本發(fā)明涉及生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于雙極電極陣列的可視化電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法。

背景技術(shù)：

糖尿病是一種以慢性高血糖為特征的全球性流行性疾病。2010年中國(guó)成人糖尿病患病率已達(dá)到11.6％。糖尿病會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥包括心臟病、中風(fēng)、高血壓、腎功能衰竭、失明和截肢等。

糖尿病患者的血糖水平波動(dòng)顯著，通過嚴(yán)格的個(gè)人血糖水平的監(jiān)測(cè)和控制，可以有效降低糖尿病的發(fā)病率和死亡率，因此血糖的實(shí)時(shí)監(jiān)控具有重大意義。

自1987年Medisense公司推出首款個(gè)人血糖檢測(cè)儀，到目前為止，市面上已存在超過40種不同的便攜式商業(yè)血糖儀。每天數(shù)以百萬的糖尿病患者使用血糖儀測(cè)試血糖水平，其中葡萄糖是最常見的測(cè)試分析物，葡萄糖生物傳感器約占整個(gè)生物傳感器市場(chǎng)85％，具有巨大的市場(chǎng)規(guī)模。

傳統(tǒng)的葡萄糖監(jiān)測(cè)技術(shù)主要是基于電化學(xué)葡萄糖傳感器，通過安培測(cè)量來表征葡萄糖濃度。安培法經(jīng)常受到內(nèi)源性還原物質(zhì)的干擾(比如抗壞血酸、尿酸)，電極昂貴且易在檢測(cè)過程中被基質(zhì)滅活，從而影響電流響應(yīng)的選擇性及測(cè)量的準(zhǔn)確性。

因此，發(fā)展一種選擇性好、電極結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)便、成本低廉的新型葡萄糖傳感器將具有重要的研究意義和廣闊的市場(chǎng)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種選擇性好、電極結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)便、成本低廉的葡萄糖檢測(cè)方法，本發(fā)明的方法基于雙極電極陣列-微流控芯片構(gòu)成的可視化電化學(xué)發(fā)光傳感器。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種基于雙極電極陣列的可視化電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，包括步驟：

1)制備蓋片

PDMS單體與固化劑混合而成的PDMS母液脫氣后倒在硅烷化的PDMS陽模上方平衡，然后蓋上保鮮膜，加熱固化；固化后，將PDMS從硅烷化的PDMS陽模上剝離，得含有通道凹槽的PDMS蓋片；在PDMS蓋片通道兩端各加工一個(gè)孔道，用于進(jìn)樣和放置驅(qū)動(dòng)電極；

2)制備基片

A.ITO雙極電極基片的制備

在ITO導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電表面涂5-15微米厚的正光膠膠層，將激光照排機(jī)繪制好的光刻掩膜與涂有正光膠膠層的ITO導(dǎo)電玻璃緊密貼合，然后進(jìn)行汞燈曝光，曝光后將導(dǎo)電玻璃置于0.5-1wt％的NaOH溶液中顯影至電極圖案完全顯現(xiàn)后取出導(dǎo)電玻璃，清洗，干燥；繼續(xù)將導(dǎo)電玻璃置于硝酸與鹽酸的混合水溶液中刻蝕，刻蝕完畢后，清洗，干燥，得表面刻有三根ITO雙極電極的基片；

B.制備葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖復(fù)合物

殼聚糖溶于0.5-2wt％的醋酸水溶液中，得5-15mg/mL的殼聚糖溶液，加入多壁碳納米管并均勻分散于殼聚糖溶液中得黑色懸濁液，碳納米管的加入量為1-3mg/mL；取濃度為3-8mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液與所述黑色懸濁液按照體積比1∶1-3混合，得葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料的混合液；

C.ITO雙極電極的表面修飾

用疏水膠帶在所述ITO雙極電極的陽極端上貼一個(gè)用于防止修飾材料溶液擴(kuò)散的矩形區(qū)域，移取10-30微升葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖溶液滴于矩形區(qū)域表面；將基片置于4℃冰箱內(nèi)，過夜干燥以形成葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖復(fù)合物薄膜修飾的ITO雙極電極；

3)芯片封合

用等離子清洗器清洗上述制備的基片和蓋片，將基片上三根ITO雙極電極對(duì)準(zhǔn)蓋片通道凹槽的中部，然后緊密貼合，得葡萄糖電化學(xué)發(fā)光傳感器芯片。

