本發(fā)明屬于食品質(zhì)量檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于電子自旋共振波譜技術(shù)檢測海參加工過程中品質(zhì)變化的方法。

背景技術(shù)：

海參(Stichopus japonicus)富含蛋白質(zhì)、黏多糖及海參皂苷等多種生理活性物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，現(xiàn)已加工成多種產(chǎn)品形式。海參在加工過程中因其自溶特性必須經(jīng)過熱處理，而且對于即食海參還需經(jīng)過熱殺菌過程以保證一定的貨架期。然而，熱處理過程中常常伴隨物質(zhì)氧化的發(fā)生，目前已在多種水產(chǎn)品加工過程中發(fā)現(xiàn)熱處理會導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化，影響產(chǎn)品的加工品質(zhì)。研究海參加工過程中的氧化物，將為評價(jià)海參產(chǎn)品的品質(zhì)，預(yù)測海參產(chǎn)品的貨架期提供有力依據(jù)。

檢測蛋白、脂質(zhì)的氧化程度常用化學(xué)方法來進(jìn)行，如采用硫代巴比妥酸法測定脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一丙二醛的含量來評價(jià)脂質(zhì)的過氧化程度。但化學(xué)方法存在靈敏度和精確度不高的問題，同時(shí)脂質(zhì)過氧化其終產(chǎn)物比較復(fù)雜，除了丙二醛以外還有其他的醛類產(chǎn)物，會干擾測定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精度。

電子自旋共振(electron spin resonance,ESR)技術(shù)是檢測自由基最直接最有效的方法，是自由基生物學(xué)和醫(yī)學(xué)不可缺少的重要研究技術(shù)。捕獲劑ST與自由基R·反應(yīng)形成的自旋加合物R-ST具有相對較長的壽命而且有特征的ESR波譜，可以方便地在ESR波譜儀上檢測?；钚匝踝杂苫谑称返难趸瘮≈衅鹬鴽Q定性的作用。質(zhì)量控制時(shí)，可以在食品生產(chǎn)的流程中定時(shí)地加入捕獲劑，定時(shí)采樣，然后在ESR波譜儀上檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于電子自旋共振波譜技術(shù)檢測海參加工過程中品質(zhì)變化的方法，以解決利用化學(xué)方法檢測存在靈敏度和精確度不高的問題。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種基于電子自旋共振波譜技術(shù)檢測海參加工過程中品質(zhì)變化的方法，包括以下步驟：

步驟1，將自由基捕獲劑α-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮加入到待檢測的海參試樣，使自由基捕獲劑的濃度為20-60mM；

步驟2，將步驟1獲得的混合樣品進(jìn)行熱加工處理；

步驟3，熱處理后的樣品立即放入冰浴中保存，檢測時(shí)對樣品進(jìn)行離心，用毛細(xì)管吸取上清液進(jìn)行電子自旋共振檢測；電子自旋共振檢測的掃描條件為：中心磁場：3490-3510G；掃描寬度：50-100G；頻率：9.85GHz；衰減器：20.00dB；功率：1.50-2.50mW；接收增益：1.00×10⁵-1.00×10⁶；調(diào)制頻率：100kHz；調(diào)制幅度：1.00G；相位調(diào)變：0.00deg；偏移量：0.00％；時(shí)間常數(shù)：4000.00-6000.00msec；轉(zhuǎn)換時(shí)間：300.00-400.00msec。

本發(fā)明如上所述的基于電子自旋共振波譜技術(shù)檢測海參加工過程中品質(zhì)變化的方法，優(yōu)選地，在步驟1之前還包括海參試樣預(yù)處理，將新鮮的海參宰殺去臟、去筋，按1:3-1:10的重量配比加入pH5.5-8.0的磷酸鹽緩沖液，在冰浴條件下勻漿獲得海參試樣。

本發(fā)明如上所述的基于電子自旋共振波譜技術(shù)檢測海參加工過程中品質(zhì)變化的方法，優(yōu)選地，步驟2中的熱處理的條件為，75-121℃溫度下加熱時(shí)間10min-5h。更優(yōu)選地，步驟2中的熱處理的條件為，90-100℃溫度下加熱時(shí)間2-4h。

