一種直接測定冬蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種簡便、快速、直接準(zhǔn)確測定冬蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽含量的方法。樣品經(jīng)過簡單的前處理后利用高效液相色譜二極管陣列檢測器(HPLC-PDA)進(jìn)行定性與定量分析。該方法運(yùn)用高效液相色譜定量準(zhǔn)確和PDA檢測器光譜分析定性準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，簡單快速、準(zhǔn)確地直接測定冬蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽的含量，為冬蟲夏草產(chǎn)品中保健功效因子的鑒別分析、品質(zhì)評價以及質(zhì)量控制提供了簡便、可靠、易普及的方法。
【專利說明】一種直接測定冬蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽含量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢驗與分析領(lǐng)域，具體為一種采用HPLC-PDA法準(zhǔn)確、快速地測定 冬蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽含量的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲夏草（學(xué)名：0phiocordyceps sinensis)，又名中華蟲草，是中國歷史中傳統(tǒng) 的名貴中藥材，主要產(chǎn)于中國大陸青海、西藏、四川、云南、甘肅和貴州等省及自治區(qū)的高寒 地帶和雪山草原?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明冬蟲夏草具有鎮(zhèn)靜、止咳化痰和抑制腫瘤細(xì)胞生長、增加機(jī) 體對健身防病有著特有免疫的功效，冬蟲夏草多糖肽就是其中的主要功效成分之一。冬蟲 夏草多糖肽是一種糖蛋白，是多糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合體，具有很高的分子量，由雙糖的重復(fù)單 元組成。冬蟲夏草多糖肽具有很強(qiáng)生物活性，初步研究多糖肽能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，具有抗 腫瘤作用和抗氧化作用。但是，目前還未見對冬蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽快速、準(zhǔn)確、 易普及的檢測方法的記載。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種直接測定冬蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽含 量的方法，其采用的技術(shù)方案如下：
[0004] 一種直接測定冬蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽含量的方法，其特征在于：所述方 法包括以下步驟：
[0005] ( -）樣品處理
[0006] 稱取冬蟲夏草產(chǎn)品適量，加水后進(jìn)行水浴提取，待其冷卻后，加水定容成濃度為 5. 00mg/ml的冬蟲夏草產(chǎn)品水溶液，過濾該溶液，取部分濾液加無水乙醇后通過離心機(jī)離 心，然后取沉淀物采用流動相溶解，過有機(jī)濾膜后得樣品溶液備用；
[0007] (二）高效液相色譜儀的測定
[0008] 將步驟（一）所得樣品溶液取適量加入到高效液相色譜儀中進(jìn)行測定，并對測定 結(jié)果進(jìn)行定性分析；
[0009] (三）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
[0010] 精密稱取干燥至恒重的冬蟲夏草多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品〇. 0500g于10ml容量瓶中，用 水溶解并定容，得濃度為5. 00mg/ml的冬蟲夏草多糖肽標(biāo)準(zhǔn)備用液，然后分別取100 μ 1、 200μ 1、300μ 1、400μ 1、500μ 1標(biāo)準(zhǔn)備用液于5ml容量瓶中，加水定容，得到濃度分別為 100. 0 μ g/ml、200. 0 μ g/ml、300. 0 μ g/ml、400. 0 μ g/ml、500. 0 μ g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，將標(biāo) 準(zhǔn)工作液通過高效液相色譜儀進(jìn)行測定，所得數(shù)據(jù)以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立 濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出標(biāo)準(zhǔn)方程。
[0011](四）樣品中冬蟲夏草多糖肽含量的確定
[0012] 根據(jù)濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的線性方程，將步驟（二）中樣品溶液里所測得 的冬蟲夏草多糖肽的峰面積換算為濃度，從而計算出該冬蟲夏草產(chǎn)品中的冬蟲夏草多糖肽 含量。
[0013] 進(jìn)一步地，高效液相色譜儀測定時，液相色譜條件為：色譜柱為Atlantis T3色 譜柱，其規(guī)格為4· 6Χ 250mm、i. cL· 5 μ m，柱溫為35°C，流動相為體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇水 溶液，流速為lml/min，進(jìn)樣量為10μ 1，檢測器為二極管陣列檢測器，掃描波長為190nm- 460nm〇
