一種高效制備環(huán)黃芪醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥化工領(lǐng)域，具體來說是一種高效制備環(huán)黃芪醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)黃芪醇(CAG)為一種來源于中藥黃芪的四環(huán)三萜類中環(huán)阿屯烷型化合物，分子式為C30H5005，相對分子量為490.71。環(huán)黃芪醇通過對端粒酶的激活作用可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，從而能夠推遲細(xì)胞的老化。而目前市場上CAG作為一種有效的創(chuàng)傷修復(fù)藥和唯一具有激活端粒酶起到抗衰老作用的保健品原料在運(yùn)用。在抗衰老產(chǎn)品市場有不可替代的作用，具有廣闊的市場前景。
[0003]黃芪中分離鑒定的皂苷有近20個(gè)，大多數(shù)為環(huán)阿屯烷型四環(huán)三萜皂苷，多數(shù)皂苷的苷元為環(huán)黃芪醇CAG，連接的糖主要有葡萄糖、木糖、鼠李糖，而藥材中天然游離的CAG含量較低，直接從藥材中提取純化CAG的成本較高，所以目前國內(nèi)的生產(chǎn)工藝均是以高含量的黃芪皂苷為原料，利用各種方法打開糖苷鍵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)環(huán)黃芪醇，一般的水解方法會(huì)生成大量的副產(chǎn)物黃芪醇，且由于兩者結(jié)構(gòu)相近，在使用HPLC進(jìn)行含量測定時(shí)不易將兩者分開，從而導(dǎo)致測定值比實(shí)際值偏高。β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶分別是專一性對葡萄糖、木糖糖苷鍵的水解酶類，柚苷酶由鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶組成，可以同時(shí)水解鼠李糖和葡萄糖苷鍵，因?yàn)槊附鈼l件溫和、專一性強(qiáng)，效率高，這三種水解酶被廣泛用于碳苷類化合物的水解生產(chǎn)工藝。
[0004]目前國內(nèi)對環(huán)黃芪醇的生產(chǎn)方法的相關(guān)報(bào)道較少，中國發(fā)明專利CN103880910A通過氧化、還原、水解、萃取等步驟純化制取環(huán)黃芪醇，該方法步驟繁瑣，轉(zhuǎn)化率低，雜質(zhì)太多；中國發(fā)明專利CN10481761OA利用硫酸對中藥黃芪粗提物黃芪甲醇進(jìn)行水解，在一定水解條件下實(shí)現(xiàn)黃芪甲醇向環(huán)黃芪醇的轉(zhuǎn)化，該方法雖然步驟簡單，但是轉(zhuǎn)化效率很低，并且生產(chǎn)條件要求苛刻，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中環(huán)黃芪醇轉(zhuǎn)化效率偏低的缺陷，提供一種高效制備環(huán)黃芪醇的方法來解決上述問題。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種高效制備環(huán)黃芪醇的方法，依次包括以下步驟:
A.發(fā)酵:將黃芪總皂苷裝入發(fā)酵罐，注入含有復(fù)合酶的緩沖液至樣品完全被浸沒，攪拌后進(jìn)行催化發(fā)酵；
B.調(diào)堿:催化結(jié)束后，將步驟A中得到的發(fā)酵液調(diào)成堿性溶液，靜置I小時(shí)；
C.逆流萃取:將步驟B中得到的發(fā)酵液與萃取劑栗入逆流萃取塔進(jìn)行萃取；
D.將萃取得到的環(huán)黃芪醇與萃取劑的混合液真空濃縮。
[0007]優(yōu)選地，所述步驟A中的黃芪總皂苷純度為60%_100%。
[0008]優(yōu)選地，所述步驟A中的復(fù)合酶為β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、柚苷酶的混合物。
[0009]優(yōu)選地，所述β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量百分比為40%_60%，所述β-木糖苷酶的質(zhì)量百分比為10%-20% ；所述柚苷酶的質(zhì)量百分比為20%-50%。
[0010]優(yōu)選地，所述催化發(fā)酵在35°C-60°C、pH值為4.0-6.0的條件下進(jìn)行4_6h。
[0011]優(yōu)選地，所述步驟B中堿性溶液pH值為8.0-10.0。
[0012]優(yōu)選地，所述步驟B使用氫氧化鈉或氫氧化鉀或兩者的混合液做為調(diào)堿試劑。
[0013]優(yōu)選地，所述步驟C中的萃取劑為二氯甲烷。
[0014]優(yōu)選地，所述步驟C中的發(fā)酵液與萃取劑的流速比為1:2-1:6，萃取溫度為20°C-30-C。