作為優(yōu)選方案，步驟1)中，PDMS母液中PDMS單體與固化劑的質(zhì)量比為8∶1-12∶1；PDMS母液脫氣前于4℃環(huán)境下放置5-20min；脫氣時(shí)間為20-40min。

作為優(yōu)選方案，步驟1)中，PDMS母液在硅烷化的PDMS陽模上方平衡時(shí)間為5-15min。

作為優(yōu)選方案，步驟1)中，PDMS蓋片通道兩端的孔道均為圓形孔道。

作為優(yōu)選方案，步驟2)中，在ITO導(dǎo)電玻璃表面涂正光膠之前，對(duì)ITO導(dǎo)電玻璃進(jìn)行預(yù)處理；所述預(yù)處理具體為將ITO導(dǎo)電玻璃置于0.8-1.2M NaOH的乙醇溶液中浸泡過夜，之后分別在丙酮、無水乙醇和去離子水中超聲清洗10-20min，將干凈的ITO導(dǎo)電玻璃用氮?dú)獯蹈伞?/p>

作為優(yōu)選方案，步驟2)A中，用膠頭滴管吸取正光膠后均勻滴涂在ITO導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電表面，采用甩膠機(jī)在400-600rpm轉(zhuǎn)速下勻膠，然后在2500-3500rpm轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)動(dòng)3θ-50s甩膠；之后將ITO導(dǎo)電玻璃置于105-115℃環(huán)境下烘干，然后于25-30℃的熱板上緩慢冷卻至室溫，形成厚度均勻的正光膠膠層。

作為優(yōu)選方案，步驟2)A中，汞燈曝光的時(shí)間為2-6min；將導(dǎo)電玻璃置于硝酸與鹽酸的混合水溶液中刻蝕6-15min，其中，硝酸與鹽酸的混合水溶液中，硝酸、鹽酸與水的質(zhì)量比為2-3∶4-6∶4-6。

采用所述基于雙極電極陣列的可視化電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法，在蓋片兩端的孔道上分別放置一根鉑絲，作為驅(qū)動(dòng)電極；驅(qū)動(dòng)電極通過直流穩(wěn)壓電源提供驅(qū)動(dòng)電壓；向通道凹槽內(nèi)注入含有待測(cè)葡萄糖溶液和魯米諾的緩沖溶液；雙極電極表面修飾的葡萄糖氧化酶催化溶解氧與葡萄糖反應(yīng)生成H₂O₂，并在外加電壓的驅(qū)動(dòng)下，與魯米諾發(fā)生電化學(xué)發(fā)光，產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)通過葡萄糖電化學(xué)發(fā)光傳感器芯片上方的CCD圖像傳感器捕獲；根據(jù)CCD圖像傳感器捕獲的發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度確定待測(cè)葡萄糖溶液中的葡萄糖濃度。

作為優(yōu)選方案，向通道凹槽內(nèi)注入15-30微升含有待測(cè)葡萄糖溶液和魯米諾的緩沖溶液；所述緩沖溶液為PBS緩沖溶液；含有待測(cè)葡萄糖溶液和魯米諾的緩沖溶液中PBS的濃度為0.05-0.15mol/L，pH為7.2-7.5；葡萄糖的濃度為0.01mM-1mM；魯米諾的濃度為1.2-1.4mmol/L。本發(fā)明檢測(cè)所用溶液體積僅為15-30微升，可實(shí)現(xiàn)微量檢測(cè)，極大的提高了檢測(cè)靈敏度，并降低了檢測(cè)成本。

