用于痕量靶標物質測量的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于痕量靶標物質測量的檢測方法，包括：1）取加樣裝置，并在檢測區(qū)固定生物芯片；2）關閉加樣溝道和輔助溝道，向檢測溝道泵入緩沖液；3）關閉檢測溝道，泵入含有待測樣本，該段內的待測樣本構成檢測段；4）關閉加樣溝道和輔助溝道，向檢測溝道泵入緩沖液，把檢測段推送并覆蓋檢測區(qū)；5）第一結合反應；6）第一結合反應完畢后，使用緩沖液把檢測段推出檢測區(qū)，關閉檢測溝道；7）利用步驟3）和4）相同的方式，使用信號物質液體替代待測樣本而產生信號段，覆蓋檢測區(qū)；8）第二結合反應，產生樣品；9）關閉加樣溝道和輔助溝道，利用緩沖液把殘余物質液體推出檢測溝道；10）對檢測區(qū)的樣品采集分析。
【專利說明】用于痕量靶標物質測量的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于血液樣品中痕量靶標物質的檢測方法，屬于生物醫(yī)學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]目前，人體疾病的發(fā)生常在體內產生生物分子的種類或數(shù)量的變化，人們可以通過檢測體內某些標志性生物分子的產生或者數(shù)量的變化來進行疾病的早期診斷或者理解疾病的演變。例如，心臟損傷時血液中的肌紅蛋白Myoglobin，Mb、肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase MB, CK-MB)和心肌肌I丐蛋白 I (Cardiac Troponin I, cTnl)蛋白分子將產生，濃度增高。臨床醫(yī)生通過體內這些生化標志物的含量來診斷心臟損傷程度或治療效果。然而絕大部分疾病的特異性標志分子含量都非常低，在痕量甚至超痕量水平上檢測這些標志性靶物質仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。
[0003]關于痕量,化學上指極小的量,少得只有一點兒痕跡。痕量分析trace analysis,則是指物質中含量在百萬分之一以下的組合的分析方法。痕量一詞的含義隨著痕量分析技術的發(fā)展而有所變化。因此，痕量是界定范圍漸變的量值。
[0004]痕量分析包括測定痕量元素在試樣中的總濃度和用探針技術測定痕量元素在試樣中或試樣表面的分布狀況。一般分成3個基本步驟:取樣、樣品預處理和測定，本文側重于測定環(huán)節(jié)，但為有助于理解，對前兩個環(huán)節(jié)只做簡單描述。
[0005]由于被測元素在樣品中含量很低、分布很不均勻，特別是環(huán)境樣品，往往隨時間、空間變化波動很大，要充分注意取樣的代表性和保證一定的樣品量。為了增強對痕量成分的檢出能力和除去基本干擾，痕量組分的分離與富集常常是必不可少的，有兩種方案:一種是將主要組分從樣品中分離出來，讓痕量組分留在溶液中；另一種是將痕量組分分離出來而讓主要組分留在溶液中。為了提高分離、富集效果，通常應用掩蔽技術。樣品預處理的另一個目的是使痕量組分轉變?yōu)樽钸m宜于最后測量的形式。常用的分離、富集方法有揮發(fā)、沉淀和共沉淀、電解、液-液萃取、離子交換、色譜、萃取色譜、電泳等。在分離、富集過程中對于污染和痕量組分的損失要予以充分注意。