[0014] 進(jìn)一步地，所述水浴提取的溫度為60°C，時間為30分鐘。
[0015] 進(jìn)一步地，所用離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為9000rpm，離心時間為15分鐘。
[0016] 進(jìn)一步地，所用有機(jī)濾膜為0. 22 μ m有機(jī)濾膜。
[0017] 進(jìn)一步地，所述冬蟲夏草產(chǎn)品包括冬蟲夏草藥材原料和冬蟲夏草保健食品。
[0018] 通過上述技術(shù)方案的實現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)確、簡便、快速、易普及的測定冬 蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽的方法，本發(fā)明通過高效液相色譜二極管陣列檢測器對樣品 進(jìn)行定性與定量分析，前處理簡單便捷，無需繁瑣提取分離等除雜技術(shù)，為冬蟲夏草產(chǎn)品中 冬蟲夏草多糖肽功效因子的鑒別分析、品質(zhì)評價以及質(zhì)量控制提供了有效途徑和可靠方 法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明中冬蟲夏草多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖；
[0020] 圖2為本發(fā)明中冬蟲夏草多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品的光譜圖；
[0021] 圖3為樣品中冬蟲夏草多糖肽的色譜圖；
[0022] 圖4為樣品中冬蟲夏草多糖肽的光譜圖；
[0023] 圖5為冬蟲夏草多糖肽的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做更詳細(xì)的描述。
[0025] 實施例1
[0026] 采用本發(fā)明所提供方法對青海佳兌冬蟲夏草純粉樣品中的冬蟲夏草多糖肽進(jìn)行 測定。
[0027] 1、測定所采用的儀器及藥品有：WaterSe2695型高效液相色譜儀系統(tǒng)， WaterSe2996型二極管陣列檢測器，Empower色譜工作站及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；冬蟲夏草多糖肽 標(biāo)準(zhǔn)品（> 98%，國家菌草工程技術(shù)研究中心）；
[0028] 2、測定步驟如下：
[0029] (一）樣品處理
[0030] 稱取青海佳兌冬蟲夏草純粉樣品0. 25g，加水10ml后于60°C水浴提取30min，待其 冷卻后，加水定容至50ml，使其成為濃度為5. 00mg/ml的蟲夏草產(chǎn)品水溶液，過濾該溶液， 取2ml濾液，加6ml無水乙醇后通過離心機(jī)離心15min，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為9000rpm，然后取沉 淀物采用體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇水溶液進(jìn)行溶解，過0. 22 μ m有機(jī)濾膜后得樣品溶液備用；
[0031] (二）高效液相色譜儀的測定
[0032] 將步驟（一）所得樣品溶液取適量加入到高效液相色譜儀中進(jìn)行測定，所采用的 液相色譜條件為：色譜柱為Atlantis T3色譜柱，其規(guī)格為4. 6 X 250mm、i. d. . 5 μ m，柱溫為 35°C，流動相為體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇水溶液，流速為lml/min，進(jìn)樣量為ΙΟμ 1，檢測器為 二極管陣列檢測器，掃描波長為190nm - 460nm。二級管陣列管檢測器的工作原理是復(fù)色 光通過樣品池被組分選擇性吸收后再進(jìn)入單射器，照射在二極管陣列裝置上使每個納米波 長的光強(qiáng)度轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的電信號強(qiáng)度，即獲得組分的吸收光譜。因此，可以根據(jù)目標(biāo)物的色 譜保留時間（即從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)該組分濃度極大值時的時間）與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時間 比較初步對化合物定性，同時利用目標(biāo)物與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸收光譜比較進(jìn)一步定性。如圖3 所示，樣品溶液中某組分的保留時間為2. 534分鐘，這與圖1中冬蟲夏草多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品的保 留時間2. 601接近，屬于正常的誤差范圍，因此可以確定樣品溶液中的該組分為冬蟲夏草 多糖肽；如圖4所示，在掃描波長190nm -460nm范圍內(nèi)，樣品溶液中某組分的最大吸收波長 為192. 3nm，這與圖2中冬蟲夏草多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長192. 3nm相同，可以進(jìn)一步 確定該組分是冬蟲夏草多糖肽；這樣的雙重定性更為準(zhǔn)確可靠，可以更直接、更迅速地檢測 出樣品中是否含有多糖肽。
[0033] (三）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
