本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種基于蛋白分析的藥物篩選方法，還涉及該方法使不同患者的不同疾病特點與不同藥物建立一一對應(yīng)關(guān)系，使新個體化藥物的開發(fā)、使用有據(jù)可依，推動精準(zhǔn)醫(yī)療。

背景技術(shù)：

精準(zhǔn)醫(yī)療的基礎(chǔ)是個體化病因分析：精準(zhǔn)醫(yī)療是將患者的各種個體化致病因素(遺傳與環(huán)境)進行精確的測量和解讀，在分子水平體現(xiàn)出來，繼而制定以個體化的分子致病因素為靶向的、有針對性的個體化治療。

個體化分子致病因素的最佳分析手段是蛋白質(zhì)分析:精準(zhǔn)醫(yī)療的精髓是極盡可能地全面搜集和分析患者的個體化分子致病因素，籍以極盡可能地制定符合其個體分子特征的治療方案，因此，治療方案的精準(zhǔn)程度與個體化分子病因信息的詳實程度成正比。然而，當(dāng)前個體化分子致病因素的收集僅僅依靠基因測序技術(shù)，這只限于對患者“遺傳性”分子致病因素的分析，完全忽略了更為重要的“環(huán)境”分子致病因素。以基因測序為主體的精準(zhǔn)醫(yī)療僅僅是片面的、遺傳角度上的精準(zhǔn)，這不但有悖于精準(zhǔn)醫(yī)療初衷、誤導(dǎo)其走向，更導(dǎo)致精準(zhǔn)醫(yī)療賴以生存的大數(shù)據(jù)庫存有嚴(yán)重遺漏，將使精準(zhǔn)醫(yī)療嘗試全面崩潰。申請人認(rèn)為：根據(jù)生物學(xué)中心法則，遺傳性基因的致病性變異最終將會以蛋白質(zhì)變異的形式表現(xiàn)出來，同時，環(huán)境致病因素同樣會體現(xiàn)在獨立于基因之外的蛋白質(zhì)改變，因而全面、準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)分析才是個體化致病病因分析的最佳技術(shù)手段。

液相色譜儀與質(zhì)譜儀聯(lián)用(LC/MS/MS)是全面、準(zhǔn)確分析蛋白質(zhì)的最佳技術(shù)：LC/MS/MS技術(shù)發(fā)展迅速，是當(dāng)今世界上最為先進、全面、準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)定性、定量分析方法，是在蛋白質(zhì)水平的“基因測序”技術(shù)。自2014年，所有人類基因所編碼的蛋白質(zhì)均可以由LC/MS/MS檢測出，并包含檢測諸如蛋白含量、修飾變化等多種基因測序所無法反應(yīng)的、卻對生物功能起決定作用的分子信息。同時，與傳統(tǒng)以抗體為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)分析技術(shù)相比，LC/MS/MS又具有客觀、直接、全面、高效等優(yōu)勢。因而，LC/MS/MS在精準(zhǔn)醫(yī)療所需的全面、準(zhǔn)確分析患者分子致病因素的工作中，是目前唯一的、無可替代的技術(shù)方法。

精準(zhǔn)醫(yī)療之所以“精準(zhǔn)”是在于其治療方案迎合患者的個體化病因，即“對癥下藥”：而當(dāng)前基于基因測序的精準(zhǔn)醫(yī)療嘗試，由于(如前述)基因測序?qū)χ虏∫蛩胤治龅钠嫘?，僅是片面的“對因下藥”，這將嚴(yán)重影響對個體化藥物的篩選、阻礙新個體化藥物的開發(fā)。申請人認(rèn)為：基于蛋白質(zhì)的患者個體化病因千變?nèi)f化，精準(zhǔn)醫(yī)療的治療方案也必將千變?nèi)f化，精準(zhǔn)醫(yī)療方案將是多種現(xiàn)有藥物的有機組合，或者是新開發(fā)的、針對各種個體化分子致病因素的藥物的多元化配伍。