作為優(yōu)選方案，所述驅(qū)動(dòng)電壓為4.0-9.0V。電壓過高可能ITO膜會(huì)被破壞，因此電壓選擇該范圍。

本發(fā)明的構(gòu)思是：

以葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖復(fù)合膜修飾的ITO雙極電極為傳感界面，通過微流控芯片系統(tǒng)、鉑絲驅(qū)動(dòng)電極、直流穩(wěn)壓電源和CCD圖像傳感器實(shí)現(xiàn)葡萄糖的可視化電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。驅(qū)動(dòng)電極通過直流穩(wěn)壓電源提供驅(qū)動(dòng)電壓。向葡萄糖電化學(xué)發(fā)光傳感器芯片通道凹槽內(nèi)注入待測(cè)葡萄糖溶液和含有魯米諾的緩沖溶液，雙極電極表面修飾的葡萄糖氧化酶可催化溶解氧與葡萄糖反應(yīng)生成H₂O₂，并在外加電壓的驅(qū)動(dòng)下，與魯米諾發(fā)生電化學(xué)發(fā)光。產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)由傳感芯片上方的CCD圖像傳感器捕獲。在一定范圍內(nèi)，葡萄糖濃度越高，酶促反應(yīng)生成的過氧化氫越多，相應(yīng)的發(fā)光信號(hào)也越強(qiáng)，由此可以實(shí)現(xiàn)葡萄糖的可視化檢測(cè)。

本發(fā)明可視化電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測(cè)葡萄糖的測(cè)定原理為：

雙極電極陽極端修飾膜上的催化反應(yīng)：

葡萄糖與氧氣在葡萄糖氧化酶的作用下生成葡糖酸內(nèi)酯與雙氧水；

雙極電極陽極端的電化學(xué)反應(yīng)：

Luminol+H₂O₂→3-Aminophthalate+hv

魯米諾與雙氧水反應(yīng)生成3-氨基-鄰苯二甲酸二甲酯并伴隨發(fā)光；

雙極電極陰極端的電化學(xué)反應(yīng)：

4H₂O+4e^-→2H₂+4OH^-

本發(fā)明基于葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖修飾電極、雙極電極及微流控芯片技術(shù)，利用電化學(xué)發(fā)光成像來實(shí)現(xiàn)葡萄糖的可視化檢測(cè)。由于雙極電極是一種不需要外部電接觸即可在其末端發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的導(dǎo)電材料，這種特性使其便于進(jìn)行大量陣列分析，利于大批量生產(chǎn)，從而降低檢測(cè)成本。

采用的電化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)具有靈敏度高、光路簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，用于葡萄糖的可視化檢測(cè)，方法簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀。

本發(fā)明中電極修飾材料葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖，葡萄糖氧化酶氧化酶、碳納米管、殼聚糖缺一不可，有葡萄糖氧化酶才能有催化反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，進(jìn)而和魯米諾發(fā)生發(fā)光反應(yīng)；碳納米管是為了促進(jìn)電化學(xué)反應(yīng)，沒有碳納米管電化學(xué)反應(yīng)受阻，所以也沒有光產(chǎn)生；殼聚糖為成膜材料，如果沒有殼聚糖，葡萄糖氧化酶、碳納米管溶液無法穩(wěn)定地貼在電極表面。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單方便，葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖復(fù)合膜能使氧化酶很好的固定在電極表面，有較好成膜性，和生物相容性；碳納米管促進(jìn)電子傳遞作用，殼聚糖促進(jìn)成膜；該傳感器具有特異性好、靈敏度高、選擇性的優(yōu)點(diǎn)，且所用的材料廉價(jià)易得。

開放式雙極電極由于沒有外部電接觸，位于一個(gè)微通道中，發(fā)光試劑和被檢測(cè)物可混合在一個(gè)溶液里，可進(jìn)行大規(guī)模陣列分析，快速高通量檢測(cè)葡萄糖。

微流控芯片結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，制備簡(jiǎn)單，成本低廉，集成微型，利于大批量生產(chǎn)，大大降低檢測(cè)成本，有望應(yīng)用于血糖試紙的開發(fā)。

電化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)的高靈敏度，時(shí)間空間分辨，簡(jiǎn)化的光學(xué)器件，和視覺成像能力可視化，為檢測(cè)葡萄糖的含量提供了一項(xiàng)靈敏、簡(jiǎn)便且直觀的微量檢測(cè)方法。

該制備方法可以推廣到其他類型酶，用于其他生化分子的檢測(cè)，可開發(fā)出多成分檢測(cè)的雙極電極傳感器。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明基于雙極電極陣列的可視化電化學(xué)發(fā)光傳感器的裝置及反應(yīng)原理示意圖；

圖2為本發(fā)明ITO雙電極陣列的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本發(fā)明ITO雙電極陣列芯片的加工示意圖

圖4為葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖復(fù)合膜的電化學(xué)發(fā)光表征示意圖；

