檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），包括：山藥塊莖鮮樣經(jīng)冷凍干燥機(jī)脫水凍干，粉碎后加入溶劑提取，獲得粗提取液經(jīng)濃縮干燥，磷酸鹽緩沖液復(fù)溶，置于–40℃下冷凍，解凍后離心去雜質(zhì)；進(jìn)行乙酸乙酯萃取3次，收集酯相；再調(diào)水相pH為2.8～3.5，乙酸乙酯再萃取3次，收集合并酯相，濃縮蒸干后甲醇復(fù)溶，得到檢測(cè)樣品；采用UPLC-MS/MS對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行分析。本方法前處理過程快速簡(jiǎn)便，激素提取回收率高，UPLC-MS/MS法檢測(cè)限低，精度高，線性關(guān)系良好，可以同時(shí)有效提取和定量檢測(cè)山藥塊莖中的含量甚微的五大類激素中的7種激素。
【專利說明】檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

【背景技術(shù)】
[0002] 山藥是傳統(tǒng)的藥食兼用植物，為薯蕷科植物的塊莖，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、補(bǔ)肺養(yǎng)腎的功 效。深入研究山藥塊莖，可為山藥的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。
[0003] 植物內(nèi)源激素是植物體內(nèi)天然合成的有機(jī)化合物，在生長(zhǎng)、發(fā)育以及對(duì)環(huán)境的應(yīng) 答等過程中均起著重要的調(diào)控作用，其中赤霉素類（GAs)、細(xì)胞分裂素類（如ZT)、生長(zhǎng)素 (如IAA)、脫落酸（ΑΒΑ)、茉莉酸（JA)是植物體內(nèi)非常重要的四大類內(nèi)源激素。研究表明， 植物激素在調(diào)控貯藏器官的形成與生長(zhǎng)中起著重要的作用，且越來越多的研究表明這種作 用并不是單一激素作用的結(jié)果，而是多種激素之間相互作用的結(jié)果，因此，同時(shí)分析不同種 類植物激素對(duì)研究它們?cè)谏剿帀K莖的生長(zhǎng)發(fā)育過程中相互調(diào)控作用機(jī)制有著非常重要的 意義。然而，內(nèi)源激素在植物體內(nèi)含量甚微，通常只有普通植物次生代謝產(chǎn)物的萬分之一甚 至更低，在0. 1?50ng · g4鮮重范圍內(nèi)，而且有些內(nèi)源激素的性質(zhì)不穩(wěn)定，如生長(zhǎng)素類植 物激素容易氧化或見光易分解，赤霉素類不耐高溫等。同時(shí)，植物提取物又是復(fù)雜的多組分 混合物，其所含的次生代謝產(chǎn)物會(huì)對(duì)植物激素的定性和定量分析產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾，因此，為 鑒別和定量檢測(cè)植物激素，必需建立和優(yōu)化植物激素的提取和純化流程。目前，植物激素前 處理的純化過程中，常使用活性炭、PVP或PVPP吸附酚類雜質(zhì)和色素，但由于它們對(duì)激素本 身也有較強(qiáng)的吸附作用，所以在激素提取過程中不宜采用。另外，使用得較多的是純化方法 是過各種固相萃?。⊿PE)小柱以去除脂類和色素類雜質(zhì)，這種前處理方法不但成本高，而 且因?yàn)椴煌N類激素的極性、酸堿電離度等性質(zhì)存在差異，純化不同類別激素需要不同類 型的柱子，不僅無法實(shí)現(xiàn)多類激素的同時(shí)分析，還使激素純化過程步驟繁鎖、費(fèi)時(shí)；同時(shí)導(dǎo) 致激素在提取的過程中損失大，回收率低。山藥塊莖中富含淀粉、蛋白質(zhì)、糖類、黏液質(zhì)、月旨 肪、多酚、色素、皂甙類、尿囊素、山藥素、膽堿、多胺等多種成分，激素粗提物中含有大量的 脂類、多糖、多酚、甙類、蛋白質(zhì)、核酸等，利用SPE小柱純化山藥內(nèi)源激素的效果不理想。目 前，對(duì)山藥塊莖內(nèi)源激素的測(cè)定分析報(bào)道很少，而且只偏向于檢測(cè)某類激素，同時(shí)提取和檢 測(cè)山藥塊莖中多類激素的研究沒見報(bào)道。
[0004] 在對(duì)植物激素進(jìn)行定量分析方面，一些現(xiàn)代分析測(cè)試技術(shù)已用于測(cè)定單種或多 種激素，包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)、液相色譜法（HPLC)、氣相色譜法（GC)、毛細(xì)管電泳 法（CE)、氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS)等方法。但這些方法對(duì)植物內(nèi)源激素的準(zhǔn)確定性和定量均 存在某些方面不足，如酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)不能同時(shí)對(duì)多種植物激素進(jìn)行定量分析， 并且具有不可避免的交叉反應(yīng)，分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性較差；色譜法僅根據(jù)保留時(shí)間 定性，在復(fù)雜植物提取物中可能因?yàn)椴煌镔|(zhì)保留時(shí)間相同或相近而給出錯(cuò)誤的結(jié)論，且 紫外和熒光檢測(cè)器不能滿足超低含量植物激素定性定量分析的要求；毛細(xì)管電泳法重現(xiàn)性 差；質(zhì)譜法是目前最可靠的植物內(nèi)源激素檢測(cè)方法，但GC-MS法需要復(fù)雜的衍生化處理以 提高待測(cè)物的揮發(fā)性和靈敏度，操作繁鎖，而且在氣相入口處溫度較高會(huì)導(dǎo)致一些熱不穩(wěn) 定化合物的降解，這些問題限制了 GC-MS法的應(yīng)用。