基于以上背景和精準(zhǔn)醫(yī)療的需求，申請人提出一種基于蛋白質(zhì)分析的、旨在推進精準(zhǔn)醫(yī)療實踐的、新個體化藥物的篩選方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的在于提供服務(wù)于精準(zhǔn)醫(yī)療的、新個體化藥物的篩選方法，用以克服傳統(tǒng)個體化藥物篩選中片面性。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供的一種個體化藥物的篩選方法，包括以下步驟：

(1)疾病相關(guān)致病蛋白分子數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建：利用LC/MS/MS分別檢測某種患病人群的病理組織樣本和無患病人群的相應(yīng)組織樣品，對比分析患病人群和無患病人群的蛋白分子，找出患病人群和無患病人群不同的蛋白分子作為該疾病的分子致病因素，建立該疾病相關(guān)致病蛋白分子數(shù)據(jù)庫；

(2)患者個體化臨床病程征-蛋白致病因素響應(yīng)特征相關(guān)性數(shù)據(jù)庫的建立：在患病人群內(nèi)分析蛋白分子致病因素特征個體間差異，對患病人群細(xì)分，建立疾病細(xì)分患者個體化臨床病程征-蛋白致病因素響應(yīng)特征相關(guān)性數(shù)據(jù)庫；

(3)疾病模型中目標(biāo)藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫的建立：從個體化藥物篩選角度，通過對被篩選藥物在藥理試驗?zāi)Ｐ椭械牡鞍譒C/MS/MS分析，，確定待篩選藥物對該疾病致病蛋白的影響，建立疾病模型中待篩選藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫，并得到藥物篩選結(jié)果。

優(yōu)選地，所述個體化藥物的篩選方法，包括以下步驟:

(1)疾病相關(guān)致病蛋白分子數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建：

(1.1)分別將患病人群的病理組織樣本與無患病人群的相應(yīng)組織樣本進行LC/MS/MS質(zhì)譜檢測分析；

(1.2)比較患病人群和無患病人群樣本的蛋白分布、含量、蛋白修飾或其他蛋白特征的差別，發(fā)現(xiàn)與該疾病相關(guān)的蛋白異常情況作為蛋白分子致病因素；

(1.3)構(gòu)建該疾病相關(guān)致病蛋白分子數(shù)據(jù)庫；

(2)患者個體化臨床病程征-蛋白致病因素響應(yīng)特征相關(guān)性數(shù)據(jù)庫的建立：

(2.1)在患病人群內(nèi)，詳盡記錄患者各種臨床病程特點(包括但不限于病理等)；

(2.2)將記錄的臨床病程特點分別對比當(dāng)前傳統(tǒng)檢測手段對病情的描述，利用前傳統(tǒng)檢測手段對病情的描述和相應(yīng)疾病蛋白致病分子雙重指標(biāo)對該疾病患者人群進行亞群分類；

(2.3)構(gòu)建患者個體化臨床病程征-蛋白致病因素響應(yīng)特征相關(guān)性數(shù)據(jù)庫；

(3)疾病模型中對照藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建：

(3.1)建立該疾病的藥理試驗?zāi)Ｐ停?/p>

(3.2)建立空白對照組、對照藥物組和待篩選藥物組，對藥理試驗?zāi)Ｐ头謩e不給藥、給予對照藥物和給予待篩選藥物；

(3.3)分別將空白對照組、對照藥物組和待篩選藥物組的病理樣本進行LC/MS/MS質(zhì)譜分析；

(3.4)比較空白對照組、對照藥物組和待篩選藥物組的病理樣本的蛋白分布、含量、蛋白修飾或其他蛋白特征的差別，確定待篩選藥物對該疾病致病蛋白的影響；

(3.5)建立疾病模型中對照藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫、待篩選藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫，得到篩選藥物結(jié)果。