[0015]優(yōu)選地，所述步驟D真空濃縮的干燥溫度為20°C-30°C。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:(I)復(fù)合酶發(fā)酵技術(shù)結(jié)合連續(xù)逆流萃取技術(shù)提取純化得到高純度環(huán)黃芪醇，轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品純度較高；(2)傳統(tǒng)的提取純化工藝需要I天，本發(fā)明整個(gè)工藝完成時(shí)間不超過8個(gè)小時(shí)，操作過程中溫度低，保證了環(huán)黃芪醇的生物活性，提高了生產(chǎn)效率，降低了能耗，生產(chǎn)成本降低50%以上，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]為使對本發(fā)明的結(jié)構(gòu)特征及所達(dá)成的功效有更進(jìn)一步的了解與認(rèn)識，用以較佳的實(shí)施例說明，說明如下:
實(shí)施例1
一種高效制備環(huán)黃芪醇的方法為:
(I)發(fā)酵:將100%的黃芪總皂苷100克裝入發(fā)酵罐，注入含有5克復(fù)合酶的緩沖液至樣品完全被浸沒，進(jìn)行催化發(fā)酵;所述酶解所用混合酶制劑中葡萄糖苷酶為60%;β_木糖苷酶20% ；柚苷酶20% ；所述酶解時(shí)間為6h，溫度為35 °C，pH為4.0。
[0018](2)調(diào)堿:催化結(jié)束后，將步驟(I)中得到的發(fā)酵液用氫氧化鈉調(diào)至pH值為8.0，靜置lh。
[0019](3)逆流萃取:將步驟(2)中得到的發(fā)酵液和萃取劑二氯甲烷栗入逆流萃取塔進(jìn)行萃取，發(fā)酵液和萃取劑的流速之比為1:2，萃取溫度20°C。
[0020](4)將步驟(3)中萃取得到的環(huán)黃芪醇與萃取劑的混合液20°C真空濃縮干燥。
[0021 ] 經(jīng)檢測本實(shí)施例可得到純度91.2%的環(huán)黃芪醇，轉(zhuǎn)化率86.1%。
[0022]實(shí)施例2
(1)發(fā)酵:將60%的黃芪總皂苷100克裝入發(fā)酵罐，注入含有0.5克復(fù)合酶的緩沖液至樣品完全被浸沒，進(jìn)行催化發(fā)酵;所述酶解所用混合酶制劑中β-葡萄糖苷酶為40%;β-木糖苷酶10% ；柚苷酶50% ；所述酶解時(shí)間為4h，溫度為60 0C，pH為6.0 ；
(2)調(diào)堿:催化結(jié)束后，將步驟(I)中得到的發(fā)酵液用氫氧化鉀調(diào)至ρΗΙΟ.Ο，靜置lh。
[0023](3)逆流萃取:將步驟(2)中得到的發(fā)酵液和萃取劑二氯甲烷栗入逆流萃取塔進(jìn)行萃取，發(fā)酵液和萃取劑的流速之比為1:6，萃取溫度30°C
(4)將步驟(3)中萃取得到的環(huán)黃芪醇與萃取劑的混合液30°C真空濃縮干燥。
[0024]經(jīng)檢測本實(shí)施例可得到純度92.4%的環(huán)黃芪醇，轉(zhuǎn)化率87.3%。
[0025]實(shí)施例3
一種高效制備環(huán)黃芪醇的方法為: (1)發(fā)酵:將80%的黃芪總皂苷I千克裝入發(fā)酵罐，注入含有25克復(fù)合酶的緩沖液至樣品完全被浸沒，進(jìn)行催化發(fā)酵;所述酶解所用混合酶制劑中葡萄糖苷酶為50%;β-木糖苷酶20% ；柚苷酶30% ；所述酶解時(shí)間為5h，溫度為50 0C，pH為5.0 ；
(2)調(diào)堿:催化結(jié)束后，將步驟(I)中得到的發(fā)酵液用氫氧化鈉調(diào)至pH9.0，靜置lh。
[0026](3)逆流萃取:將步驟(2)中得到的發(fā)酵液和萃取劑二氯甲烷栗入逆流萃取塔進(jìn)行萃取，發(fā)酵液和萃取劑的流速之比為1:4，萃取溫度25°C
(4)將步驟(3)中萃取得到的環(huán)黃芪醇與萃取劑的混合液25°C真空濃縮干燥。
[0027]經(jīng)檢測本實(shí)施例可得到純度91.7%的環(huán)黃芪醇，轉(zhuǎn)化率86.3%。
[0028]實(shí)施例4
一種高效制備環(huán)黃芪醇的方法為:
(1)發(fā)酵:將85%的黃芪總皂苷I千克裝入發(fā)酵罐，注入含有35克復(fù)合酶的緩沖液至樣品完全被浸沒，進(jìn)行催化發(fā)酵;所述酶解所用混合酶制劑中葡萄糖苷酶為40%;β-木糖苷酶10% ；柚苷酶50% ；所述酶解時(shí)間為6h，溫度為50 0C，pH為5.0 ；
(2)調(diào)堿:催化結(jié)束后，將步驟(I)中得到的發(fā)酵液用氫氧化鈉和氫氧化鉀混合物調(diào)至pH9.0，靜置 lh。
[0029](3)逆流萃取:將步驟(2)中得到的發(fā)酵液和萃取劑二氯甲烷栗入逆流萃取塔進(jìn)行萃取，發(fā)酵液和萃取劑的流速之比為1:5，萃取溫度30°C。
[0030](4)將步驟(3)中萃取得到的環(huán)黃芪醇與萃取劑的混合液20°C真空濃縮干燥。
