一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法
【專利摘要】一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，它包括6個(gè)步驟：細(xì)胞的鋪板及培養(yǎng)、病毒的梯度稀釋、病毒沉降劑的添加、病毒的接種及培養(yǎng)、免疫熒光檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)特異熒光孔的數(shù)目，并計(jì)算豬瘟病毒滴度。本發(fā)明為一種可精確評(píng)價(jià)豬瘟兔化弱毒活疫苗效力，且易于推廣應(yīng)用的IFA檢測(cè)方法，能夠?qū)ιa(chǎn)、運(yùn)輸各環(huán)節(jié)中的疫苗及半成品進(jìn)行快速、精確檢測(cè)，從而保證了疫苗的質(zhì)量。與傳統(tǒng)的兔體定型熱反應(yīng)法相比，具有省時(shí)，省力，直觀，準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬瘟(Classical Swine Fever，CSFV)俗稱“爛腸瘟”，在美國稱為豬霍亂，歐洲一些地區(qū)稱為古典豬瘟。本病是由豬瘟病毒引起的一種急性熱性全身性敗血性傳染病,各種年齡豬只均可發(fā)病，有最急性、急性、亞急性、慢性等多種病程，一年四季流行，傳染性極強(qiáng)，具有高發(fā)病率和死亡率。該病一旦發(fā)生，具有毀滅性，嚴(yán)重地威脅養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，影響人民的生活。在豬病中，豬瘟是危害最大、最受重視的一種病，此病被國際獸醫(yī)衛(wèi)生組織法定為必檢的A類16種傳染病之一,在我國被列為一類傳染病。
[0003]我國研制的豬瘟病毒兔化弱毒株(C株)是國際上公認(rèn)的最佳疫苗毒株，已被歐洲很多國家采用，有效的控制了豬瘟的流行。近年來，豬瘟免疫失敗時(shí)有報(bào)道，其原因雖然很多，但疫苗的質(zhì)量是首要考慮的因素。由于豬瘟病毒半衰期比較短，建立可準(zhǔn)確檢測(cè)疫苗半成品及成品效力檢驗(yàn)方法尤為重要。
[0004]目前，豬瘟兔化弱毒活疫苗(豬瘟活疫苗)效力檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法為兔體定型熱反應(yīng)法。由于我國純系大耳白家兔供應(yīng)不足、兔體狀態(tài)差異等原因，該方法的檢測(cè)結(jié)果往往不穩(wěn)定，不準(zhǔn)確，而且在實(shí)際生產(chǎn)過程中往往只按照國家標(biāo)準(zhǔn)(例如:政府采購專用豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)的標(biāo)準(zhǔn)為7500RID/頭份)或企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)(例如:2 X IO4RID/頭份)進(jìn)行一個(gè)稀釋度的檢測(cè)，以評(píng)價(jià)疫苗或半成品是否合格，而不進(jìn)行其他稀釋度的檢測(cè)，即只作定性的判定，而不作準(zhǔn)確定量的檢測(cè)。因此疫苗及其半成品的效力不能被準(zhǔn)確反映，造成病毒接種、疫苗制備等環(huán)節(jié)都存在不確定因素，嚴(yán)重影響了疫苗成品的質(zhì)量。
[0005]據(jù)相關(guān)報(bào)道介紹，豬瘟活疫苗檢測(cè)也可采用新型的檢測(cè)方法，如酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(ELISA)、免疫熒光檢測(cè)法(IFA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)法(Real-time PCR)。
[0006]酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(ELISA)只能評(píng)價(jià)病毒粒子(包括失活病毒)的總量，實(shí)際病毒存活量往往與檢測(cè)結(jié)果大相徑庭，在實(shí)際應(yīng)用中這種方法只能作為參考。
[0007]現(xiàn)有的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法和普通的PCR檢測(cè)方法設(shè)計(jì)的引物并不能有效區(qū)分失活的病毒粒子和活病毒粒子，通常檢測(cè)的是總RNA (包括失活病毒RNA及RNA片段)，假陽性檢測(cè)結(jié)果偏多，只在檢測(cè)新鮮毒液時(shí)才具有一定的參考意義，因此并沒有受到廣泛的認(rèn)可。
