一種page的高效銀染方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于聚丙烯酰氨凝膠的高效銀染方法。所述方法包括步驟：1)取下凝膠，浸泡在固定液中，處理2分鐘，所述固定液的配方為：10％Ethanol；1.0％Acetic acid；2)把凝膠取出放入0.2％AgNO3滲透液中處理3分鐘，取出凝膠，迅速放至水中，清洗20秒；3)把凝膠放進(jìn)顯色液中，2分鐘即可顯色，所述顯色液配方為2％NaOH；20mL 37％HCOH/L；0.0175‰Na2S2O3。本發(fā)明的銀染過程可在10分鐘內(nèi)完成，幾乎是已報(bào)到的銀染方法中需時(shí)最少的，顯著提高了實(shí)驗(yàn)的效率。
【專利說明】一種PAGE的高效銀染方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于聚丙烯酰氨凝膠的高效銀染方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 聚丙烯酰氨凝膠電泳是目前常用的檢測(cè)DNA的方法，其分辨率好，能檢測(cè)出DNA片 段間甚至lbp大小的差異，且通量高，可以在樣品量較少的情況下進(jìn)行大批量的檢測(cè)。銀染 法憑借其毒性輕、污染小等優(yōu)點(diǎn)，是聚丙烯酰氨凝膠電泳中常用的一種染色方法。
[0003] 該染色技術(shù)的首次應(yīng)用是在蛋白的檢測(cè)上（Switzeretal. 1979)，隨后該技術(shù)被 廣泛的應(yīng)用在核酸的檢測(cè)上（Guoetal. 2008)。如今隨著數(shù)量性狀的遺傳定位、遺傳圖譜 的構(gòu)建、關(guān)聯(lián)分析等研宄的快速發(fā)展，越來越多的核酸片段需要銀染法來染色檢測(cè)（Liang etal. 2014)。然而傳統(tǒng)的銀染方法往往藥品配置復(fù)雜、過程繁瑣、所需時(shí)間較長(zhǎng)。
[0004] 本發(fā)明優(yōu)化了各個(gè)處理液的配方，且在不影響檢測(cè)靈敏度的基礎(chǔ)上大幅縮短了銀 染所需時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一套適用于聚丙烯酰氨凝膠的高效銀染方法。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的方法，通過配制固定液、滲透液和顯色液中主要藥品的不同濃度，對(duì) 聚丙烯酰胺凝膠銀染方法中各個(gè)藥品的最適濃度進(jìn)行了探討和改良。并經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)， 摸索出了在不影響染色質(zhì)量的情況下三種處理液的較短處理時(shí)間，顯著提高了實(shí)驗(yàn)效率。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的適用于聚丙烯酰氨凝膠的銀染方法包括以下步驟：
[0008] 1)聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)束后，取下凝膠，浸泡在固定液中，處理2分鐘，所述固 定液的配方為：1〇%體積比乙醇；1. 0%體積比乙酸；
[0009]2)隨后取出凝膠，迅速放至水中，清洗20秒；把凝膠取出放入0? 2wt%，AgNCV滲 透液中處理3分鐘，取出凝膠，迅速放至水中，清洗20秒；
[0010] 3)把凝膠放進(jìn)顯色液中，2分鐘即可顯色，所述顯色液配方為2wt%NaOH; 20mL37v%HCOH/L;0? 0175wt%。Na2S203。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，所述方法包括以下步驟：
[0012] 1)棉花基因組DNA的提取
[0013] 把棉花種子浸泡于溫水中過夜，隨后沙培于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)一周左右至新鮮 葉片展開，選取鮮嫩葉片〇.5g在液氮中迅速碾磨至微白粉末，提取方法按照高含量酚的 CTAB法，并稍作改進(jìn)。提取的DNA濃度和質(zhì)量分別用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光 光度計(jì)測(cè)定。把DNA原液稀釋至適宜濃度后放至-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0014] 2) PCR擴(kuò)增反應(yīng)和聚丙烯酰氨凝膠電泳
[0015]PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性2min;94°C變性40s，55°C退火45s(不同引物退火溫 度有稍微區(qū)別），72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。
[0016] 8%的聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測(cè)：采用BIO - RAD公司的PowerlOOO型電泳儀， PROTEANIIXICell電泳槽裝置。在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入0.5倍體積的上樣緩沖液，采用8% 的聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)產(chǎn)物。
[0017] 3)聚丙烯酰胺凝膠的銀染
[0018] 聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)束后，取下凝膠，浸泡在固定液（10%Ethanol;1.0% Aceticacid)中，處理2分鐘，當(dāng)固定液中含有乙醇時(shí)，條帶與凝膠的對(duì)比度有少量改善， 條帶更加明顯（圖1)，乙酸含量的稍微改變對(duì)凝膠顯色結(jié)果影響微乎其微；隨后取出凝膠， 迅速放至水中，清洗20秒；把凝膠取出放入滲透液（0. 2%AgN03)中處理2分鐘，當(dāng)銀離子 濃度為〇. 2%時(shí)，滲透處理2-3min即可達(dá)到較好的效果，銀離子濃度減低時(shí)需適當(dāng)加長(zhǎng)滲 透時(shí)間，當(dāng)銀離子濃度達(dá)到0. 3%或更高時(shí)，凝膠整體背景變深（圖2);取出凝膠，迅速放至 水中，清洗20秒；最后，把凝膠放進(jìn)顯色液（2%NaOH;20mL37%HC0H/L;0. 0175°/4Na2S203) 中，3分鐘即可顯色，顯色結(jié)果理想。當(dāng)氫氧化鈉濃度小于1%時(shí)，凝膠底色開始明顯加重， 條帶與底色的對(duì)比度降低，且隨著氫氧化鈉濃度的降低，這種現(xiàn)象越嚴(yán)重。較高的氫氧化鈉 濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響不是很大。甲醛（37%)的濃度過低時(shí)會(huì)導(dǎo)致條帶不明顯，處理時(shí) 間加長(zhǎng)，且會(huì)導(dǎo)致凝膠背景變暗紅，當(dāng)濃度大于15mL37%HC0H/L時(shí)，顯色效果理想，在120 轉(zhuǎn)/分鐘的晃動(dòng)下3min中即可得到很好的顯色結(jié)果（圖3)。所有處理過程都在120轉(zhuǎn)/ 分鐘的搖床上處理。處理中晃動(dòng)頻率的降低會(huì)延緩實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