[0031]將得到的環(huán)黃芪醇樣品用高壓液相色譜儀檢測純度，色譜條件:色譜柱為分析柱Shim-pack VP-ODS C18 ( Φ 250mmX4.6mm，5ym;);柱溫3CTC ;流動(dòng)相:0min?13min甲醇:水=75:25，13min?20min甲醇:水=85:15，20min?30min甲醇 100%;流速:1 mL/min;上樣量為20 yL，ELSD 漂移管溫度 80°C，ELSD 氣流量 2.1 L/min。
[0032]經(jīng)檢測本實(shí)施例可得到純度92.3%的環(huán)黃芪醇，轉(zhuǎn)化率85.7%。
[0033]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高效制備環(huán)黃芪醇的方法，其特征在于，依次包括以下步驟: A.發(fā)酵:將黃芪總皂苷裝入發(fā)酵罐，注入含有復(fù)合酶的緩沖液至樣品完全被浸沒，攪拌后進(jìn)行催化發(fā)酵； B.調(diào)堿:催化結(jié)束后，將步驟A中得到的發(fā)酵液調(diào)成堿性溶液，靜置I小時(shí)； C.逆流萃取:將步驟B中得到的發(fā)酵液與萃取劑栗入逆流萃取塔進(jìn)行萃??； D.將萃取得到的環(huán)黃芪醇與萃取劑的混合液真空濃縮。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效制備環(huán)黃芪醇的方法，其特征在于，所述步驟A中的黃芪總皂苷純度為60%-100%。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效制備環(huán)黃芪醇的方法，其特征在于，所述步驟A中的復(fù)合酶為葡萄糖苷酶、木糖苷酶、柚苷酶的混合物。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效制備環(huán)黃芪醇的方法，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶的質(zhì)量百分比為40%-60%，所述β-木糖苷酶的質(zhì)量百分比為10%-20% ；所述柚苷酶的質(zhì)量百分比為 20%-50%。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效制備環(huán)黃芪醇的方法，其特征在于，所述催化發(fā)酵在350C-600C、pH值為4.0-6.0的條件下進(jìn)行4-6h。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效制備環(huán)黃芪醇的方法，其特征在于，所述步驟B中堿性溶液 pH 值為 8.0-10.0。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效制備環(huán)黃芪醇的方法，其特征在于，所述步驟B使用氫氧化鈉或氫氧化鉀或兩者的混合液做為調(diào)堿試劑。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效制備環(huán)黃芪醇的方法，其特征在于，所述步驟C中的萃取劑為二氯甲烷。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效制備環(huán)黃芪醇的方法，其特征在于，所述步驟C中的發(fā)酵液與萃取劑的流速比為1:2-1: 6，萃取溫度為20°C-30°C。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效制備環(huán)黃芪醇的方法，其特征在于，所述步驟D真空濃縮的干燥溫度為20°C_30°C。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種高效制備環(huán)黃芪醇的方法，依次包括以下步驟：A.發(fā)酵：將黃芪總皂苷裝入發(fā)酵罐，注入含有復(fù)合酶的緩沖液至樣品完全被浸沒，攪拌后進(jìn)行催化發(fā)酵；B.調(diào)堿：催化結(jié)束后，將步驟A中得到的發(fā)酵液調(diào)成堿性溶液，靜置1小時(shí)；C.逆流萃?。簩⒉襟EB中得到的發(fā)酵液與萃取劑泵入逆流萃取塔進(jìn)行萃??；D.將萃取得到的環(huán)黃芪醇與萃取劑的混合液真空濃縮。本發(fā)明的有益效果為：（1）復(fù)合酶發(fā)酵技術(shù)結(jié)合連續(xù)逆流萃取技術(shù)提取純化得到高純度環(huán)黃芪醇，轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品純度較高；（2）本發(fā)明整個(gè)工藝完成時(shí)間不超過8個(gè)小時(shí)，操作過程中溫度低，保證了環(huán)黃芪醇的生物活性，提高了生產(chǎn)效率，降低了能耗，生產(chǎn)成本降低50%以上。
【IPC分類】C12P33/20, C07J53/00
【公開號】CN105566434
【申請?zhí)枴緾N201510929020
【發(fā)明人】王亞, 儲(chǔ)浩俠, 劉玉, 周偉, 王佳麗, 周雨晴
【申請人】安徽誠亞生物科技有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月15日