[0006]測定痕量組分的方法，取決于被分析的對象和測定方法的靈敏度、準確度、精密度和選擇性以及經濟上的合理性。在從經典的比色法和分光光度法到各種近代的儀器分析等痕量分析方法中，較常用的方法有:①光學方法。包括分光光度法、原子發(fā)射光譜法、原子吸收分光光度法、原子熒光光譜法、分子熒光和磷光法、化學發(fā)光法、激光增強電離光譜法等。②電化學方法。包括極譜分析法、庫侖分析法、電位法和計時電位法等。③X射線法。包括電子微探針法、X射線熒光光譜法等。④放射化學法。包括活化分析法、同位素稀釋法、放射性標記分析法等。⑤質譜法。包括二次離子質譜分析、火花源固體質譜。⑥色譜法。包括氣相色譜法、液相色譜法、離子色譜法等。
[0007]目前臨床上血液中生化標志物常規(guī)檢測方法有放射性免疫法RIAs、高壓液相色譜分析法、電化學分析法、蛋白質分析儀、各種診斷試劑盒及免疫層析試條等，這些方法普遍存在放射性污染、需要大型儀器、耗時長、不能定量檢測等缺點，在臨床上應用具有一定局限性。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種操作簡練，操作階段耗時少，能定量檢測，檢測效率高的用于痕量靶標物質測量的檢測方法。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術方案:
[0010]一種用于痕量靶標物質測量的檢測方法，所使用檢測裝置包括加樣裝置和對加樣裝置所獲得樣品進行檢測的采樣分析裝置，所述檢測方法包括:
[0011]I)取一個加樣裝置，并在檢測區(qū)固定用于捕獲待檢測標志物質的生物芯片；
[0012]2)關閉加樣溝道和輔助溝道，向檢測溝道泵入緩沖液(如PBS緩沖液)，至少灌滿加樣溝道與輔助溝道之間的檢測溝道；
[0013]3)關閉檢測溝道，通過加樣溝道泵入含有待測樣本，輔助溝道泄流，待測樣本至少灌滿加樣溝道與輔助溝道之間的檢測溝道，該段內的待測樣本構成檢測段，其中待測樣本為含有所述帶檢測標志物質的樣本；
[0014]4)關閉加樣溝道和輔助溝道，向檢測溝道泵入緩沖液，把檢測段推送到檢測區(qū)，并覆蓋檢測區(qū)；
[0015]5)第一結合反應，檢測段內的待測樣本與生物芯片反應第一給定的時間；
[0016]6)第一結合反應完畢后，使用緩沖液把所述檢測段推出檢測區(qū)，然后關閉檢測溝道;
[0017]7)利用步驟3)和4)相同的方式，使用信號物質液體替代待測樣本而產生信號段，覆蓋檢測區(qū)；
[0018]8)第二結合反應，使信號物質與檢測區(qū)經過第一次結合反應產生的物質在第二給定的時間內進行第二次結合反應，產生樣品；
[0019]9)關閉加樣溝道和輔助溝道，利用緩沖液通過檢測溝道把檢測區(qū)完成第二次結合反應后殘余的物質液體推出檢測溝道；
[0020]10)利用采集分析裝置對檢測區(qū)的樣品進行采集分析。
[0021]所述檢測區(qū)修飾為匹配吸收生物芯片的納米薄膜層。
[0022]所述納米薄膜層表面進一步修飾親和素，以與生物素化的探針分子偶聯(lián)，并通過枝接方法增加結合點，形成貯存單元。
[0023]所述信號物質為信號抗體或者信號核酸適體，且兩者均標記有探針分子，而探針分子為酶分子或者突光分子。
[0024]所述加樣裝置包括:
[0025]檢測溝道，其下游的一段溝道構造為檢測區(qū)，并至少在檢測區(qū)處留有檢測窗；
[0026]加樣溝道，連接于檢測溝道的上游段而構成加樣旁路；
[0027]輔助溝道，連接于加樣溝道連接點與檢測區(qū)之間的檢測溝道上，構成用于加樣泄流的旁路；且加樣溝道與輔助溝道之間的檢測溝道長度大于檢測區(qū)的長度；
[0028]檢測管路單元，配接于檢測溝道，并設有控制閥；
[0029]加樣管路單元組，配接于加樣溝道和輔助溝道，并設有控制閥組；[0030]檢測泵，通過所述檢測管路單元及相應的控制閥接入檢測溝道的上游端，以泵送檢測輔助液；
