本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種新鮮煙葉切片及其制作方法與應(yīng)用，尤其涉及一種使煙葉內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整呈現(xiàn)的切片方法。

背景技術(shù)：

煙葉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察需要切片技術(shù)的協(xié)助，中國專利(公開號：CN104849110A)，一種植物組織的石蠟切片方法，是通過固定液固定、染色等制成的，這導(dǎo)致了葉片生理結(jié)構(gòu)的變化，使切出來的材料失真，影響煙葉內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察。中國專利(公開號：CN103499477A)鮮葉切片及其制備方法和用途公開了一種新鮮葉片的切片方法，雖然操作簡單、成本低廉，但由于人工徒手切片，不能保證每次切取的厚度一致，成功率較低。

因此，針對上述能否真實展現(xiàn)葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定連續(xù)切出目標(biāo)樣品等問題，改進(jìn)新鮮葉片的切片方法顯得尤為重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種新鮮煙葉切片的制作方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述方法獲得的新鮮煙葉切片。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種新鮮煙葉切片的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種新鮮煙葉切片的制作方法，包括以下制作步驟：

(1)新鮮煙葉采集；

(2)根據(jù)采集的煙草葉片選取有代表性的目標(biāo)葉塊1.2～2mm×3.5～5mm，用刀片切下；

(3)把目標(biāo)葉塊放入加熱后的瓊脂液進(jìn)行包埋，然后冷卻凝固；

(4)將凝固后含有目標(biāo)葉塊的瓊脂塊進(jìn)行修飾，然后上臺使用切片機(jī)進(jìn)行切片；

(5)把切取的樣品放在載玻片上蓋上蓋玻片制片。

為了更好的實現(xiàn)本發(fā)明，還包括如下步驟：

(6)進(jìn)行顯微觀察煙草葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)；

(7)用image軟件連接顯微鏡進(jìn)行拍照。

所述的瓊脂液是把瓊脂粉加入水中進(jìn)行微波加熱2～4min，瓊脂液的濃度為3％～5％，瓊脂粉購于健陽生物科技有限公司，凝膠強(qiáng)度大于1300g/cm²。

所述的冷卻凝固是把包埋后的含有目標(biāo)葉塊的瓊脂進(jìn)行低溫冷藏，冷藏時間為0.5～2h。

所述的修飾是把瓊脂塊切成1～2cm³，其中，目標(biāo)葉塊長的葉邊垂直于水平面。

所述的切片機(jī)是DOSAKA EM CO.,LTD.公司生產(chǎn)的ZERO1型號切片機(jī)；切片機(jī)刀片購于吉列公司。

所述的切片是把修飾后的瓊脂塊固定在切片臺上，短的葉邊平行于刀片放置進(jìn)行葉片橫切，根據(jù)不同的葉片硬度和葉齡調(diào)整切取的厚度，優(yōu)選厚度40～80μm，將切下的薄片用濕潤的毛筆轉(zhuǎn)移至盛有蒸餾水的燒杯中。

所述的制片先把鮮樣薄片邊緣的瓊脂用牙簽剔除，再把鮮樣薄片用牙簽挑至滴有水的載玻片上，最后蓋上蓋玻片。

所述的顯微觀察使用的是OLYMPUS公司生產(chǎn)的BX43型號顯微鏡。

根據(jù)所拍照片中葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化、顏色以及測定出葉片的厚度，可以判斷煙草需肥情況和采收時機(jī)。

一種新鮮煙葉切片，通過上述制作方法獲得。

所述的新鮮煙葉切片在田間中的應(yīng)用。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

采用本發(fā)明的方法切取的每個樣品厚度均一，且厚度大小可隨意調(diào)控，由于顯微觀測需要切片機(jī)切取厚度優(yōu)選控制在40～80μm。本發(fā)明在不采用固定液固定、染色、不破壞葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)及生理變化的情況下，完整并真實的呈現(xiàn)葉片的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并且耗時較少，操作簡單，使用試劑較少。

