聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色方法。本發(fā)明方法只選擇需要檢測的凝膠區(qū)域用邊框框定進行局部的、薄層溶液的染色和顯色，不用浸泡整塊膠板，大大節(jié)省了試劑和純凈水，降低了成本，減少了廢液的排放，還可避免脫膠問題，顯色速度快，方便同時進行多個處理，提高實驗效率。本發(fā)明是一種靈敏、快速、簡便、經濟、環(huán)保的PAGE膠染色方法。
【專利說明】聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種聚丙烯酰胺凝膠染色的方法，具體涉及一種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色的方法。
【背景技術】
[0002]聚丙烯酸胺凝膠電泳(Polyacrylamidegel electrophoresis, PAGE)自 1959 年建立以來，已成為分析蛋白質和核酸樣品的一種常用方法，在分子生物學及相關學科的基礎和臨床研究中被廣泛應用。由于其具有較高的分辨率，尤其在AFLP、SSR、SNP等分子標記研究和遺傳圖譜構建等方面應用更多。
[0003]電泳后對樣品的顯示有許多方法，目標產物的檢測主要采取顯色法，目前主要采用同位素放射自顯影法、熒光染料標記法、溴化乙錠和銀染法。放射自顯影法具有靈敏度高、可靠性強等優(yōu)點，但必須使用同位素標記，操作過程比較繁瑣，且操作者易遭受同位素輻射的危險，需特別的設備和防護措施，而且成本昂貴，因而在應用中有一定的局限性。熒光染料標記法雖然沒有了同位素對人的危害性，但檢測靈敏度降低了，操作過程也同樣繁瑣，而且需要有熒光顯微鏡等設備，成本較高。溴化乙錠(EB)染色法方便易行，但聚丙烯酰胺對EB的熒光有猝滅作用，大大降低了溴化乙錠染色靈敏度，特別是EB具有致癌性，使得對凝膠的操作和處理變得復雜。銀染法可以有效地克服以上述多種常見凝膠染色法的缺點，檢測靈敏度高，使用樣品量少、無毒無害、不易擴散，易于觀察。傳統(tǒng)的銀染方法主要包含下面幾個步驟:(I)預處理與固定；(2)染色；(3)顯色；(4)終止反應等。要用到蒸餾水或去離子水、乙醇、硝酸、硝酸銀、碳酸鈉、甲醛、硫代硫酸鈉、乙酸等多種化學試劑，整個過程比較繁瑣，所需時間近2小時。近年來，許多研究人員對PAGE膠中蛋白質和DNA的銀染和顯色的過程優(yōu)化進行了探索，并已取得很大發(fā)展，實驗程序大為簡化、消耗也更少。
[0004]目前DNA分子標記、遺傳圖譜構建等大量使用PAGE膠。大膠(膠厚:0.4mm,面積:33X52cm2?38X52cm2)使用比較普遍，銀染這樣的大膠，每次染色液、顯色液的量都在
2.0?2.5L，試劑消耗較大，且膠板在堿性溶液中浸泡，膠很容易從玻璃板上脫落而全功盡棄。小膠(膠厚:1.0mm，面積:llX20cm2?18X25cm2)也經常用到，雖然沒有脫膠問題，但每次染色液、顯色液的量都在0.4?0.6L，試劑消耗也較大。

【發(fā)明內容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種試劑用量少，操作簡便、靈敏，可有效防止脫膠的環(huán)保的聚丙烯酰胺凝膠染色方法。
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色的方法。
[0007]本發(fā)明所采取的技術方案是:
一種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色的方法，其特征在于:包括如下步驟:
I)電泳結束將玻璃膠板取下平放，撬開玻璃板，拿去較短的玻璃板，將長玻璃板沾有凝膠的一面向上平放； 2)把邊框置于凝膠上，框住需要染色的區(qū)域，將邊框軟質面與凝膠緊貼，防止液體的滲漏；在邊框內倒入染色液，讓染色液迅速均勻鋪滿整個需要染色的區(qū)域，進行染色；
3)把邊框內的染色液倒出，洗去殘留染色液；
4)再在邊框內倒入顯影液，讓顯影液均勻鋪滿整個需要染色的區(qū)域，進行顯色至可看見清晰的條帶；
5)把邊框內的顯影液倒出，洗去殘留顯影液，即可。
[0008]進ー步的，步聚2)中所述的邊框為2層材料構成的密閉邊框，與凝膠接觸的為平滑的軟質材料層，另ー層為硬質材料層。
