本發(fā)明涉及生物毒性檢測領(lǐng)域，尤其是涉及水體中污染物質(zhì)的急性生物毒性檢測。

背景技術(shù)：

由于對全球工業(yè)化的負(fù)面效應(yīng)和高度發(fā)達(dá)的制造業(yè)的負(fù)面影響的預(yù)期不足，近幾十年來，環(huán)境污染事故頻發(fā)?；瘜W(xué)污染物排放到自然環(huán)境中，對環(huán)境生物以及人類生活都構(gòu)成了巨大的潛在威脅。因此迫切需要提高公眾對環(huán)境保護(hù)的認(rèn)識，建立一個快速、簡便、實時的監(jiān)測系統(tǒng)，以對環(huán)境中的急性生物毒性進(jìn)行檢測，并對環(huán)境生物的潛在危害進(jìn)行評估，提供一個可以實現(xiàn)提前預(yù)警和在線監(jiān)測的方法。

目前建立的比較成熟的水體分析方法主要是基于色譜分析，盡管色譜分析方法具有很高的檢測靈敏度和廣譜性，但在實際操作中它不僅需要專業(yè)人員的操作，而且不能提供實時監(jiān)測數(shù)據(jù)，也不能夠反映樣品的生物危害性。在這樣的背景下，生物傳感器的出現(xiàn)成為了水體急性生物毒性檢測的替代和互補(bǔ)的工具。

在生物毒性檢測領(lǐng)域，目前比較成熟產(chǎn)品的主要有ToxAlert 10，Microtox以及LUMIStox，其檢測機(jī)理主要是基于費氏弧菌的熒光響應(yīng)，盡管其具有很高的靈敏度且能夠很好地反應(yīng)水體生物毒性的大小，但由于其不能夠?qū)崟r在線檢測，以及對水體的清潔程度要求較高等缺點，因此不適用與實際水體的在線監(jiān)測。電化學(xué)法具有靈敏度高、易于在線檢測、與現(xiàn)代分析儀器兼容性好等特點，利用電化學(xué)方法來進(jìn)行即時監(jiān)測及檢測水體生物毒性有著廣泛的應(yīng)用前景，受到越來越多的關(guān)注。但是現(xiàn)有的電化學(xué)生物傳感器進(jìn)行生物毒性檢測時，往往需要額外向檢測體系中加入電子介體，這不僅使檢測步驟更加復(fù)雜，而且加入的電子介體往往很難除去，對檢測體系造成二次污染。此外，現(xiàn)有的電化學(xué)檢測體系大多采用單一電子介體，脂溶性的電子介體能夠更好的與菌體進(jìn)行電子傳遞，但在水中的溶解度低，而水溶性的電子介體雖然溶解度較高，但與菌體的電子傳遞效率低，因此這種傳感器往往存在檢測 信號弱，靈敏度低等問題。

因此，需要提供一種新型的檢測水體生物毒性的電化學(xué)傳感器及其制備方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種可用于即時監(jiān)測和檢測水體生物毒性的電化學(xué)生物傳感器；它包括工作電極、對電極、參比電極、電解池；它可進(jìn)行即時監(jiān)測水體生物毒性的改變和檢測水體生物毒性大小，達(dá)到即時、在線、連續(xù)的檢測，具有分析靈敏度高、成本低廉、操作簡單、便于攜帶等特點。

本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種可用于即時監(jiān)測和檢測水體生物毒性的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種檢測水體急性生物毒性的雙電子介體電化學(xué)生物傳感器，其通過如下方法制備：

制備微生物菌液；將電子介體固定在菌體表面；制備高分子膜包覆電極；所述高分子膜包覆電極吸附固定微生物菌體，制得雙電子介體電化學(xué)生物傳感器；

其中，所述電子介體固定在菌體表面的方法包括如下步驟：在菌液體系中加入葡萄糖、水溶性介體和脂溶性介體，恒溫培養(yǎng)；離心法洗滌菌體；重懸菌體得到固定有雙電子介體的菌液；所述水溶性介體為鐵氰化鉀；所述脂溶性介體選自苯醌、二氯酚靛酚、甲萘醌、中性紅、沒食子藍(lán)、甲基紅、1-甲氧基吩嗪硫酸甲酯、異吩惡唑酮或2,3,5,6-四甲基-1,4-苯二胺和甲苯胺藍(lán)，優(yōu)選為甲萘醌；

所述制備高分子生物膜包覆電極的方法包括如下步驟：制備殼聚糖水溶膠；將所述水溶膠電沉積于玻碳電極表面，清洗，制得高分子生物膜包覆電極；其中所述殼聚糖水溶膠為：硼摻雜納米金剛石殼聚糖水溶膠、石墨烯殼聚糖水溶膠或碳量子點殼聚糖水溶膠，優(yōu)選為硼摻雜納米金剛石殼聚糖水溶膠；