附圖說明

圖1是實施例1中煙草葉片鮮樣切片。

圖2是實施例2中煙草葉片鮮樣切片。

圖3是實施例3中煙草葉片鮮樣切片。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

新鮮煙草葉片的切片制作步驟如下：

(1)新鮮煙葉采集，葉片樣品采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)網(wǎng)室盆栽煙草，在煙苗移栽后45天選取中部煙葉；

(2)把采集的中部煙草葉片帶回實驗室，選取第6～7葉脈之間的目標(biāo)葉塊用刀片切下，目標(biāo)葉塊的大小約為2mm×5mm；

(3)配制3％的瓊脂液進(jìn)行微波加熱，微波加熱3min，待稍微冷卻后把目標(biāo)葉塊放入瓊脂液中進(jìn)行包埋，然后放入冰箱保鮮層進(jìn)行冷卻凝固；

(4)冷卻1h后取出瓊脂塊，用刀片對其進(jìn)行修飾，修飾成體積約為1cm×1cm×2cm(長×寬×高)的瓊脂小塊，目標(biāo)葉塊在其中間，然后上臺使用切片機(jī)進(jìn)行切片；

(5)把切取的樣品放在載玻片上蓋上蓋玻片制片；

(6)進(jìn)行顯微觀察煙草葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

(7)用image軟件連接顯微鏡進(jìn)行拍照，如圖1。

從圖1可知，煙草葉片的上表皮、下表皮清晰可見，柵欄組織排列緊密且規(guī)則、顏色濃綠均一，柵欄組織和海綿組織比例適中。

實施例2

新鮮煙草葉片的切片制作步驟如下：

(1)新鮮煙葉采集，葉片樣品采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)網(wǎng)室盆栽煙草，在煙苗移栽后45天選取中部煙葉；

(2)把采集的中部煙草葉片帶回實驗室，選取第6～7葉脈之間的目標(biāo)葉塊用刀片切下，目標(biāo)葉塊的大小約為1.2mm×4mm；

(3)配制4％的瓊脂液進(jìn)行微波加熱，微波加熱4min，待稍微冷卻后把目標(biāo)葉塊放入瓊脂液中進(jìn)行包埋，然后放入冰箱保鮮層進(jìn)行冷卻凝固；

(4)冷卻0.5h后取出瓊脂塊，用刀片對其進(jìn)行修飾，修飾成體積約為1cm×1cm×1cm(長×寬×高)的瓊脂小塊，目標(biāo)葉塊在其中間，然后上臺使用切片機(jī)進(jìn)行切片；

(5)把切取的樣品放在載玻片上蓋上蓋玻片制片；

(6)進(jìn)行顯微觀察煙草葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

(7)用image軟件連接顯微鏡進(jìn)行拍照，如圖2。

從圖2可知，不僅能清晰的看到煙草葉片的上表皮和下表皮，還可清楚的展現(xiàn)葉脈和氣孔，柵欄組織排列緊密且較長，海綿組織中還含有大量的葉綠體。

實施例3

新鮮煙草葉片的切片制作步驟如下：

(1)新鮮煙葉采集，葉片樣品采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)網(wǎng)室盆栽煙草，在煙苗移栽后45天選取中部煙葉；

(2)把采集的中部煙草葉片帶回實驗室，選取第6～7葉脈之間的目標(biāo)葉塊用刀片切下，目標(biāo)葉塊的大小約為1.6mm×3.5mm；

(3)配制5％的瓊脂液進(jìn)行微波加熱，微波加熱2min，待稍微冷卻后把目標(biāo)葉塊放入瓊脂液中進(jìn)行包埋，然后放入冰箱保鮮層進(jìn)行冷卻凝固；

(4)冷卻2h后取出瓊脂塊，用刀片對其進(jìn)行修飾，修飾成體積約為1cm×1cm×1.5cm(長×寬×高)的瓊脂小塊，目標(biāo)葉塊在其中間，然后上臺使用切片機(jī)進(jìn)行切片；

(5)把切取的樣品放在載玻片上蓋上蓋玻片制片；

(6)進(jìn)行顯微觀察煙草葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

(7)用image軟件連接顯微鏡進(jìn)行拍照，如圖3。

從圖3可知，煙草葉片的柵欄組織排列略微疏松，且顏色有點發(fā)黃，在葉片中所占的比例不大。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。