步驟(1)中，所述病理組織樣本包括手術(shù)中切除病理組織、活檢病理組織、血樣、尿樣、腦脊液或其他體液樣本。

步驟(2)中，所述蛋白分子致病因素特征個體間差異包括蛋白分子含量、蛋白分子分布、蛋白修飾或其他蛋白特征改變。

步驟(3)中，所述藥理實驗?zāi)Ｐ蜑閯游锬Ｐ汀⒓?xì)胞模型或組織模型。

本發(fā)明還提供了一種個體化藥物的篩選及驗證方法，包括以下步驟：

(1)疾病相關(guān)致病蛋白分子數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建：

(1.1)分別將患病人群的病理組織樣本與無患病人群的相應(yīng)組織樣本進行LC/MS/MS質(zhì)譜檢測分析；

(1.2)比較患病人群和無患病人群樣本的蛋白分布、含量、蛋白修飾或其他蛋白特征的差別，發(fā)現(xiàn)與該疾病相關(guān)的蛋白異常情況作為蛋白分子致病因素；

(1.3)構(gòu)建該疾病相關(guān)致病蛋白分子數(shù)據(jù)庫；

(2)患者個體化臨床病程征-蛋白致病因素響應(yīng)特征相關(guān)性數(shù)據(jù)庫的建立：

(2.1)在患病人群內(nèi)，詳盡記錄患者各種臨床病程特點(包括但不限于病理等)；

(2.2)將記錄的臨床病程特點分別對比當(dāng)前傳統(tǒng)檢測手段對病情的描述，利用前傳統(tǒng)檢測手段對病情的描述和相應(yīng)疾病蛋白致病分子雙重指標(biāo)對該疾病患者人群進行亞群分類；

(2.3)構(gòu)建患者個體化臨床病程征-蛋白致病因素響應(yīng)特征相關(guān)性數(shù)據(jù)庫；

(3)疾病模型中對照藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建：

(3.1)建立該疾病的藥理試驗?zāi)Ｐ停?/p>

(3.2)建立空白對照組、對照藥物組和待篩選藥物組，對藥理試驗?zāi)Ｐ头謩e不給藥、給予對照藥物和給予待篩選藥物；

(3.3)分別將空白對照組、對照藥物組和待篩選藥物組的病理樣本進行LC/MS/MS質(zhì)譜分析；

(3.4)比較空白對照組、對照藥物組和待篩選藥物組的病理樣本的蛋白分布、含量、蛋白修飾或其他蛋白特征的差別，確定待篩選藥物對該疾病致病蛋白的影響；

(3.5)建立疾病模型中對照藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫、待篩選藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫，得到篩選藥物結(jié)果；

(4)疾病患者亞群與被篩選藥物對該亞群患者疾病療效的相關(guān)性數(shù)據(jù)庫：

(4.1)對該疾病新發(fā)病例的病理樣本進行蛋白LC/MS/MS分析，找到該疾病相關(guān)致病蛋白分子數(shù)據(jù)庫中該疾病蛋白致病分子的特征，并將該患者依據(jù)患者個體化臨床病程征-蛋白致病因素響應(yīng)特征相關(guān)性數(shù)據(jù)庫對患者進行亞群歸類；

(4.2)依據(jù)步驟(4.1)中檢測的該患者的疾病蛋白致病分子的特征及藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫，對該病理樣本進行離體培養(yǎng)，并給予對照藥物或篩選出的藥物對離體培養(yǎng)樣本；

(4.3)對離體培養(yǎng)后的樣本做LC/MS/MS分析，觀察致病蛋白分子改變，同時以當(dāng)前傳統(tǒng)檢測手段對治療后樣本進行評價。

本發(fā)明還提供了上述方法在藥物篩選中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述方法在對已知或待驗證的抗癌藥進行其蛋白水平的藥效檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述方法在精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用。

有益效果：本發(fā)明提供的個體化藥物篩選方法是一種全新的、應(yīng)用于個體化精準(zhǔn)醫(yī)療的藥物篩選方法，屬于開拓性的發(fā)明，其使用能夠更準(zhǔn)確、全面地將遺傳、環(huán)境致病因素及患者病程特點綜合體現(xiàn)于蛋白質(zhì)分子的檢測分析結(jié)果，并根據(jù)目標(biāo)藥物對這些蛋白致病分子的糾正，篩選適用于不同患者病程特征的、更為客觀而精準(zhǔn)的、個體化的治療藥物。