圖5是本發(fā)明的魯米諾濃度優(yōu)化圖；

圖6是本發(fā)明的雙極電極驅(qū)動(dòng)電壓優(yōu)化圖；

圖7是本發(fā)明葡萄糖檢測(cè)的電化學(xué)發(fā)光圖；其中，a對(duì)應(yīng)濃度0mM；b對(duì)應(yīng)濃度0.01mM；c對(duì)應(yīng)濃度0.05mM；d對(duì)應(yīng)濃度0.1mM；e對(duì)應(yīng)濃度0.2mM；f對(duì)應(yīng)濃度0.5mM；g對(duì)應(yīng)濃度1.0mM

圖8是本發(fā)明葡萄糖檢測(cè)的線性圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1基于雙極電極陣列的可視化電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備

如圖1、圖2、圖3所示，一種基于雙極電極陣列的可視化電化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法，包括步驟：

1)制備蓋片

將PDMS單體與固化劑以8∶1-12∶1的質(zhì)量比混合并攪拌均勻得PDMS母液，將PDMS母液于4℃環(huán)境下放置5-20min，然后脫氣20-40min；脫氣后倒在硅烷化的PDMS陽模上方平衡5-15min，然后蓋上保鮮膜，70-80℃加熱固化1-2小時(shí)；固化后，將PDMS從硅烷化的PDMS陽模上剝離，剪成3.0cm*1.2cm的蓋片，該蓋片上含有通道凹槽；用14G的平口針頭在PDMS蓋片通道兩端各加工一個(gè)直徑為0.5cm的圓形孔道，用于進(jìn)樣和放置驅(qū)動(dòng)電極；

2)制備基片

A.有三根ITO雙極電極基片的制備

將ITO導(dǎo)電玻璃切割成3.0cm*1.2cm的小片；將切割好的ITO導(dǎo)電玻璃置于0.8-1.2M NaOH的乙醇溶液中浸泡過夜，之后分別在丙酮、無水乙醇和去離子水中超聲清洗10-20min，將干凈的ITO導(dǎo)電玻璃用氮?dú)獯蹈桑挥萌f用表確定導(dǎo)電面，導(dǎo)電面朝上置于甩膠機(jī)圓盤上；用膠頭滴管吸取AZP4620正光膠后均勻滴涂在ITO導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電表面，在400-600rpm轉(zhuǎn)速下勻膠，然后在2500-3500rpm轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)動(dòng)30-50s甩膠；待在ITO導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電表面涂5-15微米厚的紅色光膠層后，將ITO導(dǎo)電玻璃置于105-115℃環(huán)境下烘干，然后于25-30℃的熱板上緩慢冷卻至室溫，形成厚度均勻的正光膠膠層。

將激光照排機(jī)繪制好的光刻掩膜與涂有正光膠膠層的ITO導(dǎo)電玻璃緊密貼合，然后進(jìn)行選擇性汞燈曝光2-6min，曝光后將導(dǎo)電玻璃置于0.5-1wt％的NaOH溶液中顯影至電極圖案完全顯現(xiàn)后取出導(dǎo)電玻璃；在去離子水中清洗除去殘余的顯影液，隨后用吹風(fēng)機(jī)吹干導(dǎo)電玻璃，然后在110℃熱板下烘30min，烘烤結(jié)束將熱板溫度調(diào)至20-25℃，在熱板上緩慢降至室溫。

繼續(xù)將導(dǎo)電玻璃置于硝酸與鹽酸的混合水溶液(硝酸、鹽酸與水的質(zhì)量比為2-3∶4-6∶4-6)中刻蝕6-15min，刻蝕完畢后，依次用去離子水、丙酮、去離子水超聲清洗各10min，干燥，得表面刻有三根ITO雙極電極的基片；

B.制備葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖復(fù)合物

殼聚糖溶于0.5-2wt％的醋酸水溶液中，超聲溶解，得5-15mg/mL的殼聚糖溶液，加入多壁碳納米管并超聲分散于殼聚糖溶液中得黑色懸濁液，碳納米管的加入量為1-3mg/mL；取濃度為3-8mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液與所述黑色懸濁液按照體積比1∶1-3混合，超聲溶解，得葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖復(fù)合材料的混合液，4℃保存；