[0008]豬瘟病毒兔化弱毒株(C株)對(duì)目前常用已知的適應(yīng)性原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞系不具有致病變作用，無法應(yīng)用細(xì)胞病變孔數(shù)對(duì)病毒進(jìn)行滴度(半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量，TCID50)檢測(cè)。免疫熒光法(IFA)通過熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)受病毒感染的細(xì)胞,是檢測(cè)豬痕病毒滴度較為適宜的方法。目前，由于受到以下多種因素的制約，如豬瘟病毒兔化弱毒株(C株)對(duì)普通適應(yīng)性細(xì)胞感染率低、半衰期短、增殖速度慢、病毒滴度低、敏感細(xì)胞系的壟斷和抗體特異性差，現(xiàn)有的免疫熒光技術(shù)很難對(duì)疫苗質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，僅有極少數(shù)對(duì)豬瘟兔化弱毒高敏感優(yōu)勢(shì)細(xì)胞克隆株作為檢測(cè)細(xì)胞對(duì)病毒滴度進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道，目前IFA方法在國內(nèi)并沒有廣泛應(yīng)用到豬瘟疫苗效力檢測(cè)中，各疫苗生產(chǎn)企業(yè)仍然延用費(fèi)時(shí)費(fèi)力的兔體定型熱反應(yīng)法對(duì)疫苗質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此如何建立一種可精確評(píng)價(jià)豬瘟活疫苗效力、且易于推廣應(yīng)用的IFA檢測(cè)方法，成為亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有免疫熒光檢測(cè)法(IFA)的缺陷，提供一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，它能夠基于普通豬睪丸細(xì)胞(ST)或豬腎細(xì)胞(PK15)，高效、精確評(píng)價(jià)豬瘟活疫苗效力。
[0010]本發(fā)明所述技術(shù)問題是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，包括如下步驟:
(1)細(xì)胞的鋪板及培養(yǎng)
以0.25%的EDTA-胰酶將生長良好的檢測(cè)用細(xì)胞進(jìn)行消化分散，然后以細(xì)胞生長液重懸為細(xì)胞濃度2~4X105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入量100 μ I/孔，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，檢測(cè)用細(xì)胞長滿單層；
(2)病毒的梯度稀釋
在10°C~15°C，用0.01M的磷酸鹽緩沖液(PBS)將豬瘟兔化弱毒活疫苗復(fù)溶，PBS加入量0.1ml/頭份，并用0.01M的 PBS進(jìn)行梯度稀釋；
(3)病毒沉降劑的添加
將無菌的病毒沉降劑聚乙二醇溶液按體積比1:1添加于各檢測(cè)梯度病毒液中，混勻；
(4)病毒的接種及培養(yǎng)
將步驟(3)所述的添加了病毒沉降劑的各檢測(cè)梯度病毒液接種于步驟(1)中的細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入量100 μ I/孔，同時(shí)設(shè)置不接病毒液的細(xì)胞對(duì)照孔，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2~3h ;孵育結(jié)束后，棄掉病毒液，加入細(xì)胞維持液，加入量100 μ I/孔，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h ；
(5)免疫熒光檢測(cè)
培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)細(xì)胞依次進(jìn)行固定、封閉、孵育豬瘟病毒抗體(一抗)、孵育熒光色素(FITC)標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體(二抗)，而后在顯微鏡下進(jìn)行熒光細(xì)胞觀察。
[0011](6)統(tǒng)計(jì)特異熒光細(xì)胞孔的數(shù)目，并計(jì)算豬瘟病毒滴度
特異熒光細(xì)胞孔(陽性孔)的判定標(biāo)準(zhǔn)為，培養(yǎng)孔中有特異熒光細(xì)胞即可；特異熒光細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)為，自然光下觀察應(yīng)為健康細(xì)胞，熒光下觀察具有細(xì)胞形態(tài)。
[0012]上述豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，所述細(xì)胞生長液為含有8%~10%新生牛血清的MEM或DMEM溶液，pH為7.2~?.4 ;細(xì)胞維持液為含2%~3%新生牛血清的MEM或DMEM溶液，PH為7.2~7.4。
[0013]上述豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，步驟(1)中所述的檢測(cè)用細(xì)胞為豬睪丸細(xì)胞(ST)或豬腎細(xì)胞(ΡΚ15)。