[0031]加樣泵組，通過所述加樣管路單元組及相應的控制閥組接入加樣溝道，以對應泵送加樣液組；以及
[0032]控制單元，連接檢測泵、加樣泵及控制閥和控制閥組，以邏輯控制檢測泵、加樣泵組及相配控制閥、控制閥組的動作順序。
[0033]本發(fā)明的有益效果是，依據(jù)本發(fā)明，借助于構造簡單的溝道，然后配合樣品的分析，所使用設備整體緊湊，加樣量準確且整個操作相對比較簡練，所消耗時間較多的體現(xiàn)在反應時間上，操作階段占用時間少，整體的檢測效率比較高。比如使用加樣裝置連續(xù)加樣10次，單次加樣時間小于2秒鐘，測量每一次加樣量體積，變異系數(shù)小于1%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1a為一個實施例溝道構造結構示意圖，并表示為加樣前狀態(tài)示意圖；
[0035]圖1b為沿a_a’溝道充填緩沖液狀態(tài)示意圖；
[0036]圖1c為沿b-c-d-b’溝道通入待測樣本狀態(tài)示意圖；
[0037]圖1d為沿a-a’溝道通入緩沖液狀態(tài)示意圖，把cd段待測樣本推倒覆蓋檢測區(qū)e的部位；
[0038]圖2a為一個實施例中三明治結構的結構示意圖；
[0039]圖2b為另一個實施例中三明治結構的結構示意圖；
[0040]圖3為一種納米探針貯存單元形成流程；
[0041]圖4為以發(fā)光探針為例進行的慣常三明治結構、在檢測區(qū)e修飾高疏松納米薄膜層及在檢測區(qū)e修飾高疏松納米薄膜層的基礎上進一步使用納米探針忙存單元三種情況敏感效果的比較；
[0042]圖5為不同靶物質濃度的樣本通過本發(fā)明實施例方法檢測實現(xiàn)的痕量靶標物質的定量檢測效果圖；
[0043]圖6為實施例中三種生物芯片檢測結果對比圖；
[0044]圖7為一個實施例中并行檢測的溝道構造原理圖；
[0045]圖8為另一個實施例中溝道構造原理圖；
[0046]圖9為再一個實施例中溝道構造原理圖；
[0047]圖10為一種溝道構造結構示意圖；
[0048]圖11為另一種溝道構造結構示意圖；
[0049]圖12為光學檢測模塊結構示意圖；
[0050]圖13為光路掩板的工作原理示意圖；
[0051]圖中:1.檢測溝道，2.加樣溝道，3.檢測區(qū)，4.基底，5.輔助溝道，6.捕捉抗體，
7.靶標物質，8.信號抗體，9.探針分子，10.捕捉核酸適體，11.信號核酸適體，12.上蓋板，13.第一型溝道,14.第二型溝道，15.掩板,16.透鏡，17.二向分光鏡，18.針孔,19.第一濾光片,20.光電轉換器,21.數(shù)據(jù)處理模塊,22.顯不器,23.光源,24.第二濾光片,25.滾珠絲杠副，26.有效熒光，27.激發(fā)光，28.無效瑩光，29.生物芯片。【具體實施方式】
[0052]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。
[0053]為了使本發(fā)明的實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結合實施例和附圖，對本發(fā)明的多個層面的技術問題和所用的技術手段進行詳細說明。在此，本發(fā)明的示意性實施例及說明僅用于解釋本發(fā)明，但并不作為對本發(fā)明的具體限定。
[0054]在這樣的一個概念中，如檢測溝道1，其本質上一個流體通路，而不為檢測或者溝道所具體限定。作為徑流的流體通道，可以使用上游、中游和下游來區(qū)分在流體流通方向上不同的區(qū)位,本領域的技術人員對此應有清楚地理解。