C.ITO雙極電極的表面修飾

用疏水膠帶在所述ITO雙極電極的陽極端上貼一個(gè)用于防止修飾材料溶液擴(kuò)散的矩形區(qū)域，移取10-30微升葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖溶液滴于矩形區(qū)域表面；將芯片置于4℃冰箱內(nèi)，過夜干燥以形成葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖復(fù)合物薄膜修飾的ITO雙極電極；

3)芯片封合

將修飾好的蓋片和基片分別置于等離子體清洗室內(nèi)，各處理90秒和25秒。將基片上三根ITO雙極電極對(duì)準(zhǔn)蓋片通道凹槽的中部，然后緊密貼合，得葡萄糖電化學(xué)發(fā)光傳感器芯片。

實(shí)施例2基于雙極電極陣列的可視化電化學(xué)發(fā)光傳感器的表征與優(yōu)化

1、葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖復(fù)合膜的電化學(xué)發(fā)光表征

如圖4所示，a、b、c、d分別為未修飾ITO、碳納米管/殼聚糖修飾ITO、葡萄糖氧化酶/殼聚糖修飾ITO和葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖修飾ITO用于葡萄糖檢測(cè)的電化學(xué)發(fā)光圖像。

在未修飾ITO、碳納米管/殼聚糖修飾ITO上，由于沒有葡萄糖氧化酶，因此葡萄糖和溶解氧無法被催化產(chǎn)生過氧化氫，最終無法檢測(cè)到魯米諾的電化學(xué)發(fā)光(或僅存在微弱的背景光)。在葡萄糖氧化酶/殼聚糖修飾ITO上，由于沒有碳納米管，電化學(xué)反應(yīng)受阻，因此發(fā)光不明顯。葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖復(fù)合膜修飾的ITO電極發(fā)光最強(qiáng)。

2、魯米諾濃度優(yōu)化

如圖5所示，檢測(cè)不同魯米諾濃度時(shí)，葡萄糖氧化酶/碳納米管/殼聚糖復(fù)合膜電極上所獲得的發(fā)光圖像灰度值，魯米諾濃度為1.3mmol/L時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度較強(qiáng)且穩(wěn)定。

3、雙極電極驅(qū)動(dòng)電壓優(yōu)化

如圖6所示：當(dāng)BPE電極長(zhǎng)度為4mm，在傳感器中注入魯米諾和葡萄糖的緩沖溶液，不斷增加驅(qū)動(dòng)電壓，檢測(cè)雙極電極上的發(fā)光強(qiáng)度，選擇8V作為驅(qū)動(dòng)電壓。

4、基于以上優(yōu)化，采用基于雙極電極陣列的可視化電化學(xué)發(fā)光傳感器檢測(cè)葡萄糖的方法，在蓋片兩端的孔道上分別放置一根鉑絲，作為驅(qū)動(dòng)電極；驅(qū)動(dòng)電極通過直流穩(wěn)壓電源提供8V的驅(qū)動(dòng)電壓；向通道凹槽內(nèi)注入20微升含有待測(cè)葡萄糖溶液和魯米諾的緩沖溶液，其中，PBS的濃度為0.01mol/L，pH為7.4，葡萄糖的濃度為0.01mM-1mM，魯米諾的濃度為1.3mmol/L；雙極電極表面修飾的葡萄糖氧化酶催化溶解氧與葡萄糖反應(yīng)生成H₂O₂，并在外加電壓的驅(qū)動(dòng)下，與魯米諾發(fā)生電化學(xué)發(fā)光，產(chǎn)生的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)通過葡萄糖電化學(xué)發(fā)光傳感器芯片上方的CCD圖像傳感器捕獲；根據(jù)CCD圖像傳感器捕獲的發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度確定待測(cè)葡萄糖溶液中的葡萄糖濃度。

分別對(duì)0mM、0.01mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM和1.0mM系列濃度的葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖7和圖8所示；本發(fā)明方法檢測(cè)葡萄糖的最低檢出限為7.57μM；隨著葡萄糖濃度的升高，發(fā)光圖像的灰度值也逐漸增大。通過線性擬合可知，灰度值與葡萄糖濃度在0.01-1mM范圍內(nèi)有著良好的線性關(guān)系。所得擬合方程為：G＝1125+6757[glucose](mM)(R＝0.9746)。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員倆說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。