本發(fā)明方法是一種以蛋白質(zhì)為核心、強調(diào)蛋白質(zhì)是遺傳與環(huán)境致病因素在患者上的綜合體現(xiàn)、以LC/MS/MS質(zhì)譜技術(shù)為蛋白質(zhì)檢測手段、以藥物對蛋白質(zhì)的影響為標(biāo)準(zhǔn)的新型藥物篩選方法。

本發(fā)明方法應(yīng)用廣泛，具有很強的實用性，可在為多種疾病的個體化用藥進行不同的藥物篩選，具有很高的商業(yè)前景和實踐意義，例如可在精準(zhǔn)醫(yī)療中：對已知或待驗證的抗癌藥進行其蛋白水平的藥效檢測，同時對個體癌癥患者腫瘤樣本進行蛋白質(zhì)分析，找出腫瘤相關(guān)蛋白與抗腫瘤藥在該類型腫瘤中的一一對應(yīng)關(guān)系，繼而為實施腫瘤治療制定精準(zhǔn)治療方案。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有以下突出的優(yōu)勢：

(1)本發(fā)明為開拓性發(fā)明：首次提出致病蛋白分子能夠反映精準(zhǔn)醫(yī)療中“精準(zhǔn)”所需的遺傳與環(huán)境致病因素，并為之設(shè)立了“精準(zhǔn)”藥物篩選的方法，目前屬于一個嶄新的研究進展；

(2)全面、客觀、準(zhǔn)確：由于利用了蛋白質(zhì)LC/MS/MS分析技術(shù)，本發(fā)明對疾病與藥物的特征分析更為全面而準(zhǔn)確，同樣提高了藥物篩選的客觀性與個體化用藥的準(zhǔn)確性；

(3)經(jīng)濟：目前耗資巨大的精準(zhǔn)醫(yī)療僅僅考慮了遺傳性(基因)因素，這不但有悖于精準(zhǔn)醫(yī)療初衷、誤導(dǎo)其走向，更導(dǎo)致精準(zhǔn)醫(yī)療賴以生存的大數(shù)據(jù)庫存有嚴(yán)重遺漏，將使精準(zhǔn)醫(yī)療嘗試全面崩潰，最終會推到重來。本發(fā)明首先倡導(dǎo)遺傳、環(huán)境因素綜合分析，加之對于相應(yīng)大數(shù)據(jù)庫的合理設(shè)計，無疑使精準(zhǔn)醫(yī)療的診治工作得到更有效的開展，因而具有極高的經(jīng)濟價值。同時，通過對患者的精準(zhǔn)劃分并為劃分后的患者匹配精準(zhǔn)藥物，使現(xiàn)有藥物的使用范圍極具擴大，可以提高新藥開發(fā)的成功率，減少醫(yī)療資源的浪費。

(4)應(yīng)用范圍廣：本發(fā)明提出的個體化藥物篩選方法，適用于包括各類實體腫瘤在內(nèi)的、各種能夠獲得病理組織從而可以進行LC/MS/MS分析的臨床疾病，適用范圍廣，并符合全球精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展方向，因而具有廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為創(chuàng)建“乳腺癌的相關(guān)蛋白分子致病因素”數(shù)據(jù)庫的示意圖。

圖2為創(chuàng)建“乳腺細(xì)分患者個體化臨床病程特征-蛋白致病因素響應(yīng)特征相關(guān)性”數(shù)據(jù)庫的示意圖。

圖3為創(chuàng)建“乳腺癌模型中目標(biāo)藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性”數(shù)據(jù)庫的示意圖。

圖4為創(chuàng)建“乳腺癌亞群患者-個體化藥物療效相關(guān)性”數(shù)據(jù)庫的示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做出進一步說明。