[0034] 精密稱取干燥至恒重的冬蟲夏草多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品0. 0500g于10ml容量瓶中，用 水溶解并定容，得濃度為5. 00mg/ml的冬蟲夏草多糖肽標(biāo)準(zhǔn)備用液，然后分別取100 μ 1、 200μ 1、300μ 1、400μ 1、500μ 1標(biāo)準(zhǔn)備用液于5ml容量瓶中，加水定容，得到濃度分別為 100. 0 μ g/ml、200. 0 μ g/ml、300. 0 μ g/ml、400. 0 μ g/ml、500. 0 μ g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，將標(biāo) 準(zhǔn)工作液通過高效液相色譜儀進(jìn)行測定，如圖5,所得數(shù)據(jù)以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐 標(biāo)，建立濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出標(biāo)準(zhǔn)方程：Y = 1. 17e°_°5X+2. 56e°_°4,擬合度R2 = 0. 99996,回收率為96. 3%，檢測限為0. lmg/kg。
[0035] (四）樣品中冬蟲夏草多糖肽含量的確定
[0036] 將步驟（二）中樣品溶液里所測得冬蟲夏草多糖肽的峰面積代人步驟（三）所得 的標(biāo)準(zhǔn)方程，換算成冬蟲夏草多糖肽的濃度，從而計算出青海佳兌冬蟲夏草純粉樣品中冬 蟲夏草多糖肽的含量是16. 8mg/g。
[0037] 以上僅為本發(fā)明的較佳實施實例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修 飾，皆應(yīng)屬于本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1. 一種直接測定冬蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽含量的方法，其特征在于：所述方法 包括以下步驟： (一） 樣品處理 稱取冬蟲夏草產(chǎn)品適量，加水后進(jìn)行水浴提取，待其冷卻后，加水定容成濃度為 5. OOmg/ml的蟲夏草產(chǎn)品水溶液，過濾該溶液，取部分濾液加無水乙醇后通過離心機(jī)離心， 然后取沉淀物采用流動相溶解，過有機(jī)濾膜后得樣品溶液備用； (二） 高效液相色譜儀的測定 將步驟（一）所得樣品溶液取適量加入到高效液相色譜儀中進(jìn)行測定，并對測定結(jié)果 進(jìn)行定性分析； (三） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 精密稱取干燥至恒重的冬蟲夏草多糖肽標(biāo)準(zhǔn)品〇. 0500g于10ml容量瓶中，用水溶解 并定容，得濃度為5. OOmg/ml的冬蟲夏草多糖肽標(biāo)準(zhǔn)備用液，然后分別取100 μ 1、200 μ 1、 300μ 1、400μ 1、500μ 1標(biāo)準(zhǔn)備用液于5ml容量瓶中，加水定容，得到濃度分別為lOO.Oyg/ ml、200. 0 μ g/ml、300· 0 μ g/ml、400· 0 μ g/ml、500· 0 μ g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，將標(biāo)準(zhǔn)工作液通 過高效液相色譜儀進(jìn)行測定，所得數(shù)據(jù)以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立濃度-峰面 積標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出標(biāo)準(zhǔn)方程。 (四） 樣品中冬蟲夏草多糖肽含量的確定 根據(jù)濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的線性方程，將步驟（二）中樣品溶液里所測得的 冬蟲夏草多糖肽的峰面積換算為濃度，從而計算出該冬蟲夏草產(chǎn)品中的冬蟲夏草多糖肽含 量。
2. 如權(quán)利要求1所述一種直接測定冬蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽含量的方法，其特 征在于：高效液相色譜儀測定時，液相色譜條件為：色譜柱為Atlantis T3色譜柱，其規(guī)格 為4.6X250mm、?·(1··5μπι，柱溫為35°C，流動相為體積分?jǐn)?shù)為5%的甲醇水溶液，流速為 lml/min，進(jìn)樣量為10 μ 1，檢測器為二極管陣列檢測器，掃描波長為190nm -460nm。
3. 如權(quán)利要求1所述一種直接測定冬蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽含量的方法，其特 征在于：所述水浴提取的溫度為60°C，時間為30分鐘。
4. 如權(quán)利要求1所述一種直接測定冬蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽含量的方法，其特 征在于：所用離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為9000rpm，離心時間為15分鐘。
5. 如權(quán)利要求1所述一種直接測定冬蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽含量的方法，其特 征在于：所用有機(jī)濾膜為0. 22 μ m有機(jī)濾膜。
6. 如權(quán)利要求1所述一種直接測定冬蟲夏草產(chǎn)品中冬蟲夏草多糖肽含量的方法，其特 征在于：所述冬蟲夏草產(chǎn)品包括冬蟲夏草藥材原料和冬蟲夏草保健食品。
【文檔編號】G01N30/02GK104090038SQ201410320033
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】黃宏南, 吳志仁, 王娟娟 申請人:黃宏南