[0014]上述豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，步驟(2)中的梯度稀釋采用兩步法，先將豬瘟病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋至10_3或10_4，再將10_3或10_4稀釋度進(jìn)行2倍梯度稀釋，稀釋6~8個(gè)梯度至10_4 8~10_6 4 ;病毒接種細(xì)胞的梯度范圍為2倍梯度稀釋部分。
[0015]上述豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，步驟(3)中所述的病毒沉降劑為將聚乙二醇按照質(zhì)量體積濃度為15%~20%溶于0.01M的磷酸鹽緩沖液，過濾除菌制成；所用聚乙二醇的規(guī)格為PEG400(TPEG20000之一。
[0016]上述豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，步驟(5)中免疫熒光檢測(cè)包括如下步驟:
O培養(yǎng)結(jié)束后，棄盡板孔內(nèi)細(xì)胞維持液，加入固定液，加入量100 μ I/孔，-20°c固定5~IOmin ； 2)棄盡固定液，將細(xì)胞板風(fēng)干；
3)向細(xì)胞板孔中加入質(zhì)量體積濃度1%的牛血清白蛋白溶液進(jìn)行封閉處理，加入量100 μ I/孔，37°C孵育 30~60min ；
4)以0.01M的PBS沖洗，將稀釋后的豬瘟病毒抗體(一抗)添加于細(xì)胞培養(yǎng)板,加入量100 μ I/孔，37°C孵育 30~60min ；
5)棄盡一抗，以0.01M的PBS沖洗，添加稀釋后的熒光色素(FITC)標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體(二抗)，加入量100μ I/孔，37°C孵育30~60min ；
6)棄盡二抗，以0.01M的PBS沖洗，熒光顯微鏡下觀察。
[0017]上述豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，步驟(5)中豬瘟病毒抗體(一抗)的稀釋倍數(shù)為500~700倍；熒光色素(FITC)標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體(二抗)的稀釋倍數(shù)為800~1000倍。
[0018]上述豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，步驟(6)中病毒滴度(TCID5(i/0.1ml)的計(jì)算公式為:
LogTCID50=高于50%陽性孔率最高稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例X稀釋度對(duì)數(shù)之差稀釋度對(duì)數(shù)之差=低于50%陽性孔率最低稀釋度的對(duì)數(shù)-高于50%陽性孔率最高稀釋度的對(duì)數(shù)
距離比例=(高于50%陽性孔率的百分?jǐn)?shù)-50)/ (高于50%陽性孔率的百分?jǐn)?shù)-低于50%陽性孔率的百分?jǐn)?shù))。
[0019]本發(fā)明克服現(xiàn)有免疫熒光檢測(cè)法(IFA)的缺陷，建立一種可精確評(píng)價(jià)豬瘟活疫苗效力，且易于推廣應(yīng)用的IFA檢測(cè)方法。該方法能夠?qū)ιa(chǎn)、運(yùn)輸各環(huán)節(jié)中的疫苗及半成品進(jìn)行快速、精確檢測(cè)，從而保證了疫苗的質(zhì)量。與傳統(tǒng)的兔體定型熱反應(yīng)法相比，具有省時(shí)，省力，直觀，準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
[0020]本發(fā)明所述的病毒沉降劑一聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)具有無毒,無刺激，不揮發(fā)，生理惰性，親水性，溫和性等特性。PGE有兩個(gè)羥基，具有良好的親水性，容易與豬痕病毒粒子結(jié)合。本發(fā)明利用其未水性和聞分子量的特點(diǎn)，將PEG添加于豬痕病毒液中，使豬瘟病毒粒子在短時(shí)間內(nèi)沉降到細(xì)胞表面，快速、高效地感染普通適應(yīng)性細(xì)胞，最大程度地避免了豬瘟病毒在較高溫度(37°C)條件下快速衰亡，同時(shí)提高了豬瘟兔化弱毒對(duì)宿主細(xì)胞豬睪丸細(xì)胞(ST)和豬腎細(xì)胞(PK15)的感染效率，進(jìn)而提高了 IFA法對(duì)豬瘟病毒效力檢測(cè)的精確度和靈敏度；本發(fā)明所述方法不必采用對(duì)豬瘟弱毒高度敏感的克隆化細(xì)胞，普通ST或PK細(xì)胞系即可滿足檢測(cè)需求，避免了復(fù)雜的細(xì)胞克隆工作，打破該領(lǐng)域的技術(shù)壟斷，有利于IFA檢測(cè)方法的推廣使用。[0021]豬瘟病毒的梯度稀釋步驟中，先10倍稀釋再2倍稀釋，用2倍稀釋的檢測(cè)梯度對(duì)病毒滴度進(jìn)行檢測(cè)，比僅僅使用10倍稀釋法具有更高的精確度和準(zhǔn)確度，檢測(cè)結(jié)果可以涵蓋和有效區(qū)分目前豬瘟疫苗生產(chǎn)質(zhì)量要求的各水平質(zhì)量控制點(diǎn)(如:150RID/頭份、750RID/ 頭份、7500RID/ 頭份、I 萬 RID/ml、2 萬 RID/mlUO 萬 RID/ml、20 萬 RID/ml、50 萬RID/ml)，且與兔體定型熱法的檢測(cè)結(jié)果形成了良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