個體化藥物的篩選和驗證方法，包括以下步驟：

(1)疾病相關(guān)致病蛋白分子數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建：利用LC/MS/MS分別檢測某種患病人群的病理組織樣本和無患病人群的相應(yīng)組織樣品，對比分析患病人群和無患病人群的蛋白分子，找出患病人群和無患病人群不同的蛋白分子作為該疾病的分子致病因素，建立該疾病相關(guān)致病蛋白分子數(shù)據(jù)庫；

(2)患者個體化臨床病程征-蛋白致病因素響應(yīng)特征相關(guān)性數(shù)據(jù)庫的建立：在患病人群內(nèi)分析蛋白分子致病因素特征個體間差異，對患病人群細(xì)分，建立疾病細(xì)分患者個體化臨床病程征-蛋白致病因素響應(yīng)特征相關(guān)性數(shù)據(jù)庫；具體而言，從患者個體間差異的角度，通過對某疾病患者群內(nèi)個體患者的臨床病程特點的記錄及其與步驟(1)中數(shù)據(jù)庫所示的疾病相關(guān)蛋白分子致病因素的相關(guān)性分析，在患者群內(nèi)根據(jù)臨床病程特點總結(jié)具有該特點的患者的蛋白分子致病因素特征(含量、分布、蛋白修飾或其他蛋白特征改變等)，籍此將患者群進一步細(xì)分，創(chuàng)建患者個體化臨床病程征-蛋白致病因素響應(yīng)特征相關(guān)性數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫；

(3)疾病模型中目標(biāo)藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫的建立：從個體化藥物篩選角度，通過對被篩選藥物在藥理試驗?zāi)Ｐ椭械牡鞍譒C/MS/MS分析，，確定待篩選藥物對該疾病致病蛋白的影響，建立疾病模型中待篩選藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫，并得到藥物篩選結(jié)果；

(4)對篩選結(jié)果驗證：某疾病新發(fā)病例患者就診后，在將對其病理樣本進行蛋白LC/MS/MS分析、找到步驟(1)數(shù)據(jù)庫中該疾病蛋白致病分子的特征、并將該患者依據(jù)步驟(2)數(shù)據(jù)庫進行細(xì)分歸類的同時，對該患者的病理樣本進行離體培養(yǎng)，建立該患者的個體化疾病模型。再根據(jù)步驟(3)中數(shù)據(jù)庫信息找到糾正該患者蛋白致病分子的藥物(或藥物組合)，并治療該患者的離體培養(yǎng)疾病模型，觀察記錄藥物療效。最后，將步驟(2)數(shù)據(jù)庫的患者歸類信息與藥物療效進行相關(guān)分析，構(gòu)建“疾病亞群患者-個體化藥物療效相關(guān)性”數(shù)據(jù)庫。檢查、治療結(jié)果將繼續(xù)添加、完善上述數(shù)據(jù)庫。

具體地，個體化藥物的篩選及驗證方法，包括以下步驟：

(1)疾病相關(guān)致病蛋白分子數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建：

(1.1)分別將患病人群的病理組織樣本與無患病人群的相應(yīng)組織樣本進行LC/MS/MS質(zhì)譜檢測分析；

(1.2)比較患病人群和無患病人群樣本的蛋白分布、含量、蛋白修飾或其他蛋白特征的差別，發(fā)現(xiàn)與該疾病相關(guān)的蛋白異常情況作為蛋白分子致病因素；

(1.3)構(gòu)建該疾病相關(guān)致病蛋白分子數(shù)據(jù)庫；

(2)患者個體化臨床病程征-蛋白致病因素響應(yīng)特征相關(guān)性數(shù)據(jù)庫的建立：

(2.1)在患病人群內(nèi)，詳盡記錄患者各種臨床病程特點(包括但不限于病理、等)；

(2.2)將記錄的臨床病程特點分別對比當(dāng)前傳統(tǒng)檢測手段對病情的描述，利用前傳統(tǒng)檢測手段對病情的描述和相應(yīng)疾病蛋白致病分子雙重指標(biāo)對該疾病患者人群進行亞群分類；