[0009]進ー步的，所述的軟質材料選自PVC軟質塑料、軟質橡膠。
[0010]進ー步的，所述的硬質材料選自千思板、環(huán)氧樹脂板、不銹鋼、鋁合金、有機玻璃、PVC硬質塑料。
[0011]進ー步的，所述邊框的軟質材料層和硬質材料層的厚度獨立為0.3?0.5cm。
[0012]進ー步的，當所配制的凝膠厚度小于0.5mm或凝膠面積大于18X25cm2時,步聚I)中所述的長玻璃板在配膠前，將與膠接觸的面涂布親和硅烷，促進凝膠與貼合。
[0013]進ー步的，步聚2)中所述染色的時間為5?lOmin。
[0014]進一步的，所述染色液包含0.1?0.2% (w/v) AgNO3和0.05?0.10%(v/v)Tween20o
[0015]進ー步的，所述顯影液包含1.0 ?2.0%(w/v)Na0H、0.04 ?0.05% (w/v)Na2B4O7 和0.05 ?0.08M 甲醛。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:
在本發(fā)明中，用特制的邊框緊密地框定需要染色的凝膠區(qū)域，進行局部的、薄層的染色和顯色，本發(fā)明方法主要有以下3方面優(yōu)點:
一方面，可避免整塊凝膠板的浸泡，染色液和顯影液只需薄層地浸泡框定的凝膠，大大節(jié)省了染色液和顯影液等試劑的用量，其用量僅為常規(guī)用量的0.8%左右，降低了成本，也顯著減少了廢液的排放；
另ー方面，可避免染色過程中的脫膠問題，當凝膠厚度小于0.5_，若發(fā)生脫膠，凝膠上的DNA條帶容易被沖掉而無法看到實驗結果，當凝膠面積較大吋，若發(fā)生脫膠，膠體很難移動，且凝膠很容易被破碎而前功盡棄。本發(fā)明的檢測方法用邊框穩(wěn)住凝膠，也不用浸泡整塊凝膠板，凝膠邊緣也不會與顯影液中的堿接觸，非常有效地避免了脫膠現象；
最后，本發(fā)明的染色方法操作簡便，顯色速度快，10?15min就可以得到檢測結果，也有利于避免凝膠因浸泡過久與玻璃析脫離，省時省力，更方便同時進行多個處理，有利于提高實驗效率。
[0017]綜上，本發(fā)明是一種靈敏、快速、簡便、經濟、環(huán)保的聚丙烯酰胺凝膠染色方法?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0018]圖1聚丙烯酰胺凝膠(大面積I型凝膠)的框定區(qū)域快速染色圖，A為軟質材料邊框(半透明)與硬質材料邊框(黒色)圖，B在聚丙烯酰胺凝膠上放置軟質材料邊框，C在軟質材料邊框上再放置硬質材料邊框，D用夾子把邊框與玻璃板固定在一起；
圖2聚丙烯酰胺凝膠(小面積II型凝膠)的框定區(qū)域快速染色圖，A為染色前，軟質邊框在下，硬質邊框在上，用夾子把邊框與玻璃板固定在一起，B為染色后示意圖；
圖3聚丙烯酰胺凝膠的傳統(tǒng)染色圖，A為大面積I型凝膠的傳統(tǒng)染色圖，B為小面積II型凝膠的傳統(tǒng)染色圖。
【具體實施方式】
[0019]一種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色的方法，其特征在于:包括如下步驟:
1)電泳結束將玻璃膠板取下平放，撬開玻璃板，拿去較短的玻璃板，將長玻璃板沾有凝膠的一面向上平放；
2)把邊框置于凝膠上，框住需要染色的區(qū)域，將邊框軟質面與凝膠緊貼，防止液體的滲漏；在邊框內倒入染色液，讓染色液迅速均勻鋪滿整個需要染色的區(qū)域，進行染色；
3)把邊框內的染色液倒出，洗去殘留染色液；
4)再在邊框內倒入顯影液，讓顯影液均勻鋪滿整個需要染色的區(qū)域，進行顯色至可看見清晰的條帶；
5)把邊框內的顯影液倒出，洗去殘留顯影液，即可。
[0020]優(yōu)選的，步聚2)中所述的邊框為密閉邊框，與凝膠的接觸面為平滑的軟質材料，另一面為硬質材料。
[0021]所述的軟質材料優(yōu)選為PVC軟質塑料、軟質橡膠。
[0022]所述的硬質材料優(yōu)選為千思板、環(huán)氧樹脂板、不銹鋼、鋁合金、有機玻璃、PVC硬質塑料。
[0023]所述邊框的軟質材料層和硬質材料層的厚度獨立優(yōu)選為0.3?0.5cm，二者四條邊的寬度均優(yōu)選為1.0?2.0cm0