[0055]應當理解，如檢測窗的核心詞為“窗”，但并不表示為開設的一個窗口，而表示為能夠用于檢測，是一個以“能”為限的術語，正如使用望遠鏡在固定位置遠望，其周圍也滿足能夠遠望的條件，但并不表示在望遠鏡位置單獨設窗。
[0056]應當理解，本文中，如加樣管路單元，并不是一根管路，而應當理解為加樣管路系統(tǒng)。
[0057]—個用于痕量靶標物質7測量的檢測裝置，配置為一個生物芯片29，一個加樣裝置和一個用于微弱信號檢測的檢測模塊。
[0058]關于生物芯片29，又稱DNA芯片或基因芯片，它們是DNA雜交探針技術與半導體工業(yè)技術相結合的結晶。該技術系指將大量探針分子9固定于支持物上后與帶熒光標記的DNA樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子9的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。在本文中，基底4和溝道加上生物分子構造為一個生物芯片29。
[0059]生物芯片技術起源于核酸分子雜交。所謂生物芯片一般指高密度固定在互相支持介質上的生物信息分子(如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白質、糖分子、組織等)的微陣列雜交型芯片(miCTo-arrays)，陣列中每個分子的序列及位置都是已知的，并且是預先設定好的序列點陣。微流控芯片(microfluidic chips)和液相生物芯片是比微陣列芯片后發(fā)展的生物芯片新技術，生物芯片技術是系統(tǒng)生物技術的基本內容。
[0060]更直觀的講，生物芯片29就是在一塊玻璃片、硅片或尼龍膜等材料上放上生物樣品，然后由一種儀器收集信號，用計算機分析數(shù)據(jù)結果。
[0061]盡管人們可能很容易把生物芯片與電子芯片聯(lián)系起來，并且事實上，兩者確有一個最基本的共同點:在微小尺寸上具有海量的數(shù)據(jù)信息。但它們是完全不同的兩種東西，電子芯片上布列的是一個個半導體電子單元，而生物芯片上布列的是一個個生物探針分子9。
[0062]因此，在如說明書附圖1a所使的結構中，檢測區(qū)3，也就是圖中e表示的區(qū)域，用于固定捕獲物質分子，用于捕獲加樣液體中的生物分子。
[0063]用于痕量靶標物質7的測量，在這樣的一個加樣裝置中，其基本配置應當包括:
[0064]檢測溝道1，在圖如Ia所示的結構中，為一個直的溝道，兩端為a-a’所標識，a端為流體進入端，另一端則是流體流出端。在其下游的一段溝道構造為檢測區(qū)3，并至少在檢測區(qū)3處留有檢測窗。
[0065]應知，當檢測溝道I彎曲時或者存在折彎結構時，對整體的流體泵送影響不大，在此基礎上不做具體限定的檢測溝道I可以理解為滿足任意走向。
[0066]從流阻角度看，最好采用直的溝道結構，流阻小，對于相同的泵，名義上能夠具有更大的揚程。[0067]檢測溝道I可以從另外一個概念上去理解它，通過檢測溝道的使用能夠把特定物質運送到檢測區(qū)。
[0068]那么特定的物質就通過加樣溝道2進行輸送，其連接于檢測溝道I的上游段而構成加樣旁路，加樣的各種流體均通過加樣溝道2進行輸送。
[0069]應當理解，由于所說的各種流體量非常小，那么相關的溝道截面也不會太大，依據(jù)固體與液體接觸時因表面張力所產生的不浸潤和浸潤現(xiàn)象，從而可以保證加樣液體在截面比較小的通道被整體可靠的輸送。