所述高分子膜包覆電極吸附固定微生物菌體的方法包括如下步驟：將高分子生物膜包覆電極浸泡在固定有電子介體的菌液中，靜置吸附；清洗，即 獲得微生物傳感器。所述菌體為大腸桿菌或酵母，優(yōu)選地，所述酵母為釀酒酵母。

其中所述培養(yǎng)基為細(xì)菌或真菌培養(yǎng)基，優(yōu)選地，所述細(xì)菌培養(yǎng)基選自但不限于LB培養(yǎng)基、SOB培養(yǎng)基或SOC培養(yǎng)基；所述真菌培養(yǎng)基選自但不限于YPD、YEPD或MA培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基為無菌培養(yǎng)基。優(yōu)選地，培養(yǎng)菌體至對數(shù)生長期。

所述收集菌體的方法為：離心分離培養(yǎng)的菌體；離心法洗滌菌體；將清洗后的菌體重新懸浮，即得到微生物菌液。所述收集菌體的方法進(jìn)一步包括將菌液濃度調(diào)整至OD600＝3.0。

所述離心法洗滌菌體是指用緩沖液將菌體重懸后，再次離心菌體，以收集菌體。可用離心法多次洗滌菌體沉淀。所用緩沖液可以是本領(lǐng)域可用的緩沖液，如PBS、0.65-0.9％的NaCl或TBS。

所述葡萄糖的濃度為0-7.5mM；所述脂溶性介體的濃度為0-0.5mM；所述甲萘醌的濃度為0.01-0.1mM；所述鐵氰化鉀的濃度為5-40mM。

所述制備高分子生物膜包覆電極方法包括如下步驟：制備殼聚糖水溶膠；將所述水溶膠電沉積于玻碳電極表面，清洗，制得高分子生物膜包覆電極。

所述生物傳感器可置于4℃冰箱中冷藏待用。

所述雙電子介體電化學(xué)生物傳感器可作為工作電極與對電極與參比電極組成三電極體系。

利用所述雙電子介體電化學(xué)生物傳感器檢測水體的生物毒性的方法，包括如下步驟：

在電解池中將工作電極、對電極和參比電極組成三電極體系；在電解池中加入平衡液并施加電壓；電流穩(wěn)定后加入待測樣品；利用抑制率判定待測樣品的毒性，所述工作電極為雙電子介體電化學(xué)生物傳感器。

所述對電極為Pt電極或碳電極，優(yōu)選地為Pt對電極。

所述參比電極為飽和甘汞電極或Ag/AgCl(sat’KCl)電極，優(yōu)選地為Ag/AgCl(sat’KCl)電極。

所施加電壓為0.4-0.6V。

樣品含有有毒物質(zhì)時，由于有毒物質(zhì)對微生物細(xì)胞代謝活動的抑制作用，會導(dǎo)致陽極電流的下降。所述抑制率反應(yīng)加入待測樣品前后電流的變化，通過以下公式計算：

抑制率(％)＝(1-I₂/I₁)×100％

其中，I₁是加入待測樣品前的穩(wěn)態(tài)電流，I₂是加入待測樣品后的穩(wěn)態(tài)電流。

當(dāng)抑制率為50％時的有毒物質(zhì)的濃度為該有毒物質(zhì)的IC50值，IC50值能夠間接反應(yīng)水體生物毒性的大小。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明通過鐵氰化鉀-甲萘醌雙電子介體與酵母菌的特異性作用將電子介體固定，并將固定有電子介體的微生物通過吸附的作用制備成微生物膜生物電極，得到全細(xì)胞微生物電化學(xué)傳感器，用于水體中重金屬離子、酚類、農(nóng)藥等有毒物質(zhì)的急性生物毒性檢測。雙電子介體會大大增強(qiáng)信號強(qiáng)度，提高傳感器的靈敏度。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1示出鐵氰化鉀-甲萘醌雙電子介體檢測生物毒性原理圖。

圖2示出單一電子介體和雙電子介體的計時電流曲線。

圖3示出3,5-二氯苯酚生物毒性的檢測結(jié)果。

圖4示Cu²⁺的生物毒性的檢測結(jié)果。

圖5示出出3種實際水體生物毒性的檢測結(jié)果。

具體實施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例1：單一電子介體電化學(xué)生物傳感器和雙電子介體電化學(xué)生物傳感器電流放大效果對比

1.雙電子介體電化學(xué)生物傳感器的制備：

釀酒酵母的(YEPD)培養(yǎng)基配制方法如下：取1g酵母膏、2g蛋白胨溶于90ml去離子水中，取1g葡萄糖溶于10ml去離子水中，于120℃高壓滅菌鍋中分別滅菌20min，自然冷卻后混合即可使用。

