雙峰駝源抗豬瘟兔化弱毒疫苗株e2抗原重鏈抗體vhh和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙峰駝源抗豬瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重鏈抗體VHH和用途，以解決現(xiàn)有豬瘟病毒抗原診斷試劑研發(fā)過程中存在的無法獲得高純度、高親和力的抗豬瘟病毒抗體的生產(chǎn)和制備的問題。一種雙峰駝源抗豬瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重鏈抗體VHH，所述的抗體具有核苷酸序列：SEQIDNO.1，SEQIDNO.2或SEQIDNO.3。所述的雙峰駝源抗豬瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重鏈抗體VHH在制備檢測豬瘟病毒抗原診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明特點是首次獲得利用雙峰駝篩選獲得抗豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株抗原蛋白E2的VHH抗體編碼序列；ELISA實驗結(jié)果表明，E.coli中表達(dá)的重組VHH抗體與豬瘟病毒多克隆抗血清具有相同的抗原結(jié)合能力，可代替豬瘟病毒多克隆抗體用于豬瘟病毒抗原診斷試劑的研究中。
【專利說明】雙峰駝源抗豬瘍兔化弱毒疫苗株E2抗原重鏈抗體VHH和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于疫苗領(lǐng)域，具體涉及一種雙峰駝源抗豬瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重鏈抗體VHH。
【背景技術(shù)】
[0002]豬瘟又稱豬霍或者古典豬瘟(Classical swine fever，CSF)，其病原是豬瘟病毒(CSF virus，CSFV)。豬瘟是豬的重要傳染病之一，其病理特征是小血管壁變性，導(dǎo)致內(nèi)臟器官多發(fā)性出血、壞死和梗死。我國是養(yǎng)豬大國，預(yù)防接種豬瘟兔化弱毒疫苗(C-strain)是防控豬瘟的最有效方式，盡管如此，豬瘟仍是養(yǎng)豬業(yè)危害最為嚴(yán)重的傳染病之一，在我國預(yù)防和控制豬瘟的發(fā)生，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和社會意義。在CSFV感染的或者C-strain疫苗免疫后的豬體內(nèi)，特異性抗病毒中和抗體是機(jī)體最主要的抗病毒免疫反應(yīng)，CSFV基因組編碼地E2蛋白是機(jī)體產(chǎn)生抗豬瘟病毒血清抗體的最主要抗原蛋白，是研制基因工程疫苗和抗原、抗體診斷方法的最重要的候選蛋白。
[0003]1993年，Hamers等首先發(fā)現(xiàn)在駱駝和鯊魚等血清中存在一種天然缺失輕鏈，僅有重鏈的IgG2和IgG3型的抗體，其抗原結(jié)合位點僅由重鏈可變區(qū)單結(jié)構(gòu)域組成，故也稱為單域重鏈抗體(variable domain of the heavy chain of HCAbs, VHH)。大量研究證實，缺失了輕鏈和CHl恒定區(qū)VHH抗體仍保持同普通IgG抗體相同的生物學(xué)功能，并且表現(xiàn)出普通IgG抗體和單克隆不具備的新的生物學(xué)功能。VHH抗體擁有更長的抗原互補結(jié)合區(qū)(CDR3)氨基酸序列，不僅可與抗原表面的抗原表位結(jié)合，還能夠深入具有裂縫凹陷結(jié)構(gòu)的抗原內(nèi)部，如酶的活性位點，病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合位點等；因其是分子量小(單克隆抗體的1/10)，所以組織穿透性能力強于常規(guī)IgG抗體，研究發(fā)現(xiàn)其甚至可以跨過血腦屏障，到達(dá)普通IgG抗體分子無法接觸的位置，充分發(fā)揮VHH抗體的生物學(xué)功能；VHH抗體FR2區(qū)存在一些不同于常規(guī)IgG抗體的親水性氨基酸，使得VHH抗體在水溶液中具有良好的穩(wěn)定性，可以實現(xiàn)抗體規(guī)?；a(chǎn)和純化，獲得水溶性好、穩(wěn)定性強、生物活性和抗體結(jié)構(gòu)更加接近天然抗體的高純度重組抗體；VHH與抗原結(jié)合的親和力達(dá)到納摩爾級,與單鏈抗體親和力相當(dāng)，該抗體作為一種小型化的基因工程抗體在病原學(xué)研究，高敏感性抗原診斷方法領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種雙峰駝源抗豬瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重鏈抗體VHH，以解決現(xiàn)有豬瘟病毒抗原診斷試劑研發(fā)過程中存在的無法獲得高純度、高親和力的抗豬瘟病毒抗體的生產(chǎn)和制備的問題。
[0005]本發(fā)明的另一個目的是提供一種雙峰駝源抗豬瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重鏈抗體VHH的用途。
[0006]本發(fā)明技術(shù)方案如下:一種雙峰駝源抗豬瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重鏈抗體VHH，其特征在于所述的抗體具有核苷酸序列:SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3。[0007]進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種重組表達(dá)載體，含有所述的核苷酸序列。