[0019] 理想的銀染技術(shù)應(yīng)具備分辨率高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單快捷等特征。通過該銀染方 法來處理聚丙烯酰胺凝膠，條帶顯色良好，小片段條帶清晰，條帶與凝膠背景對(duì)比度好。本 發(fā)明的銀染過程可在10分鐘內(nèi)完成，幾乎是已報(bào)到的銀染方法中需時(shí)最少的，顯著提高了 實(shí)驗(yàn)的效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1顯示固定液中不同乙醇濃度對(duì)凝膠的顯色影響。A:乙醇的濃度為10%;B:無 乙醇；
[0021] 圖2顯示滲透液中不同硝酸銀濃度對(duì)凝膠的顯色影響。A :AgN〇j^濃度為0.3%; B:AgN〇j^濃度為0.05% ;
[0022] 圖3顯示顯色液中不同濃度的甲醛、氫氧化鈉對(duì)凝膠的顯色影響。A:甲醛（37%) 的濃度為〇. 5%;B:甲醛（37% )的濃度為2%;C:NaOH的濃度為0. 5%;D:NaOH的濃度為 2% ；
[0023] 圖4不同染色方法銀染聚丙烯酰胺凝膠的顯色結(jié)果，其中，A是通過本發(fā)明的方法 銀染聚丙烯酰胺凝膠的顯色結(jié)果；B是通過陳浩東等（2013)所使用的銀染方法銀染聚丙烯 氨酰胺凝膠的顯色結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】[0024] 實(shí)施例1
[0025] 1)實(shí)驗(yàn)材料
[0026] 實(shí)驗(yàn)材料為陸地棉（Gossypium.hirsutum)栽培種中棉所12和四倍體野生種 達(dá)爾文氏棉（G.darwinii)F2群體，來源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研宄所。SSR引物序列為 swul9357〇
[0027] 2)棉花基因組DNA的提取
[0028] 把棉花種子浸泡于溫水中過夜，隨后沙培于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)一周左右至新鮮 葉片展開，選取鮮嫩葉片〇. 5g在液氮中迅速碾磨至微白粉末，提取方法按照高含量酚的 CTAB法，并稍作改進(jìn)。提取的DNA濃度和質(zhì)量分別用0. 8 %的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光 光度計(jì)測(cè)定。把DNA原液稀釋至適宜濃度后放至-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0029] 3) PCR擴(kuò)增反應(yīng)和聚丙烯酰氨凝膠電泳
[0030] PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性2min ;94°C變性40s，55°C退火45s(不同引物退火溫 度有稍微區(qū)別），72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min，4°C保存。
[0031] 8%的聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測(cè)：采用810-狀0公司的？〇?61'1000型電泳儀， PROTEANIIXICell電泳槽裝置。在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入0.5倍體積的上樣緩沖液，采用8% 的聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)產(chǎn)物。
[0032] 4)聚丙烯酰胺凝膠的銀染
[0033] 聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)束后，取下凝膠，浸泡在固定液（10%Ethanol;1.0% Aceticacid)中，處理2分鐘；隨后取出凝膠，迅速放至水中，清洗20秒；把凝膠取出放入 滲透液（0. 2%AgN03)中處理2 - 3分鐘；取出凝膠，迅速放至水中，清洗20秒；最后，把凝 膠放進(jìn)顯色液（2%NaOH;20mL37%HC0H/L;0. 0175°/4Na2S203)中，3分鐘即可顯色，顯色結(jié) 果理想。所有處理過程都在120轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上處理。
[0034] 結(jié)果參見附圖1，可看出，用本發(fā)明的方法銀染聚丙烯酰胺凝膠，顯色結(jié)果理想，條 帶清晰。與利用陳浩東等（2013)的方法得到的結(jié)果無明顯差異，然而本方法的所需時(shí)間僅 是其的1/3。利用本方法染色可明顯提高實(shí)驗(yàn)效率。
[0035] 然而傳統(tǒng)的銀染方法往往藥品配置復(fù)雜、過程繁瑣、所需時(shí)間較長(zhǎng)（表1)，本發(fā)明 的方法與現(xiàn)有方法的對(duì)比如以下表1所示。。
[0036] 表1不同銀染方法的比較
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 一種適用于聚丙烯酰氨凝膠的銀染方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 1) 聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)束后，取下凝膠，浸泡在固定液中，處理2分鐘，所述固定液 的配方為：10% Ethanol ;1. 0% Acetic acid ; 2) 隨后取出凝膠，迅速放至水中，清洗20秒；把凝膠取出放入0. 2 % AgNCV滲透液中處 理3分鐘，取出凝膠，迅速放至水中，清洗20秒； 3) 把凝膠放進(jìn)顯色液中，2分鐘即可顯色，所述顯色液配方為2% Na0H;20mL 37% HC0H/L ;0? 0175%。Na2S203。
【文檔編號(hào)】G01N1/30GK104458388SQ201410727628
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月1日
【發(fā)明者】崔興雷, 孟菲, 蔡小彥, 劉方, 周忠麗, 王星星, 王春英, 王玉紅, 王坤波 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所