[0024]優(yōu)選的，當所配制的凝膠厚度小于0.5mm或凝膠面積大于18X25cm2時,步聚I)中所述的長玻璃板在配膠前，將其與凝膠的接觸面涂布親和硅烷，促進凝膠與其貼合。
[0025]優(yōu)選的，步聚2)中所述染色的時間為5?lOmin。
[0026]以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0027]實施例1:
1)聚丙烯酰胺凝膠電泳結束后將33X52cm的玻璃膠板取下平放，其中凝膠的厚度為0.4_，小心撬開玻璃板，拿去較短的玻璃板，將長玻璃板(配制凝膠時經親和硅烷處理過)沾有凝膠的一面向上平放；
2)把29X45X0.6cm的邊框放置于凝膠上框住需要染色的區(qū)域(如圖1所示)，其中邊框的軟質材料層為PVC軟質塑料(如圖1 A中的半透明邊框)，硬質材料層為環(huán)氧樹脂板(如圖1 A中的黑色邊框)，先將軟質材料層框住需要染色的區(qū)域(如圖1 B所示)，在軟質材料層上面放上硬質材料層(如圖1 C所示)，再在邊框上對稱地夾上夾子(如圖1 D所示)，使邊框軟質面緊貼凝膠(也可以利用重物壓等其他方法使邊框和凝膠緊貼)，防止液體的滲漏，再在邊框內倒入染色液20mL，迅速讓染色液均勻鋪滿整個需要染色的區(qū)域，并輕輕晃動8min ；
3)把邊框內的染色液倒出、浙干，加入50mL純凈水輕輕漂洗3s，倒出、浙干，重復I次；
4)把邊框內的水浙干后，再倒入顯影液20mL，迅速讓顯影液均勻鋪滿整個需要染色的區(qū)域，并輕輕晃動2min,可看見清晰的條帶； 5)把邊框內的顯影液倒出、浙干，加入50mL純凈水輕輕漂洗約30s，倒出、浙干，重復2次，即可。
[0028]實施例2:
1)聚丙烯酰胺凝膠電泳結束后將15X22cm的玻璃膠板取下平放，其中凝膠的厚度為Imm,小心撬開玻璃板,拿去較短的玻璃板，將長玻璃板沾有凝膠的一面向上平放；
2)把13X 19 X 0.6cm的邊框放置于凝膠上框住需要染色的區(qū)域(如圖2 A所示)，其中邊框的軟質材料層為PVC軟質塑料，硬質材料層為環(huán)氧樹脂板，在邊框上對稱地夾上夾子，讓邊框軟質面緊貼凝膠，防止液體的滲漏，再在邊框內倒入染色液5mL，迅速讓染色液均勻鋪滿整個需要染色的區(qū)域，并輕輕晃動8min ；
3 )把邊框內的染色液倒出、浙干，加入20mL純凈水輕輕漂洗3s，倒出、浙干，重復I次；
4)把邊框內的水浙干后，再倒入顯影液5mL，迅速讓顯影液均勻鋪滿整個需要染色的區(qū)域，并輕輕晃動2min,可看見清晰的條帶；
5)把邊框內的顯影液倒出、浙干，加入50mL純凈水輕輕漂洗約30s，倒出、浙干，重復2次，即可，染色后的圖片如圖2 B所示。
[0029]實施例3:
1)聚丙烯酰胺凝膠電泳結束后將15X22cm的玻璃膠板取下平放，其中凝膠的厚度為Imm,小心撬開玻璃板,拿去較短的玻璃板，將長玻璃板沾有凝膠的一面向上平放；
2)把13X 19 X Icm的邊框放置于凝膠上框住需要染色的區(qū)域，其中邊框的軟質材料層為軟質橡膠，硬質材料層為千思板，在邊框上對稱地夾上夾子，讓邊框軟質面緊貼凝膠，防止液體的滲漏，再在邊框內倒入染色液5mL，迅速讓染色液均勻鋪滿整個需要染色的區(qū)域，并輕輕晃動8min ；
3 )把邊框內的染色液倒出、浙干，加入20mL純凈水輕輕漂洗3s，倒出、浙干，重復I次；4)把邊框內的水浙干后，再倒入顯影液5mL，迅速讓顯影液均勻鋪滿整個需要染色的區(qū)域，并輕輕晃動2min,可看見清晰的條帶；
5)把邊框內的顯影液倒出、浙干，加入50mL純凈水輕輕漂洗約30s，倒出、浙干，重復2次，即可。
[0030]實施例4:
1)聚丙烯酰胺凝膠電泳結束后將33X52cm的玻璃膠板取下平放，其中凝膠的厚度為
0.4_，小心撬開玻璃板，拿去較短的玻璃板，將長玻璃板(配制凝膠時經親和硅烷處理過)沾有凝膠的一面向上平放；
2)把29X 45 X Icm的邊框放置于凝膠上框住需要染色的區(qū)域，其中邊框的軟質材料層為PVC軟質塑料，硬質材料層為PVC硬質塑料，在邊框上對稱地夾上夾子，讓邊框軟質面緊貼凝膠，防止液體的滲漏，再在邊框內倒入染色液20mL，迅速讓染色液均勻鋪滿整個需要染色的區(qū)域，并輕輕晃動8min ；