[0008]進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞為含有所述的核苷酸序列的原核細(xì)胞。所述的宿主細(xì)胞為含有所述的表達(dá)載體的原核細(xì)胞。
[0009]進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種雙峰駝源抗豬瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重鏈抗體VHH在制備檢測豬瘟病毒抗原診斷試劑中的應(yīng)用。 [0010]本發(fā)明的發(fā)明特點是首次獲得利用雙峰駝篩選獲得抗豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株抗原蛋白E2的VHH抗體編碼序列；ELISA實驗結(jié)果表明，疋coli中表達(dá)的重組VHH抗體與豬瘟病毒多克隆抗血清具有相同的抗原結(jié)合能力，可代替豬瘟病毒多克隆抗體用于豬瘟病毒抗原診斷試劑的研究中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為VHH抗體氨基酸特征分析圖；
圖2為SDS-PAGE分析抗CSFV E2 VHH抗體在疋coli中的表達(dá)圖；
圖 2 中 1:VHH-E2-1 包涵體，2:VHH-E2_1 上清；3:VHH-E2_2 包涵體，4:VHH-E2_2 上清；5 VHH-E2-3包涵體；M:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量(由上而下
分子量依次為:75，65，40, 35，14 kDa) ；6:VHH-E2_3上清；7和8:空載體對照；9:未加IPTG對照組；圖中箭頭指示的是目的條帶；
圖 3 為 Western blotting 分析 VHH-E2 蛋白圖。
【具體實施方式】
[0012]下面的實施例可以進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0013]實施例1
一、雙峰駝免疫、外周血淋巴細(xì)胞分離和cDNA合成 1.材料和方法
1.1材料一試驗動物、抗原、佐劑
選擇兩峰年齡在I歲左右的雌性幼雙峰駝作為免疫受體動物(這些雙峰駝常年散養(yǎng)在甘肅金昌市附近的戈壁灘上，主要是剪駝毛銷售。畜主僅在冬季草枯、夏季極度干旱和母駝產(chǎn)羔時召回補充飼草、水和鹽，從未接種過任何疫苗，是制備VHH抗體的合適受體動物。)，佐劑用206佐劑，抗原為E2-GST抗原。
[0014]豬瘟兔化弱毒疫苗株(CSFV) E2抗原制備采用現(xiàn)有方法:利用親和層析方法純化可溶性E2融合蛋白(GST-tag)作為免疫雙峰駝的抗原，篩選特異性重鏈單域抗體(VHH)的E2抗原。利用SDS-PAGE電泳確定蛋白純度，通過紫外吸收法定量。
[0015]1.2 方法
用206佐劑和E2-GST抗原等體積充分混勻乳化完全，分別在雙峰駝的頸部、雙后肢和背部皮下多點注射，首次免疫劑量為300 μ g/次(2mL)，第14天、第21天、第35天、第49天和第54天加強免疫，免疫劑量為200 μ g/次(2mL)。每次免疫前采集靜脈血，分離血清,用間接ELISA試驗測定血清抗體滴度。雙峰駝用E2抗原免疫后，體內(nèi)抗E2蛋白特異性抗體滴度隨著免疫時間延長而逐漸上升，第4次(35天時)免疫后，抗體水平達(dá)到最高水平，第5次免疫后抗體滴度無顯著提高，根據(jù)血清抗體消長特點，第6次免疫后5天采集頸靜脈外周血。
[0016]分別采集兩峰實驗動物外周靜脈血各200mL混勻作為樣品，然后用3.8%枸櫞酸鈉作為抗凝劑與樣品按1:9的體積比混合，加入淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)，共收集與2 X IO9個淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞按照I X IO8個/管分裝，保存在液氮中。用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，以其作為模板采用擴(kuò)增VHH的引物(見表1一表達(dá)抗E2的VHH抗體序列的引物)，進(jìn)行3輪PCR擴(kuò)增得到大小約450bp的特異性VHH片段用于構(gòu)建噬菌體展示文庫。
【權(quán)利要求】
1.一種雙峰駝源抗豬瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重鏈抗體VHH，其特征在于所述的抗體具有核苷酸序列:SEQ ID N0.1，SEQ ID N0.2 或 SEQ ID N0.3。
2.一種重組表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
3.一種宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列的原核細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為含有權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體的原核細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1所述的雙峰駝源抗豬瘟兔化弱毒疫苗株E2抗原重鏈抗體VHH在制備檢測豬瘟病毒抗原診斷試劑.中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/569GK103467599SQ201310448137
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】劉湘濤, 尹雙輝, 尚佑軍, 楊順利, 田宏, 吳錦艷, 張克山, 劉永杰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所