與上述方法相比，超高效液相色譜串聯(lián) 質(zhì)譜（UPLC-MS/MS)具有更強(qiáng)的定性定量能力，原因是超高效液相色譜（UPLC)使用更小粒 徑（1.7 μ m)填料的色譜柱進(jìn)行分離，具有更強(qiáng)的分離能力和更快的分析速度，UPLC與串 聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS)的完美結(jié)合極大提高了儀器的工作效率，它結(jié)合保留時(shí)間和母離子/子離 子對(duì)植物樣品中的目標(biāo)物進(jìn)行準(zhǔn)確、靈敏地定性與定量，在很大程度上克服了傳統(tǒng)色譜技 術(shù)在植物激素定性和定量分析方面的不足。因此，尋找一種有效、快速的山藥塊莖內(nèi)源激素 的提取方法以及一種靈敏、高效的多種內(nèi)源激素同時(shí)檢測(cè)的方法是開展山藥塊莖植物內(nèi)源 激素相關(guān)研究的關(guān)鍵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的為實(shí)現(xiàn)山藥塊莖中7種內(nèi)源激素同時(shí)定性和定量分析，提供一種山 藥塊莖樣品前處理操作過程簡(jiǎn)單，成本低，激素回收率高，UPLC-MS/MS法檢測(cè)速度快，靈敏 度高，檢測(cè)限低，精確度高，線性關(guān)系好的快速檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的方法
[0006] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特征在于：包括 以下步驟：
[0008] (1)粗提：山藥塊莖鮮樣經(jīng)冷凍干燥機(jī)脫水凍干，粉碎后加入溶劑提取，離心后獲 得上清液，再加入溶劑重復(fù)提取2次，合并內(nèi)源激素的粗提取液，并濃縮干燥；
[0009] (2)純化：采用pH8?8. 3濃度為0· 07mol/L的磷酸鹽緩沖液對(duì)步驟（1)中的粗 提取干燥物進(jìn)行超聲復(fù)溶，冷凍離心去雜，得上清液；乙酸乙酯萃取3次，收集酯相；再調(diào)水 相pH為2. 8?3. 5,乙酸乙酯萃取3次，收集合并酯相，濃縮干燥，然后用100%甲醇復(fù)溶， 得到檢測(cè)樣品；
[0010] (3)檢測(cè)：利用超高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行分析，檢測(cè)山藥 塊莖中內(nèi)源激素的種類和含量；
[0011] 其中，所述的溶劑為預(yù)冷的含有2臟〇1/1抗氧化劑2,6-二叔丁基對(duì)甲酚出!11')的 100%甲醇。
[0012] 以上步驟（1)中所述的山藥凍干粉末與溶劑的重量體積比為1:15?20。
[0013] 以上步驟⑴中所述的提取條件為密封避光，劇烈渦旋振蕩后，在0?4°C下，首 次振蕩提取20?24h，隨后的兩次提取振蕩2h。
[0014] 以上步驟⑵中所述的，磷酸鹽緩沖液與山藥凍干粉末的體積質(zhì)量比（ml/g)為 5 ?8:1 ;
[0015] 以上步驟（2)中所述的冷凍離心去雜的方法是將步驟（2)的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶物 放置在-40°C低溫冰箱中l(wèi)h以上，4°C解凍后離心。
[0016] 以上步驟（1)和步驟（2)中所述的離心條件為：4°C，8000?12000rpm，10? 15min〇
[0017] 以上步驟⑴和步驟⑵中所述的濃縮干燥條件為：在38°C恒溫水浴中，旋轉(zhuǎn)減 壓蒸發(fā)至干。
[0018] 以上步驟⑵中所述的乙酸乙酯萃取條件為：向上清液中加1?3倍體積的乙酸 乙酯，在0?4°C下振蕩萃取30?60min。
[0019] 以上步驟⑵中所述的調(diào)水相pH所用的試劑為lmol/L稀鹽酸。
[0020] 以上步驟（2)中的所述的復(fù)溶均采用超聲波助溶30?60s。
[0021] 以上步驟（3)中所述的對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行分析在進(jìn)行UPLC-MS/MS分析前，樣品用 0. 22 μ m有機(jī)系濾膜過濾。
[0022] 以上步驟⑶中所述的對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行分析超高效液相色譜的操作為：采用以下 條件，流動(dòng)相A :100%甲醇，流動(dòng)相B :0. 1 %的甲酸水溶液；洗脫的梯度操作條件見表1 ;
[0023] 表1 :洗脫的梯度操作條件表