[0070]應知，不浸潤表現(xiàn)為固體與液體接觸時，接觸面趨于縮小、液體不能附著在固體上的現(xiàn)象。如水銀不能附著在玻璃上，把水銀倒入玻璃容器內，水銀與玻璃壁接觸處的角度大于90°，表明接觸面趨于縮小，即水銀不浸潤玻璃。水不能附著在石蠟上，說明水不浸潤石蠟。
[0071]與之相對的概念則是浸潤，如放在潔凈的玻璃板上的一滴水，會附著在玻璃板上形成薄層。把一塊潔凈的玻璃片進入水里再取出來，玻璃表面會沾上一層水。這種現(xiàn)象叫做浸潤。對玻璃來說，水是浸潤液體。
[0072]那么與之相關的如毛細現(xiàn)象，浸潤液體在毛細管中上升(如水-玻璃)，液面成凹月面型，液體附著在器壁；不浸潤液體在毛細管中下降(如水銀-玻璃)，液面成凸月面型，液體不附著在器壁，表面張力使其凸出。
[0073]依據(jù)上述原理，可以對在截面比較小的溝道內對一段液體進行整體的搬送。
[0074]對于加樣裝置，為了保證加樣的正常進行，進一步配置輔助溝道5，如圖1a所示，輔助溝道5與加樣溝道2實際構成另一個流體通路，借助圖1中所示的Cd段檢測通道被勾連，形成b-c-d-b’通道。這樣需要輔助溝到5配置成連接于加樣溝道2連接點與檢測區(qū)3之間的檢測溝道I上，構成用于加樣泄流的旁路；且加樣溝道2與輔助溝道5之間的檢測溝道I長度大于檢測區(qū)3的長度。
[0075]長度的要求在于不同液面之間不可避免的擴散現(xiàn)象，可能會導致截面模糊，同時關于泵送液體的量，并不能理想的控制。為了在檢測區(qū)3能夠進行給定的反應，需要加樣的液體段能夠完全覆蓋檢測區(qū)3，并進可能消除控制精度和不同液體擴散的影響。
[0076]為了獲得相對清晰的液體截面，在圖1a所示的結構中，加樣溝道2與輔助溝道5均與檢測溝道I垂直。
[0077]依據(jù)簡單介紹的上述溝道布置，借以建立的溝道系統(tǒng)為滿足液體的送入，進一步需要對其配管。由于如圖1a所示，總共4個接口，且控制方式也不復雜，不必像《配管數(shù)據(jù)手冊》一樣進行復雜的配管設計，而只需要按照所需要的控制方式也區(qū)分流體地進行配管即可。
[0078]把配管分成兩個大的部分，分別為用于檢測溝道配管的檢測溝道I單元和用于加樣溝道2和輔助溝道5配管的加樣管路單元組。然后配置相關的控制閥，用于檢測溝道1、加樣溝道2和輔助溝道5的通斷控制，其中后面的兩個溝道因為整體構造為一個流體通道，應進行同步控制。
[0079]在下述的內容中可見之，檢測溝道I的a端主要用于泵入一種液體，而加樣溝道2則需要加入兩種液體。為此，加樣溝道2的b端可以配置電磁換向閥，如三位三通閥，用于兩種液體在不同時段的介入，以及關?？刂?。也可以利用一個三通連接兩個管路，每個管路上配置一個控制閥。
[0080]單純的就配管來講，一般也包括閥門的配置，因此，對于簡單的控制，本領域的技術人員可以進行相應的配置，由于本申請所述及的管路配置相對簡單，其配管方式在此不再贅述。
[0081]進而關于所述加樣裝置涉及泵的配置，也按照上述配管配置為檢測泵和加樣泵組，其中后者最好按照液體的種類配成多個。
[0082]檢測泵通過所述檢測管路單元及相應的控制閥接入檢測溝道I的上游端，以泵送檢測輔助液。
[0083]而加樣泵組則通過所述加樣管路單元組及相應的控制閥組接入加樣溝道2，以對應泵送加樣液組。
[0084]進而，為了更好地進行控制，配置控制單元，連接檢測泵、加樣泵及控制閥和控制閥組，以邏輯控制檢測泵、加樣泵組及相配控制閥、控制閥組的動作順序。
[0085]依據(jù)前述的內容可知，控制邏輯相對比較簡單，本領域的技術人員無需付出創(chuàng)造性勞動即可實現(xiàn)相關的控制算法。