本發(fā)明如上所述的基于電子自旋共振波譜技術(shù)檢測海參加工過程中品質(zhì)變化的方法，優(yōu)選地，步驟3中的離心處理的條件為，在8000-13000rpm轉(zhuǎn)速，4-10℃的溫度條件下離心5-20min。更優(yōu)選地，步驟3中的離心處理的條件為，在6-8℃的溫度條件下離心10-16min。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明是應(yīng)用ESR技術(shù)檢測海參加工過程中氧化物質(zhì)的生成，以反映海參在加工過程中的品質(zhì)變化，為海參生產(chǎn)及加工提供理論參考，從而通過控制加工工藝參數(shù)來提高海參的品質(zhì)。本發(fā)明為海參加工過程中的品質(zhì)檢測提供更快速、準(zhǔn)確的方法及明確的規(guī)范。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的檢測結(jié)果圖；

圖2為實(shí)施例2的檢測結(jié)果圖；

圖3為實(shí)施例2的檢測結(jié)果圖；

圖4為實(shí)施例3的檢測結(jié)果圖；。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種基于電子自旋共振波譜技術(shù)檢測海參加工過程中品質(zhì)變化的方法，包括以下步驟：

準(zhǔn)備步驟：海參試樣預(yù)處理，將新鮮的海參宰殺去臟、去筋，按1:3-1:10的重量配比加入pH5.5-8.0的磷酸鹽緩沖液，在冰浴條件下勻漿獲得海參試樣。

步驟1，將自由基捕獲劑α-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮加入到待檢測的海參試樣，使自由基捕獲劑的濃度為20-60mM；

步驟2，將步驟1獲得的混合樣品進(jìn)行熱加工處理；在優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟2中的熱處理的條件為，75-121℃溫度下加熱時(shí)間10min-5h。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟2中的熱處理的條件為，90-100℃溫度下加熱時(shí)間2-4h。

步驟3，熱處理后的樣品立即放入冰浴中保存，檢測時(shí)對樣品進(jìn)行離心，在優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟3中的離心處理的條件為，在8000-13000rpm轉(zhuǎn)速，4-10℃的溫度條件下離心5-20min。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，步驟3中的離心處理的條件為，在6-8℃的溫度條件下離心10-16min。用毛細(xì)管吸取上清液進(jìn)行電子自旋共振檢測；電子自旋共振檢測的掃描條件為：中心磁場：3490-3510G；掃描寬度：50-100G；頻率：9.85GHz；衰減器：20.00dB；功率：1.50-2.50mW；接收增益：1.00×10⁵-1.00×10⁶；調(diào)制頻率：100kHz；調(diào)制幅度：1.00G；相位調(diào)變：0.00deg；偏移量：0.00％；時(shí)間常數(shù)：4000.00-6000.00msec；轉(zhuǎn)換時(shí)間：300.00-400.00msec。

對于不同樣品，掃描條件選擇有所不同。中心磁場是為保證所得波譜能夠近似呈對稱分布，因此過高或過低都會影響波譜信號的位置；掃描寬度的選擇要能夠覆蓋全部的波譜以便于搜索到共振信號，但不易過寬，這樣會影響檢測靈敏度且會增加掃描時(shí)間，應(yīng)根據(jù)檢測樣品選擇合適的掃描寬度；頻率與衰減器值為自動給出；ESR信號強(qiáng)度與功率有關(guān)，低溫下樣品容易飽和，為保證樣品不受損壞，因此，所選功率不易過大；接收增益的選擇以獲得大小合適、清晰可見的波譜即可；ESR波譜儀共7個(gè)調(diào)制頻率，最高為100kHz，此時(shí)呈現(xiàn)的超精細(xì)分裂清楚，圖譜形狀較佳，因?yàn)?，調(diào)制頻率設(shè)定為100kHz；調(diào)制幅度的選擇直接影響ESR信號的幅值和形狀，且調(diào)制幅度的選擇要與樣品的線寬相吻合，當(dāng)大于1.00G時(shí)，不僅引起ESR信號的幅度下降，而且過零點(diǎn)(共振位置)向左(反磁場掃描)的方向移動，選擇比較小的調(diào)制幅度可以精確地測定樣品的譜形，實(shí)現(xiàn)高分辨率的檢測，而增大調(diào)制幅度可實(shí)現(xiàn)高靈敏度的檢測，但又要考慮到失真允許的限度，因此，調(diào)制幅度設(shè)定為1.00G；相位調(diào)變設(shè)定為0.00deg，輸出信號的幅度最大；偏移量為固定值0.00％；時(shí)間常數(shù)的選擇與接收增益有關(guān)，當(dāng)接收增益增加10倍時(shí)，時(shí)間常數(shù)應(yīng)增加100倍；轉(zhuǎn)換時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，對于海參樣品的檢測時(shí)間常數(shù)在4000.00-6000.00msec、轉(zhuǎn)換時(shí)間在300.00-400.00msec較合適。