接種培養(yǎng):取100mL YPED培養(yǎng)基，接種釀酒酵母(S288C)，30℃恒溫水浴培養(yǎng)16h，搖床速度200rpm，培養(yǎng)所得細(xì)菌正好處于對數(shù)生長期。

收集菌體：將培養(yǎng)所得的酵母菌離心分離，轉(zhuǎn)速6000rpm，離心5min，用50mM PBS將離心所得的菌體沉淀清洗兩次，然后將清洗后的菌體沉淀重新懸浮在50mM PBS中，得到一定濃度的菌液待用；調(diào)整菌液濃度至OD600＝3.0。

2、固定電子介體：在10mL的菌液體系中，加入7.5mM葡萄糖，0.05mM甲萘醌，20mM鐵氰化鉀，30℃恒溫培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)后的菌體6000rpm離心8min，所得到的菌體用50mM PBS重新懸浮，定容至10mL。

3、制備高分子膜包覆電極：取0.1g殼聚糖，100μl冰醋酸，7.455mg KCl，5mg cBND，超聲溶解在10mL超純水中，制得硼摻雜納米金剛石殼聚糖水溶膠。將所得到的殼聚糖水溶膠在-3V vs Ag/AgCl(sat’KCl)的電壓下電沉積5min，得到沉積有殼聚糖薄膜的玻碳電極，將所得到的沉積有殼聚糖薄膜的玻碳電極用超純水反復(fù)清洗，洗去未沉積的殼聚糖溶膠，制得高分子膜包覆電極。

4.制備雙電子介體電化學(xué)生物傳感器：將高分子膜包覆電極浸泡在上述步驟中所得的吸附有介體的菌體懸浮液中，靜置吸附30min，用超純水反復(fù)清洗，洗去未完全吸附的菌體，即制得雙電子介體生物傳感器，所得工作電極可置于4℃冰箱中冷藏待用。

5.單電子介體生物傳感器的制備：

采用與雙電子介體電化學(xué)生物傳感器中相同的步驟合成高分子膜包覆的電極，但是在介體吸附固定中采用單電子介體，制備單電子介體電化學(xué)生物傳感器)，具體步驟如下：

在10mL的菌液體系中，加入7.5mM葡萄糖，0.05mM甲萘醌，30℃恒溫培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)后的菌體6000rpm離心8min，所得到的菌體用50mM重新懸浮，定容至10mL，獲得吸附有單電子介體(甲萘醌)的菌體懸浮液。

將高分子膜包覆電極浸泡在所得的吸附有單電子介體的菌體懸浮液中，靜置吸附30min，用超純水反復(fù)清洗，洗去未完全吸附的菌體，即制得甲萘醌單介體電化學(xué)生物傳感器；

在10mL的菌液體系中，加入7.5mM葡萄糖，20mM K₃Fe(CN)₆，30℃恒溫培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)后的菌體6000rpm離心8min，所得到的菌體用50mM PBS重新懸浮，定容至10mL，獲得吸附有單電子介體(K₃Fe(CN)₆)的菌體懸浮液。

將沉積有殼聚糖薄膜的玻碳電極浸泡在所得的吸附有單電子介體 (K₃Fe(CN)₆)的菌體懸浮液中，靜置吸附30min，用超純水反復(fù)清洗，洗去未完全吸附的菌體，即制得K₃Fe(CN)₆單介體電化學(xué)生物傳感器；

6.電流信號檢測：

將雙電子生物傳感器用O型墊圈壓緊作為工作電極，Pt絲為對電極，Ag/AgCl(sat’KCl)為參比電極組裝成三電極體系。電解池中加入超純水作為平衡溶液，施加0.4V電壓(vs Ag/AgCl sat’KCl)，待體系穩(wěn)定5min后加入25mg/L 3,5-二氯苯酚(DCP)溶液，測量加入毒物前后的穩(wěn)態(tài)電流。

采用上述相同步驟，將單電子介體生物傳感器用O型墊圈壓緊作為工作電極，Pt絲為對電極，Ag/AgCl(sat’KCl)為參比電極組裝成三電極體系。電解池中加入超純水作為平衡溶液，施加0.4V電壓(vs Ag/AgCl sat’KCl)，待體系穩(wěn)定5min后加入25mg/L 3,5-二氯苯酚(DCP)溶液，測量加入毒物前后的穩(wěn)態(tài)電流。