[0022]熒光檢測(cè)步驟中對(duì)特異熒光細(xì)胞的判定標(biāo)準(zhǔn)為具有細(xì)胞形態(tài)的特異熒光細(xì)胞。由于具有細(xì)胞形態(tài)的特異熒光更容易判定，能有效區(qū)分非特異熒光，避免傳統(tǒng)方法中采用胞漿內(nèi)隨機(jī)形態(tài)熒光的不確定性，從而最大限度的消除了人為判定差異。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1添加PEG組的熒光圖；
圖2是本發(fā)明實(shí)施例1不添加PEG組的熒光圖；
圖3是本發(fā)明實(shí)施例1細(xì)胞對(duì)照組熒光圖；
圖4是本發(fā)明實(shí)施例2中_20°C保存組熒光圖；
圖5是本發(fā)明實(shí)施例2中55°C作用Ih組熒光圖；
圖6是本發(fā)明實(shí)施例2中55°C作用2h組熒光圖；
圖7是本發(fā)明實(shí)施例2細(xì)胞對(duì)照組熒光圖；
圖8是本發(fā)明實(shí)施例4的LogTCID5tl與LogRID的關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
`[0024]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)闡述。
[0025]本發(fā)明所用試劑如下:
1、豬瘟病毒抗體(一抗)即豬瘟病毒陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
[0026]2、熒光色素(FITC)標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體(二抗)，購自Sigma公司。
[0027]3、固定液為甲醇與丙酮按體積比(V/V)l:l配制的混合液。丙酮、甲醇為分析純。
[0028]本發(fā)明包括如下步驟:
(I)細(xì)胞的鋪板及培養(yǎng)
以0.25%的EDTA-胰酶將生長良好的檢測(cè)用細(xì)胞進(jìn)行消化分散，然后以細(xì)胞生長液重懸為細(xì)胞濃度為2~4 X IO5個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入量100 μ I/孔，置于37°C，5%C02，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，檢測(cè)用細(xì)胞長滿單層。
[0029]檢測(cè)用細(xì)胞為對(duì)豬瘟病毒適應(yīng)的豬睪丸細(xì)胞(ST)或豬腎細(xì)胞(PK15)。細(xì)胞生長液為含有8%~?Ο%新生牛血清(CBS)的MEM或DMEM溶液，其pH為7.2~?.4。其中新生牛血清(CBS)中不含牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)抗體及抗原。
[0030](2)病毒的梯度稀釋
豬瘟病毒的稀釋應(yīng)在低于15°C的環(huán)境下進(jìn)行，優(yōu)選10°C~15°C。按照豬瘟活疫苗說明書標(biāo)明的劑量，用摩爾濃度為0.01M的磷酸鹽緩沖液(PBS)將豬瘟兔化弱毒活疫苗進(jìn)行復(fù)溶，加入量0.1ml/頭份(即每頭份疫苗以0.1ml PBS復(fù)溶)。取復(fù)溶液0.lml，首先以0.01MPBS進(jìn)行10倍梯度稀釋(基礎(chǔ)梯度)至10_3或10_4 ;然后進(jìn)行2倍梯度稀釋，稀釋6~8個(gè)梯度(檢測(cè)梯度)至10_48~10_64，檢測(cè)梯度的范圍應(yīng)充分包含被檢疫苗病毒滴度的可能值。[0031](3)病毒沉降劑的添加
將無菌的病毒沉降劑一聚乙二醇溶液按體積比(v:v) 1:1添加于各檢測(cè)梯度病毒液中，輕輕混勻。病毒沉降劑為將聚乙二醇按照質(zhì)量體積濃度為15%~20%溶于0.0謹(jǐn)?shù)牧姿猁}緩沖液，過濾除菌制成；聚乙二醇為PEG400(TPEG20000之一。
[0032](4)病毒的接種及培養(yǎng)
將步驟(3)中添加了病毒沉降劑的各檢測(cè)梯度病毒液接種于步驟(1)所述長滿單層的檢測(cè)用細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入量100 μ I/孔，每個(gè)稀釋度接種8孔，同時(shí)設(shè)置不接病毒液的細(xì)胞對(duì)照孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37°C，5%C02，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2~3h。孵育結(jié)束后，棄掉病毒液，加入細(xì)胞維持液，加入量100 μ I/孔，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h。細(xì)胞維持液為含2%~3%新生牛血清(CBS)的MEM或DMEM溶液，其PH為7.2~7.4。新生牛血清(CBS)中不含牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)抗體及抗原。