以下實(shí)施例中所用試劑、儀器的規(guī)格型號及生產(chǎn)廠家如下：

試劑：磷酸氫二鈉，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；磷酸二氫鈉，分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；α-(4-吡啶基-1-氧)-N-叔丁基硝基酮(POBN)，色譜純，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

注：磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉按一定比例配制)

儀器：ESR檢測儀，A200型，布魯克拜厄斯賓有限公司；干浴器，HEATER 2型，德國IKA公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-4型，常州智博瑞儀器制造有限公司；電子分析天平，AB2004-N型，梅特勒-托利多儀器有限公司；冰箱，BD-B2型，海爾集團(tuán)電冰箱廠；冷凍離心機(jī)，Sorvall Legend Micro 17R型，Thermo Scientific。

實(shí)施例1

(1)原料處理：將新鮮的海參宰殺去臟、去筋，按1:5的比例加入pH 6.0的磷酸鹽緩沖液(50mM)，在冰浴條件下勻漿，勻漿后獲得的勻漿液直接用于熱處理。

(2)與捕獲劑的混合：將自由基捕獲劑POBN加入海參勻漿液中，使POBN的終濃度為30mM，二者混合均勻。

(3)熱加工處理：將混合后的樣品在95℃條件下加熱4h。

(4)ESR檢測：熱處理后的樣品立即放入冰浴中，在10000rpm，4℃的條件下離心10min。然后放回冰浴，用毛細(xì)管吸取上清液進(jìn)行ESR檢測。ESR檢測時(shí)的掃描條件為：

中心磁場：3505G；掃描寬度：50G；頻率：9.85GHz；衰減器：20.00dB；功率：2.05mW；接收增益：1.00×10⁵；調(diào)制頻率：100kHz；調(diào)制幅度：1.00G；相位調(diào)變：0.00deg；偏移量：0.00％；時(shí)間常數(shù)：5242.88msec；轉(zhuǎn)換時(shí)間：360.00msec。

測得的ESR圖譜如圖1所示，用第一組峰的兩個(gè)峰振幅的平均值來代表捕獲到的自由基的ESR信號強(qiáng)度，為49318。即采用該方法測定海參在95℃加熱4h過程中產(chǎn)生的自由基ESR信號強(qiáng)度為49318。

實(shí)施例2

(1)原料處理：將新鮮的海參宰殺去臟、去筋，按1:10的比例加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(50mM)，在冰浴條件下勻漿，勻漿后獲得的勻漿液-30℃暫存。

(2)與捕獲劑的混合：海參勻漿液4℃解凍后，將自由基捕獲劑POBN加入海參勻漿液中，使POBN的終濃度為40mM，二者混合均勻。

(3)熱加工處理：將混合后的樣品分裝成5份，分別在115℃條件下加熱0,1h,2h,3h,4h,5h。

(4)ESR檢測：熱處理后的樣品立即放入冰浴中，在12000rpm，2℃的條件下離心15min。然后放回冰浴，用毛細(xì)管吸取上清液進(jìn)行ESR檢測。ESR檢測時(shí)的掃描條件為：

中心磁場：3505G；掃描寬度：50G；頻率：9.85GHz；衰減器：20.00dB；功率：1.93mW；接收增益：1.00×10⁵；調(diào)制頻率：100kHz；調(diào)制幅度：1.00G；相位調(diào)變：0.00deg；偏移量：0.00％；時(shí)間常數(shù)：4800.00msec；轉(zhuǎn)換時(shí)間：360.00msec。

可得到一系列的ESR圖譜如圖2所示，用第一組峰的兩個(gè)峰振幅的平均值來代表捕獲到的自由基的ESR信號強(qiáng)度，采用該方法測定海參在115℃加熱不同時(shí)間產(chǎn)生的自由基ESR信號強(qiáng)度變化如圖2，海參在115℃隨時(shí)間變化的趨勢如圖3。

