的MAU單克隆抗體2。
3 根據(jù)權(quán)利l所述的一種半定量檢測(cè)尿微量白蛋白膠體硒試紙，其特 征在于所述的膠體硒標(biāo)記部分是膠體硒標(biāo)記的MAU單克隆抗體1 。
4 根據(jù)權(quán)利l所述的一種半定量檢測(cè)尿微量白蛋白膠體硒試紙，其特 征在于所述的當(dāng)被檢測(cè)尿液中白蛋白含量低于正常量時(shí)，白蛋白與膠體硒標(biāo)記的單抗l結(jié) 合，即白蛋白+硒標(biāo)單抗l復(fù)合物將隨同尿液在膜上運(yùn)行至檢測(cè)帶Tl，與其上精確定量的正常 量的MAU單克隆抗體2發(fā)生結(jié)合，檢測(cè)帶T1顯色，T2不顯色，硒標(biāo)單抗l繼續(xù)隨同尿液在膜上 運(yùn)行至質(zhì)控帶，質(zhì)控帶顯色，此為陰性結(jié)果。當(dāng)尿液中白蛋白含量高于正常量時(shí)，白蛋白與 膠體硒標(biāo)記的單抗l結(jié)合，即白蛋白+硒標(biāo)單抗l復(fù)合物將隨同尿液在膜上運(yùn)行至檢測(cè)帶l，與 其上精確定量的正常量的MAU單克隆抗體2發(fā)生結(jié)合，檢測(cè)帶T1顯色，多余的白蛋白+硒標(biāo)單 抗1復(fù)合物會(huì)與檢測(cè)帶T2上的MAU單克隆抗體2發(fā)生結(jié)合，檢測(cè)帶T2顯色，硒標(biāo)單抗l繼續(xù)隨同 尿液在膜上運(yùn)行至質(zhì)控帶，質(zhì)控帶顯色，此為陽(yáng)性結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明為一種半定量檢測(cè)尿微量白蛋白膠體硒試紙。該試紙可應(yīng)用于糖尿病腎病、高血壓腎病、妊娠子癇前期及各種毒性物質(zhì)所致的腎損傷的早期診斷等領(lǐng)域。本試紙的塑料底板上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體硒標(biāo)記部分、檢測(cè)反應(yīng)部分及吸水部分。其中，膠體硒標(biāo)記部分為玻璃纖維膜或醋酸纖維膜或尼龍膜包被的膠體硒標(biāo)記的單克隆抗體1；檢測(cè)反應(yīng)部分為硝酸纖維素膜，其上設(shè)置兩條檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，T1為精確定量的單克隆抗體2，T2為一定濃度的單克隆抗體2；質(zhì)控帶包被抗鼠IgG。本發(fā)明提供了一種方便、直觀、快速地對(duì)尿樣品中微量白蛋白進(jìn)行半定量的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)G01N33/558GK101504417SQ20081030508
公開(kāi)日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2008年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月22日
發(fā)明者艷 張, 徐志良, 李紅玉 申請(qǐng)人:李紅玉;蘭州大學(xué)