[0033](5)免疫熒光檢測(cè)
O培養(yǎng)結(jié)束后，棄盡板孔內(nèi)細(xì)胞維持液，加入固定液，加入量100 μ I/孔，-20°c固定5~IOmin0
[0034]2)棄盡固定液，將細(xì)胞板風(fēng)干；
3)向細(xì)胞板孔中加入質(zhì)量體積濃度(m/V) 1%牛血清白蛋白(BSA)溶液進(jìn)行封閉處理，加入量100μ I/孔，37°C孵育30~60min。
[0035]4)以0.01M PBS沖洗3遍，每遍加入量200 μ I/孔。將500-700倍稀釋的豬瘟病毒抗體(一抗)添加于細(xì)胞培養(yǎng)板，加入量100 μ I/孔，37°C孵育30~60min。
[0036]5)棄盡一抗，以0.01M PBS沖洗5遍，每遍加入量200 μ I/孔。添加800~1000倍稀釋的熒光色素(FITC)標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體(二抗)，加入量100 μ I/孔，37°C孵育30~60mino
[0037]6)棄盡二抗，以0.01M PBS沖洗5遍，每遍加入量200 μ I/孔，熒光顯微鏡下觀察。
[0038](6)統(tǒng)計(jì)并計(jì)算病毒滴度
統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)特異熒光孔的數(shù)目，以Reed-Muench法對(duì)豬瘟病毒滴度(TCID5Q/0.lml)進(jìn)行計(jì)算。
[0039]特異熒光細(xì)胞孔(陽性孔)的判定標(biāo)準(zhǔn)為，培養(yǎng)孔中有特異熒光細(xì)胞即可；特異熒光細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)為，自然光下觀察應(yīng)為健康細(xì)胞，熒光下觀察具有細(xì)胞形態(tài)。
[0040]疫苗效價(jià)(病毒滴度，TCID50/0.lml)的計(jì)算公式為:
LogTCID50=高于50%陽性孔率最高稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例X稀釋度對(duì)數(shù)之差稀釋度對(duì)數(shù)之差=低于50%陽性孔率最低稀釋度的對(duì)數(shù)-高于50%陽性孔率最高稀釋度的對(duì)數(shù)
距離比例=(高于50%陽性孔率的百分?jǐn)?shù)-50)/ (高于50%陽性孔率的百分?jǐn)?shù)-低于50%陽性孔率的百分?jǐn)?shù))。
[0041]實(shí)施例1
目的:比較本發(fā)明的病毒接種方法(添加沉降劑)與普通病毒接種方法(不加沉降劑)的差異。
[0042]方法:將一份豬瘟活疫苗病毒液稀釋IO3倍，分為兩份，分別以本發(fā)明的病毒接種方法和普通病毒接種方法接種于兩組檢測(cè)用豬睪丸細(xì)胞(ST細(xì)胞)，培養(yǎng)結(jié)束后，以IFA法進(jìn)行檢測(cè)，分析比較熒光細(xì)胞密度的差異，從而比較出兩種病毒接種方法的優(yōu)劣。
[0043]豬瘟活疫苗(細(xì)胞源):瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，20頭份/瓶，批號(hào)為120202，兔體感染量為7500RID/頭份。
[0044]本實(shí)施例包括以下步驟:
(I)細(xì)胞的鋪板及培養(yǎng)
以0.25%的EDTA-胰酶將生長良好的檢測(cè)用豬睪丸細(xì)胞(ST)進(jìn)行消化分散，然后以細(xì)胞生長液重懸為細(xì)胞濃度為4X IO5個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入量100 μ I/孔，置于37°C，5%C02，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。細(xì)胞生長液為含有8%新生牛血清(CBS)的 MEM 溶液，PH7.2。
[0045](2)病毒的梯度稀釋
在10°C，以2ml 0.0lM的磷酸鹽緩沖液(PBS)將I瓶豬瘟活疫苗進(jìn)行復(fù)溶，取0.1ml復(fù)溶液用0.0lM PBS進(jìn)行10倍梯度稀釋至10_3，取樣兩份，取樣量lml/份，分別標(biāo)記為A、B組。
[0046](3)病毒沉降劑的添加
將Iml病毒沉降劑溶液添加于A組，輕輕混勻；將lml PBS (0.01M)添加于B組，輕輕混勻。病毒沉降劑為無菌的質(zhì)量體積濃度為20%的聚乙二醇8000 (PEG8000)溶液。
[0047](4)病毒的接種及培養(yǎng)
將添加了病毒沉降劑的A組和未添加病毒沉降劑的B組病毒液分別接種于步驟(I)所述長滿單層的ST細(xì)胞，加入量100 μ I/孔，每個(gè)稀釋度接種8孔，同時(shí)設(shè)置不接病毒液的細(xì)胞對(duì)照(記為C組)，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3h ;孵育結(jié)束后，棄掉病毒液，接入細(xì)胞維持液，加入量100 μ I/孔，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72h。細(xì)胞維持液為含有3%新生牛血清(CBS)的MEM溶液，PH7.4。