實(shí)施例3

(1)原料處理：將新鮮的海參宰殺去臟、去筋，按1:3的比例加入pH 5.5的磷酸鹽緩沖液(50mM)，在冰浴條件下勻漿，勻漿后獲得的勻漿液直接用于熱處理。

(2)與捕獲劑的混合：將自由基捕獲劑POBN加入海參勻漿液中，使POBN的終濃度為50mM，二者混合均勻。

(3)熱加工處理：將混合后的樣品模擬殺菌條件在121℃處理15min。

(4)ESR檢測：熱處理后的樣品立即放入冰浴中，在13000rpm，4℃的條件下離心20min。然后放回冰浴，用毛細(xì)管吸取上清液進(jìn)行ESR檢測。ESR檢測時(shí)的掃描條件為：

中心磁場：3505G；掃描寬度：50G；頻率：9.85GHz；衰減器：20.00dB；功率：2.00mW；接收增益：1.00×10⁶；調(diào)制頻率：100kHz；調(diào)制幅度：1.00G；相位調(diào)變：0.00deg；偏移量：0.00％；時(shí)間常數(shù)：5000.00msec；轉(zhuǎn)換時(shí)間：400.00msec。

測得的ESR圖譜如圖4所示，用第一組峰的兩個(gè)峰振幅的平均值來代表捕獲到的自由基的ESR信號強(qiáng)度，為648345。即采用該方法測定海參殺菌條件121℃處理15min產(chǎn)生的自由基ESR信號強(qiáng)度為648345。

實(shí)施例4

(1)原料處理：將新鮮的海參宰殺去臟、去筋，按1:4的比例加入pH 8.0的磷酸鹽緩沖液(50mM)，在冰浴條件下勻漿，勻漿后獲得的勻漿液直接用于熱處理。

(2)與捕獲劑的混合：將自由基捕獲劑POBN加入海參勻漿液中，使POBN的終濃度為20mM，二者混合均勻。

(3)熱加工處理：將混合后的樣品在75℃條件下加熱5h。

(4)ESR檢測：熱處理后的樣品立即放入冰浴中，在8000rpm，8℃的條件下離心5min。然后放回冰浴，用毛細(xì)管吸取上清液進(jìn)行ESR檢測。ESR檢測時(shí)的掃描條件為：

中心磁場：3510G；掃描寬度：70G；頻率：9.85GHz；衰減器：20.00dB；功率：2.05mW；接收增益：1.00×10⁵；調(diào)制頻率：100kHz；調(diào)制幅度：1.00G；相位調(diào)變：0.00deg；偏移量：0.00％；時(shí)間常數(shù)：5242.88msec；轉(zhuǎn)換時(shí)間：360.00msec。

測得的ESR圖譜用第一組峰的兩個(gè)峰振幅的平均值來代表捕獲到的自由基的ESR信號強(qiáng)度為19952。即采用該方法測定海參在75℃條件下加熱5h過程中產(chǎn)生的自由基ESR信號強(qiáng)度為19952。

實(shí)施例5

(1)原料處理：將新鮮的海參宰殺去臟、去筋，按1:7的比例加入pH 7.0的磷酸鹽緩沖液(50mM)，在冰浴條件下勻漿，勻漿后獲得的勻漿液直接用于熱處理。

(2)與捕獲劑的混合：將自由基捕獲劑POBN加入海參勻漿液中，使POBN的終濃度為60mM，二者混合均勻。

(3)熱加工處理：將混合后的樣品模擬殺菌條件在90℃處理4h。

(4)ESR檢測：熱處理后的樣品立即放入冰浴中，在9000rpm，10℃的條件下離心18min。然后放回冰浴，用毛細(xì)管吸取上清液進(jìn)行ESR檢測。ESR檢測時(shí)的掃描條件為：

中心磁場：3500G；掃描寬度：80G；頻率：9.85GHz；衰減器：20.00dB；功率：2.00mW；接收增益：1.00×10⁶；調(diào)制頻率：100kHz；調(diào)制幅度：1.00G；相位調(diào)變：0.00deg；偏移量：0.00％；時(shí)間常數(shù)：5000.00msec；轉(zhuǎn)換時(shí)間：400.00msec。

測得的ESR圖譜用第一組峰的兩個(gè)峰振幅的平均值來代表捕獲到的自由基的ESR信號強(qiáng)度為219769。即采用該方法測定海參殺菌條件85℃處理10min產(chǎn)生的自由基ESR信號強(qiáng)度為219769。

以上實(shí)施例僅為本發(fā)明的示例性實(shí)施例，不用于限制本發(fā)明，本發(fā)明的保護(hù)范圍由權(quán)利要求書限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍內(nèi)，對本發(fā)明做出各種修改或等同替換，這種修改或等同替換也應(yīng)視為落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。