3 )把邊框內的染色液倒出、浙干，加入50mL純凈水輕輕漂洗3s，倒出、浙干，重復I次；
4)把邊框內的水浙干后，再倒入顯影液20mL，迅速讓顯影液均勻鋪滿整個需要染色的區(qū)域，并輕輕晃動2min,可看見清晰的條帶；
5)把邊框內的顯影液倒出、浙干，加入50mL純凈水輕輕漂洗約30s，倒出、浙干，重復2次，即可。[0031]下面對實施例中凝膠框定區(qū)域快速染色方法的試劑用量、純水用量及試劑費用等方面與傳統(tǒng)染色法的進行比較。
[0032]分別統(tǒng)計傳統(tǒng)染色法(如圖3所示)和本發(fā)明的框定區(qū)域快速染色法(如圖1和圖2所示)中的試劑用量、純水用量及試劑費用，統(tǒng)計數據如下表1所示。其中，傳統(tǒng)染色法即將凝膠置于相關溶液中浸泡進行染色和顯色，當凝膠面積大于18 X 25cm2或厚度小于0.5mm時，需粘附在玻璃板上進行染色操作，如圖3A所示的面積大且薄的I型凝膠(長X寬X厚:52cmX33cmX0.4mm)的傳統(tǒng)染色方法，必須將I型凝膠粘附在玻璃板上置于液體中進行浸泡，且操作須須細致，時間掌控要得當，否則凝膠容易脫落破碎；而圖3B所示的面積小且厚的II型凝膠(長X寬X厚:15cmX22cmXlmm)的傳統(tǒng)染色方法，可以去玻璃板，單獨浸泡進行染色。
[0033]表1聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色法與傳統(tǒng)染色法的試劑用量等比較
【權利要求】
1.一種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色的方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)電泳結束將玻璃膠板取下平放，撬開玻璃板，拿去較短的玻璃板，將長玻璃板沾有凝膠的一面向上平放； 2)把邊框置于凝膠上，框住需要染色的區(qū)域，將邊框軟質面與凝膠緊貼，防止液體的滲漏；在邊框內倒入染色液，讓染色液迅速均勻鋪滿整個需要染色的區(qū)域，進行染色； 3)把邊框內的染色液倒出，洗去殘留染色液； 4)再在邊框內倒入顯影液，讓顯影液均勻鋪滿整個需要染色的區(qū)域，進行顯色至可看見清晰的條帶； 5)把邊框內的顯影液倒出，洗去殘留顯影液，即可。
2.根據權利要求1所述的ー種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色的方法，其特征在干:步聚2)中所述的邊框為兩層材料構成的密閉邊框，與凝膠接觸的為平滑的軟質材料層，另ー層為硬質材料層。
3.根據權利要求2所述的ー種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色的方法，其特征在于:所述的軟質材料選自PVC軟質塑料、軟質橡膠。
4.根據權利要求2所述的ー種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色的方法，其特征在干:所述的硬質材料選自千思板、環(huán)氧樹脂板、不銹鋼、鋁合金、有機玻璃、PVC硬質塑料。
5.根據權利要求2所述的ー種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色的方法，其特征在于:所述的軟質材料層和硬質材料層的厚度獨立為0.3~0.5cm。`
6.根據權利要求1所述的ー種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色的方法，其特征在于:當所配制的凝膠厚度小于0.5mm或凝膠面積大于18X25cm2時，步聚I)中所述的長玻璃板在配膠前，將其與凝膠的接觸面涂布親和硅烷，促進凝膠與其貼合。
7.根據權利要求1所述的ー種聚丙烯酰胺凝膠框定區(qū)域快速染色的方法，其特征在于:步聚2)中所述染色的時間為5~lOmin。
【文檔編號】G01N1/30GK103604680SQ201310634022
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權日:2013年11月28日
【發(fā)明者】勞方業(yè), 齊永文, 鄧海華 申請人:廣州甘蔗糖業(yè)研究所