[0048](5)免疫熒光IFA檢測(cè)
O培養(yǎng)結(jié)束后，棄盡板孔內(nèi)細(xì)胞維持液，加入固定液，加入量100 μ I/孔，-20°c固定IOmin0
[0049]2)棄盡固定液，將細(xì)胞板風(fēng)干；
3)以濃度(m/V) 1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液進(jìn)行封閉處理，100 μ I/孔，37°C孵育60mino
[0050]4)以0.0lM PBS沖洗3遍，200 μ I/孔。將500倍稀釋的豬瘟病毒抗體(一抗)添加于細(xì)胞培養(yǎng)板，加入量100 μ I/孔，370C，孵育60min。
[0051]5)棄盡一抗，以0.0lM PBS沖洗5遍，每遍加入量200 μ I/孔。添加800倍稀釋的熒光色素(FITC)標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體(二抗)，加入量100μ I/孔，37°C孵育60min。
[0052]6)棄盡二抗，以0.01M PBS沖洗5遍，每遍加入量200 μ I/孔，熒光顯微鏡下觀察。
[0053](6)結(jié)果
A組:特異熒光廣泛，病毒感染率較高，如圖1所示；
B組:特異熒光較少，病毒感染率較低，如圖2所示；
C組:無特異突光,如圖3所示。
[0054]試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的接種方法，將病毒沉降劑添加于豬瘟病毒液，而后接種于ST細(xì)胞，顯著提高了特異熒光細(xì)胞數(shù)目。說明在豬瘟弱毒液中添加沉降劑，大大提高了特異熒光細(xì)胞密度，顯著提高了 IFA法對(duì)豬瘟兔化弱毒的檢測(cè)靈敏度，為檢測(cè)方法的建立提供了支持。
[0055]實(shí)施例2
目的:證實(shí)按照本發(fā)明的病毒接種方法，IFA法所檢測(cè)到的特異熒光細(xì)胞數(shù)與活病毒粒子數(shù)的正相關(guān)。
[0056]方法:將同一份豬瘟病毒液分為三份，其中兩份進(jìn)行不同時(shí)長的加熱處理滅活豬瘟弱毒，而后用本發(fā)明的病毒接種方法將兩份病毒分別接種于三組ST細(xì)胞，培養(yǎng)結(jié)束后，以IFA法對(duì)三組細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，分析比較熒光數(shù)的差異，證實(shí)熒光數(shù)是否隨存活病毒數(shù)的減少而減少。
[0057]豬瘟活疫苗(細(xì)胞源):瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，20頭份/瓶，批號(hào)為120806，兔體感染量為20000RID/頭份。
[0058]本實(shí)施例包括以下步驟:
(I)細(xì)胞的鋪板及培養(yǎng)
同實(shí)施例1的步驟(I)。
[0059](2)病毒的梯度稀釋
在溫度12°C，以2ml 0.0lM的磷酸鹽緩沖液(PBS)將I瓶豬瘟活疫苗進(jìn)行復(fù)溶，而后以
0.0lM PBS進(jìn)行IO3倍稀釋，取樣三份，0.5ml/份，分別標(biāo)記為D，E，F(xiàn)組。
[0060](3)病毒的熱處理
將D組病毒液保存于_20°C，E，F(xiàn)組病毒液分別在55°C水浴處理lh，2h。
[0061](4)病毒沉淀劑的添加
分別將0.5ml病毒沉降劑溶液添加于D、E、F三組病毒液，輕輕混勻。病毒沉降劑為無菌的質(zhì)量體積濃度為18%的聚乙二醇10000 (PEG10000)的PBS溶液。
[0062](5)病毒的接種及培養(yǎng)
將步驟(4)中添加了病毒沉降劑的D、E、F三組病毒液分別接種于步驟(I)所述長滿單層的檢測(cè)用細(xì)胞，加入量100 μ I/孔，每個(gè)稀釋度接種8孔，同時(shí)設(shè)置不接病毒液的細(xì)胞對(duì)照組(G組)，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3h ;孵育結(jié)束后，棄掉病毒液，加入細(xì)胞維持液，加入量100 μ I/孔，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h。
[0063](6)免疫熒光檢測(cè)
如實(shí)施例1步驟(5)所述。
[0064](7)結(jié)果
D組(圖4)熒光細(xì)胞數(shù)顯著多于E組(圖5)，F(xiàn)組(圖6)和G組幾乎無特異熒光細(xì)胞。
[0065]結(jié)果顯示，隨著加熱時(shí)間的延長，活病毒粒子數(shù)減少，IFA法檢測(cè)到的特異熒光細(xì)胞逐漸減少；當(dāng)病毒完全滅活后，IFA法檢測(cè)不到特異熒光細(xì)胞。本實(shí)施例說明，按照本發(fā)明的病毒接種方法(添加沉降劑)將豬瘟弱毒接種于ST細(xì)胞后，產(chǎn)生的特異熒光細(xì)胞數(shù)目與體現(xiàn)活疫苗效力的活病毒粒子數(shù)仍呈正相關(guān)關(guān)系。
[0066]實(shí)施例3
目的:本發(fā)明的IFA檢測(cè)方法與普通IFA檢測(cè)方法檢測(cè)敏感度的對(duì)比試驗(yàn)。