[0024]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特征在于：本方法 包括以下步驟： (1) 粗提：山藥塊莖鮮樣經(jīng)冷凍干燥機(jī)脫水凍干，粉碎后加入溶劑提取，離心后獲得上 清液，再加入溶劑重復(fù)提取2次，合并內(nèi)源激素的粗提取液，并濃縮干燥； (2) 純化：采用pH8?8. 3、濃度為0. 07mol/L的磷酸鹽緩沖液對(duì)步驟（1)中的粗提取 干燥物進(jìn)行超聲復(fù)溶，冷凍離心去雜，得上清液；乙酸乙酯萃取3次，收集酯相；再調(diào)水相pH 為2.8?3. 5,乙酸乙酯萃取3次，收集合并酯相，濃縮干燥，然后用100%甲醇復(fù)溶，得到檢 測(cè)樣品； (3) 檢測(cè)：利用超高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行分析，檢測(cè)山藥塊莖 中內(nèi)源激素的種類和含量； 其中，所述的溶劑為預(yù)冷的含有2mmol/L抗氧化劑2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT)的100%甲醇。
2. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特 征在于：步驟⑴中所述的山藥凍干粉末與溶劑的重量體積比為1:15?20。
3. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特 征在于：步驟（1)中所述的提取條件為密封避光，劇烈渦旋振蕩后，在0?4°C下，首次振 蕩提取20?24h，隨后的兩次提取振蕩2h。
4. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特 征在于：步驟（2)中所述的，磷酸鹽緩沖液與山藥凍干粉末的體積質(zhì)量比（ml/g)為5? 8:1。
5. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特 征在于：步驟（2)中所述的冷凍離心去雜的方法是將步驟（2)的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶物放置 在-40°C低溫冰箱中Ih以上，4°C解凍后離心。
6. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特 征在于，步驟（1)和步驟（2)中所述的離心條件為：4°C，8000?12000rpm，10?15min。
7. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特 征在于，步驟（1)和步驟（2)中所述的濃縮干燥條件為：在38°C恒溫水浴中，旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā) 至干。
8. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特 征在于：步驟（2)中所述的乙酸乙酯萃取條件為：向上清液中加1?3倍體積的乙酸乙酯， 在0?4°C下振蕩萃取30?60min。
9. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特 征在于：步驟（2)中所述的調(diào)水相pH所用的試劑為lmol/L稀鹽酸。
10. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,其特 征在于：步驟（2)中的所述的復(fù)溶均采用超聲波助溶30?60s。
11. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,其 特征在于：步驟（3)中所述的對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行分析在進(jìn)行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析 前，樣品用〇.22iim有機(jī)系濾膜過濾。
12. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特 征在于：步驟（3)中所述的對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行分析的超高效液相色譜操作為：采用以下條件， 流動(dòng)相A:100%甲醇，流動(dòng)相B:0.1%的甲酸水溶液；洗脫的梯度操作條件見表1; 表1:洗脫的梯度操作條件表
13. 如權(quán)利1所述的檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特征在 于：步驟（3)中所述的內(nèi)源激素為順式反式玉米素混合物、赤霉素類（GA1、GA3、GA4)、3-吲 哚乙酸、脫落酸、茉莉酸。
14. 如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)山藥塊莖內(nèi)源激素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其特 征在于：步驟（3)中所述的質(zhì)譜的操作條件見表2 ; 表2:質(zhì)譜操作條件表

【文檔編號(hào)】G01N30/06GK104267120SQ201410497198
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月20日
【發(fā)明者】龔明霞, 何龍飛 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)