7.結(jié)果分析

當(dāng)采用雙電子介體電化學(xué)生物傳感器作為工作電極時，其電流強(qiáng)度是使用K₃Fe(CN)₆作為電子介體的單電子介體電化學(xué)生物傳感器的2倍，是使用甲萘醌作為電子介體的單電子介體電化學(xué)生物傳感器的13倍。此外，當(dāng)使用雙電子介體電化學(xué)生物傳感器時，對毒物的檢測靈敏度也比使用單電子介體電化學(xué)生物傳感器有很大提升，如圖2，當(dāng)在300s處加入25mg/L DCP時，雙電子介體電化學(xué)生物傳感器的電流出現(xiàn)明顯的下降，而兩種單電子介體電弧學(xué)生物傳感器對毒物的信號響應(yīng)并不明顯。因此，采用雙電子介體電化學(xué)生物傳感器對電流信號強(qiáng)度，檢測靈敏度都有很大的提升。

實施例2：3,5-二氯苯酚的水體生物毒性檢測：

1.制備工作電極

釀酒酵母的(YEPD)培養(yǎng)基配制方法如下：取1g酵母膏、2g蛋白胨溶于90ml去離子水中，取1g葡萄糖溶于10ml去離子水中，于120℃高壓滅菌鍋中分別滅菌20min，自然冷卻后混合即可使用。

接種培養(yǎng):取100mL YPED培養(yǎng)基，接種釀酒酵母(S288C)，30℃恒溫水浴培養(yǎng)16h，搖床速度200rpm，培養(yǎng)所得細(xì)菌正好處于對數(shù)生長期。

收集菌體：將培養(yǎng)所得的酵母菌離心分離，轉(zhuǎn)速6000rpm，離心5min，用50mM PBS將離心所得的菌體沉淀清洗兩次，然后將清洗后的菌體沉淀重新懸浮在50mM PBS中，得到一定濃度的菌液待用；調(diào)整菌液濃度至 OD600＝3.0。

2、固定電子介體：在10mL的菌液體系中，加入7.5mM葡萄糖，0.05mM甲萘醌，20mM鐵氰化鉀，30℃恒溫培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)后的菌體6000rpm離心8min，所得到的菌體用50mM PBS重新懸浮，定容至10mL，獲得吸附有雙電子介體的菌體懸浮液。

3、制備高分子膜包覆電極：取0.1g殼聚糖，100μl冰醋酸，7.455mg KCl，5mg cBND，超聲溶解在10mL超純水中，制得硼摻雜納米金剛石殼聚糖水溶膠。將所得到的殼聚糖水溶膠在-3V vs Ag/AgCl(sat’KCl)的電壓下電沉積5min，得到沉積有殼聚糖薄膜的玻碳電極，將所得到的沉積有殼聚糖薄膜的玻碳電極用超純水反復(fù)清洗，洗去未沉積的殼聚糖溶膠，制得高分子膜包覆電極。

4.制備雙電子介體電化學(xué)生物傳感器：將高分子膜包覆電極浸泡在上述步驟中所得的獲得吸附有雙電子介體的菌體懸浮液中，靜置吸附30min，用超純水反復(fù)清洗，洗去未完全吸附的菌體，即制得雙電子介體電化學(xué)生物傳感器，所得工作電極可置于4℃冰箱中冷藏待用。

5.水體毒性的檢測

在室溫條件下，將實施例2所制備雙電子介體電化學(xué)生物傳感器作為工作電極用O型墊圈壓緊，采用Pt絲作為對電極，Ag/AgCl(sat’KCl)為參比電極組裝成三電極體系，電解池中加入超純水作為平衡溶液，施加0.4V電壓(vs Ag/AgCl sat’KCl)，待體系穩(wěn)定5min后加入3,5-二氯苯酚(DCP)溶液，DCP所選取的濃度梯度為0、5、10、15、20、25mg/L，測量加入DCP后的穩(wěn)態(tài)電流。

利用抑制率判定待測樣品的毒性。所述抑制率反應(yīng)加入待測樣品前后電流的變化，通過以下公式計算：

抑制率(％)＝(1-I₂/I₁)×100％

其中，I₁是加入待測樣品前的穩(wěn)態(tài)電流，I₂是加入待測樣品后的穩(wěn)態(tài)電流。

根據(jù)公式計算其抑制率，并根據(jù)抑制率曲線，見圖3，計算其IC50值為16.48mg/L。

實施例3：Cu²⁺的水體生物毒性檢測：

制備濃度梯度為0、5、10、15、20、25mg/L的Cu²⁺溶液，檢測不同濃度的Cu²⁺的生物毒性，具體檢測過程同實施例2，根據(jù)公式計算其抑制率， 得到濃度-抑制率曲線，見圖4。計算得到Cu²⁺的IC50為10.12mg/L。

實施例4：實際水體的生物毒性檢測：

對垃圾填埋場廢水、電鍍廢水和實驗室有機(jī)廢水等實際水體的生物毒性進(jìn)行檢測，檢測方法同實施例2，根據(jù)加入廢水前后穩(wěn)態(tài)電流的變化計算抑制率，比較實際廢水的生物毒性大小，見圖5。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。