[0067]方法:將同一份豬瘟活疫苗樣品，分為兩份，分別以本發(fā)明IFA檢測(cè)方法與普通IFA檢測(cè)方法進(jìn)行病毒滴度檢測(cè)，分析兩種檢測(cè)方法結(jié)果的差異。[0068]豬瘟活疫苗(細(xì)胞源):瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司，20頭份/瓶，批號(hào)為121008，兔體感染量為7500RID/頭份；
本實(shí)施例包括以下步驟:
(I)細(xì)胞的鋪板及培養(yǎng) 如實(shí)施例1步驟(1)所述。
[0069](2)疫苗復(fù)溶
在10°C，以2ml 0.01M PBS將I瓶豬瘟活疫苗進(jìn)行復(fù)溶。
[0070](3)病毒沉降劑的添加、病毒的接種及培養(yǎng) 分別以如下所述兩種方式進(jìn)行處理
本發(fā)明方法:取0.1ml (I頭份)豬瘟活疫苗復(fù)溶樣品以0.01M PBS進(jìn)行10倍梯度稀釋得到lO'lO'lO'lO—U個(gè)基礎(chǔ)稀釋梯度，而后將10_4進(jìn)行2倍梯度稀釋得到1X10—4、
0.5Χ10_4、0.25Χ10_4、0.125Χ10-4、0.625Χ10-5,0.3125Χ 10-5，6 個(gè)檢測(cè)稀釋梯度，將病毒沉降劑PEG8000溶液按體積比1:1加入I X 10_4~0.3125 X 10_5這6個(gè)檢測(cè)稀釋梯度，輕輕混勻，使相應(yīng)的稀釋度變?yōu)?0.5Χ10_4、0.25Χ10_4、0.125X10'(λ 625X10'(λ 3125 X 10-5，
0.15625Χ10_5，稀釋后的病毒液接種于步驟(1)所述長滿單層的檢測(cè)用細(xì)胞，ΙΟΟμΙ/孔，每個(gè)稀釋度接種8孔，同時(shí)設(shè)置不接病毒液的細(xì)胞對(duì)照，37°C，5%C02，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3h ;孵育結(jié)束后，棄掉病毒液，加入細(xì)胞維持液，100 μ I/孔，370C，5%C02，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。
[0071]普通IFA檢測(cè)方法:取0.lml(l頭份)豬瘟活疫苗復(fù)溶樣品以0.01M PBS溶液進(jìn)行10倍梯度稀釋，10' 10_2、10_3、10_4，10_5、10_6共6個(gè)稀釋梯度。將稀釋后的病毒液10—1~10_6共6個(gè)梯度接種于步驟(1)所述長滿單層的檢測(cè)用細(xì)胞，100 μ I/孔，每個(gè)稀釋度接種8孔，同時(shí)設(shè)置不接病毒液的細(xì)胞對(duì)照，37°C，5%C02，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3h ;孵育結(jié)束后，棄掉病毒液，加入細(xì)胞維持液，100 μ I/孔，37°C，5%C02，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。
[0072](4)免疫熒光檢測(cè)
如實(shí)施例1步驟(5)所述。
[0073](5)統(tǒng)計(jì)并計(jì)算病毒滴度。
[0074]統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)特異熒光孔的數(shù)目，以Reed-Muench法對(duì)豬瘟病毒的滴度(TCID50A).1ml)進(jìn)行計(jì)算。
[0075](6)結(jié)果
兩種檢測(cè)方法的特異熒光細(xì)胞孔數(shù)統(tǒng)計(jì)如下表1、2所示。
`[0076]表1本發(fā)明檢測(cè)方法的豬瘟活疫苗效力檢測(cè)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，其特征在于，它包括如下步驟: (1)細(xì)胞的鋪板及培養(yǎng) 以0.25%的EDTA-胰酶將生長良好的檢測(cè)用細(xì)胞進(jìn)行消化分散，然后以細(xì)胞生長液重懸為細(xì)胞濃度2~4X105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入量100 μ I/孔，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，檢測(cè)用細(xì)胞長滿單層； (2)病毒的梯度稀釋 在10°C~15°C，用0.01M的磷酸鹽緩沖液(PBS)將豬瘟兔化弱毒活疫苗復(fù)溶，PBS加入量0.1ml/頭份，并用0.01M的PBS進(jìn)行梯度稀釋； (3)病毒沉降劑的添加 將無菌的病毒沉降劑聚乙二醇溶液按體積比1:1添加于各檢測(cè)梯度病毒液中，混勻； (4)病毒的接種及培養(yǎng) 將步驟(3)所述的添加了病毒沉降劑的各檢測(cè)梯度病毒液接種于步驟(1)中的細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入量100 μ I/孔，同時(shí)設(shè)置不接病毒液的細(xì)胞對(duì)照孔，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2~3h ;孵育結(jié)束后，棄掉病毒液，加入細(xì)胞維持液，加入量100 μ I/孔，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h ； (5)免疫熒光檢測(cè) 培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)細(xì)胞依次進(jìn)行固定、封閉、孵育豬瘟病毒抗體(一抗)、孵育熒光色素(FITC)標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體(二抗)，而后在顯微鏡下進(jìn)行熒光細(xì)胞觀察； (6)統(tǒng)計(jì)特異熒光細(xì)胞孔的數(shù)目，并計(jì)算豬瘟病毒滴度 特異熒光細(xì)胞孔(陽性孔)的判定標(biāo)準(zhǔn)為，培養(yǎng)孔中有特異熒光細(xì)胞即可；特異熒光細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)為，自然光下觀察應(yīng)為健康細(xì)胞，熒光下觀察具有細(xì)胞形態(tài)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，其特征在于，所述細(xì)胞生長液為含有8%~10%新生牛血清的MEM或DMEM溶液，pH為7.2~?.4 ;細(xì)胞維持液為含2%~3%新生牛血清的MEM或DMEM溶液，PH為7.2~?.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(1)中所述的檢測(cè)用細(xì)胞為豬睪丸細(xì)胞(ST)或豬腎細(xì)胞(PK15)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)中的梯度稀釋采用兩步法，先將豬瘟病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋至10_3或10_4，再將10_3或10_4稀釋度進(jìn)行2倍梯度稀釋，稀釋6~8個(gè)梯度至10_4 8~10_6 4 ;病毒接種細(xì)胞的梯度范圍為2倍梯度稀釋部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)中所述的病毒沉降劑為將聚乙二醇按照質(zhì)量體積濃度為15%~20%溶于0.01M的磷酸鹽緩沖液，過濾除菌制成；所用聚乙二醇的規(guī)格為PEG400(TPEG20000之一。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(5)中免疫熒光檢測(cè)包括如下步驟: O培養(yǎng)結(jié)束后，棄盡板孔內(nèi)細(xì)胞維持液，加入固定液，加入量100 μ I/孔，-20°c固定5~IOmin ； 2)棄盡固定液，將細(xì)胞板風(fēng)干； 3)向細(xì)胞板孔中加入質(zhì)量體積濃度1%的牛血清白蛋白溶液進(jìn)行封閉處理，加入量.100 μ l/孔，37°C孵育 30~60min ； 4)以0.01M的PBS沖洗，將稀釋后的豬瘟病毒抗體(一抗)添加于細(xì)胞培養(yǎng)板,加入量.100 μ l/孔，37°C孵育 30~60min ； 5)棄盡一抗，以0.01M的PBS沖洗，添加稀釋后的熒光色素(FITC)標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體(二抗)，加入量100μ I/孔，37°C孵育30~60min ； 6)棄盡二抗，以0.01M的PBS沖洗，熒光顯微鏡下觀察。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(5)中豬瘟病毒抗體(一抗)的稀釋倍數(shù)為500-700倍；熒光色素(FITC)標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體(二抗)的稀釋倍數(shù)為800~1000倍。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(6)中病毒滴度(TCID5(i/0.1ml)的計(jì)算公式為: LogTCID50=高于50%陽性孔率最高稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例X稀釋度對(duì)數(shù)之差 稀釋度對(duì)數(shù)之差=低于50%陽性孔率最低稀釋度的對(duì)數(shù)-高于50%陽性孔率最高稀釋度的對(duì)數(shù) 距離比例=(高于50%陽性孔率的百分?jǐn)?shù)-50)/ (高于50%陽性孔率的百分?jǐn)?shù)-低于50%陽性孔率的百分?jǐn)?shù))。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103616505SQ201310663187
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月10日
【發(fā)明者】李倬, 梁武, 李守軍, 郁宏偉, 劉濤, 柳珊, 楊保收, 朱秀同, 李建麗, 呂茂杰, 鄭朝朝 申請(qǐng)人:瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司