(2.3)構(gòu)建患者個體化臨床病程征-蛋白致病因素響應(yīng)特征相關(guān)性數(shù)據(jù)庫；

(3)疾病模型中對照藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建：

(3.1)建立該疾病的藥理試驗?zāi)Ｐ停?/p>

(3.2)建立空白對照組、對照藥物組和待篩選藥物組，對藥理試驗?zāi)Ｐ头謩e不給藥、給予對照藥物和給予待篩選藥物；

(3.3)分別將空白對照組、對照藥物組和待篩選藥物組的病理樣本進行LC/MS/MS質(zhì)譜分析；

(3.4)比較空白對照組、對照藥物組和待篩選藥物組的病理樣本的蛋白分布、含量、蛋白修飾或其他蛋白特征的差別，確定待篩選藥物對該疾病致病蛋白的影響；

(3.5)建立疾病模型中對照藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫、待篩選藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫，得到篩選藥物結(jié)果；

(4)疾病患者亞群與被篩選藥物對該亞群患者疾病療效的相關(guān)性數(shù)據(jù)庫：

(4.1)對該疾病新發(fā)病例的病理樣本進行蛋白LC/MS/MS分析，找到該疾病相關(guān)致病蛋白分子數(shù)據(jù)庫中該疾病蛋白致病分子的特征，并將該患者依據(jù)患者個體化臨床病程征-蛋白致病因素響應(yīng)特征相關(guān)性數(shù)據(jù)庫對患者進行亞群歸類；

(4.2)依據(jù)步驟(4.1)中檢測的該患者的疾病蛋白致病分子的特征及藥物-蛋白響應(yīng)相關(guān)性數(shù)據(jù)庫，對該病理樣本進行離體培養(yǎng)，并給予對照藥物或篩選出的藥物對離體培養(yǎng)樣本；

(4.3)對離體培養(yǎng)后的樣本做LC/MS/MS分析，觀察致病蛋白分子改變，同時以當(dāng)前傳統(tǒng)檢測手段對治療后樣本進行評價；

(4.4)將步驟(4.1)的患者歸類情況及其對應(yīng)藥物治療的療效、治療前后蛋白分子的變化進行總結(jié)與數(shù)據(jù)相關(guān)性分析，構(gòu)建數(shù)據(jù)庫。

更具體地，本發(fā)明實施例利用上述方法在精準(zhǔn)醫(yī)療實踐中，篩選乳腺癌個體化藥物，如利用5例乳腺癌臨床樣本及其正常組織、2種乳腺癌細(xì)胞模型、篩選2種小分子藥物作為抗乳腺癌藥物。

1. 5例乳腺癌及其正常對照組織樣品蛋白提?。哼x取1克樣本加入1毫升8摩爾濃度尿素蛋白提取液，均漿打碎，冰上孵育30分鐘，離心，液體部分移入新試管，得到腦脊液蛋白混合物。

2.蛋白酶切、去鹽：將提取的蛋白混合物經(jīng)還原劑、堿化劑處理后，以1微克胰蛋白酶比50微克蛋白的比例混合，過夜消化；以C18反相柱去鹽純化，再經(jīng)真空抽干離心機除去有機溶劑后，用含有乙腈和三氟醋酸的溶液稀釋到最終1微克/微升濃度溶液，即為待測蛋白混合液。

3.LC/MS/MS質(zhì)譜檢測：將各待測蛋白混合液上樣于美國Waters公司的nanoACQUITY與美國Thermo公司的Q-Exactive連接成的超高壓液相色譜儀-質(zhì)譜儀系統(tǒng)(LC/MS/MS)，按照質(zhì)譜廠家提供的程序進行質(zhì)譜信號采集。

4.組間蛋白分子對比：將乳腺癌組與其對照組的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行定性、定量對比，找出并記錄與乳腺癌相關(guān)的蛋白分子(致病蛋白)，建立與乳腺癌相關(guān)的蛋白分子致病因素數(shù)據(jù)庫，如圖1所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR等蛋白在乳腺癌中升高、p53等蛋白在乳腺癌中下降。

5.收集、記錄5例乳腺癌患者的各自各種臨床病程、致病蛋白分子特點：臨床病程特點包括(但不限于)常規(guī)病理分型等，如根據(jù)病理將3例患者歸為導(dǎo)管型、2例歸為腺葉型乳腺癌；仔細(xì)對比2型間LC/MS/MS蛋白分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者的致病蛋白分子特征不同：導(dǎo)管型EGFR高、p53正常；腺葉型EGFR正常、p53低。

6.根據(jù)步驟5的結(jié)果，建立患者亞型-蛋白分子特征數(shù)據(jù)庫，如圖2所示。

7.抗乳腺癌小分子藥物篩選：從美國Sigma公司購買Marbofloxacin、Eutanol g兩種小分子藥物；從美國ATCC公司購買MDA-MB-435S、MCF7兩種乳腺癌培養(yǎng)細(xì)胞。5％二氧化碳37攝氏度下，按廠家說明書用含10％胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(美國Invitrogen公司)進行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，每種細(xì)胞培養(yǎng)3個培養(yǎng)皿：其中一皿加入10微摩爾終濃度Marbofloxacin，另一皿加入10微摩爾終濃度Eutanol g，剩余一皿不予處理(僅加入相應(yīng)濃度的溶劑作為對照)。藥物治療后24小時，如步驟1至4方法進行致病蛋白比較分析，發(fā)現(xiàn)Marbofloxacin在2種乳腺癌細(xì)胞中均可以降低EGFR、但對p53無影響；而Eutanol g相反：對EGFR無影響、但能夠提升p53蛋白水平。

8.根據(jù)步驟7的結(jié)果，建立患者亞型-蛋白特征數(shù)據(jù)庫，如圖3所示。

9.患者樣本離體組織培養(yǎng)：在進行1項所述提取樣本蛋白的同時，另外留取1克樣本用無菌剪刀將組織剪切成1毫米見方組織塊，加入2.5％胰蛋白酶，在37攝氏度消化2小時，制成單細(xì)胞懸浮液，離心去除胰蛋白酶溶液，更換為含10％胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(美國Invitrogen公司)，在5％二氧化碳的37攝氏度培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部時更換新培養(yǎng)液進行常規(guī)傳代至2個培養(yǎng)皿。

10.藥物篩選：

將步驟9所述3例導(dǎo)管型乳腺癌培養(yǎng)細(xì)胞各自的2皿細(xì)胞，如步驟7所述，其中一皿加入10微摩爾終濃度Marbofloxacin，另一皿不予處理(僅加入相應(yīng)濃度的溶劑作為對照)。藥物處理24小時后，如步驟1至4方法進行致病蛋白比較，發(fā)現(xiàn)Marbofloxacin在3例導(dǎo)管型乳腺癌培養(yǎng)細(xì)胞中可以降低EGFR、并發(fā)現(xiàn)如核分裂比例等常規(guī)腫瘤特有惡性度檢測指標(biāo)趨于好轉(zhuǎn)。

將步驟9所述2例腺葉型乳腺癌培養(yǎng)細(xì)胞各自的2皿細(xì)胞，如步驟7所述，其中一皿加入10微摩爾終濃度Eutanol g，另一皿不予處理(僅加入相應(yīng)濃度的溶劑作為對照)。藥物治療后24小時，如步驟1至4方法進行致病蛋白比較，發(fā)現(xiàn)Eutanolg在2例腺葉型乳腺癌培養(yǎng)細(xì)胞中可以提升p53蛋白水平、并發(fā)現(xiàn)如核分裂比例等常規(guī)腫瘤特有惡性度檢測指標(biāo)趨于好轉(zhuǎn)。

11.根據(jù)步驟10的結(jié)果，建立乳腺癌亞型患者-個體化藥物療效相關(guān)性數(shù)據(jù)庫，如圖4所示。至此，2種目標(biāo)個體化藥物被篩選完畢。

12.利用步驟1至11，對任意待測藥物篩選，可分別篩選得到對導(dǎo)管型乳腺癌和腺葉型乳腺癌治療好的抗腫瘤藥物。