[0086]關于溝道，從結構上看，在本文更優(yōu)的選擇更像是明渠，其基礎結構可以參考明渠結構，表現(xiàn)為檢測溝道I、加樣溝道2和輔助溝道5的徑流橫截面相同，且朝向檢測設備的面為平面，據(jù)此應當理解，這里的平面主要是有利于檢測的有效進行，而橫截面相同的結構，則有利于形成穩(wěn)定的液段。
[0087]在一些實施例中，可能分段地配置不同的結構，如部分溝道構造為圓管，而在液段構造區(qū)和液段流經區(qū)構造為明渠結構。
[0088]關于液段的內容以上的內容有所體現(xiàn)，并在后面的內容中有具體的應用，在此不再贅述。
[0089]在如圖10和如圖11所示的結構中，檢測溝道I、加樣溝道2和輔助溝道5對應包括形成在基底4上表面的溝道槽和覆蓋于對應溝道上表面的上蓋板12，其中溝道槽的徑流橫截面為半圓形或者下表面頂角弧化的方形，其中半圓形溝道槽表示為第一型溝道槽13，而另一種溝道槽則表示為第二型溝道槽14。
[0090]溝道槽成型在透明的基底4的上表面，如果采用手動控制，能夠通過液體的不同顏色查看流體的流動，可以方便手動控制。
[0091]關于上蓋板12，由于所需要的基底4上表面面積并不大，上蓋板12可以為整體結構，覆蓋整個基底4的上表面。也可以根據(jù)溝道槽走勢進行匹配的上蓋板12設置。
[0092]關于溝道槽的規(guī)格，按照其槽口寬度進行限定，所述溝道槽的槽口寬度為100 μ m?1000 μ m。具體規(guī)格應與檢測儀器的靈敏度相適應，檢測儀器靈敏度足夠高，微溝道寬度可以降低。另外具體規(guī)格還與推動液體通過微溝道的泵有關系，微溝道寬度尺寸越小，阻力越大，需要的泵的推動力也就越大。因此，溝道槽的規(guī)格應綜合考慮泵的驅動能力和檢測儀器的靈敏度，溝道槽的槽口寬度不應小于100 μ m。
[0093]又由于溝道不宜過大，源于各種液體的量并不大，同時太大的截面也會影響液段獲得的質量，為此，溝道槽的槽口寬度不應大于1000 μ m。
[0094]在實際的應用中，我們會面臨這樣的問題，有時候需要對多個血液進行分析，或者對同一個血液樣品的多個樣本進行分析，為了進一步的提高檢測效率，一檢測溝道I、一加樣溝道2和一輔助溝道5構成一個加樣單元，多個加樣單元的檢測溝道串接或者并接，據(jù)此可以進行如多個血液樣品的同時檢測。
[0095]如圖7所示，aa’所標示的一個較長的檢測溝道存在多個檢測區(qū)e，進而可以配置多個加樣溝道和輔助溝道，這樣，如一個總的檢測溝道可以一次對三個檢測區(qū)進行覆蓋，整體上可以節(jié)省樣本的消耗，并減少對輔助液體的效耗，減少后續(xù)的處理負擔。另一方面，還可以減少配管的管路數(shù)量，簡化整體的結構。
[0096]如圖7所示的結構為一種串行的結構形式，而如圖8和9所示的結構為并行的結構形式，其中圖8所示的結構是一種簡單的疊加結構，是在垂直于a-a’的方向上整體結構有所縮減，減少了基底材料的應用。
[0097]圖9則表示出了另一種并行結構，并接的所有檢測溝道以進液口為中心且為公共接點圓形陣列，存在公共的節(jié)點，可以減少管路配接數(shù)量。且如果采用同一臺泵，可以減少中間管路長度的差異所造成的并行管路中不同進程的問題。
[0098]關于加樣溝道2與輔助溝道5之間的檢測溝道I長度與檢測區(qū)3長度的關系問題，在前述的內容中有所涉及，經過長期的實驗發(fā)現(xiàn)，當檢測區(qū)3長度為加樣溝道2與輔助溝道5之間的檢測溝道I長度的不小于1.5倍時，基本上不會出現(xiàn)液體界面模糊和控制精度所產生的不能有效地產生界面清晰的液段恰好完全覆蓋檢測區(qū)的問題，以保證待測靶物質能完全被捕捉在檢測區(qū)3，確保檢測質量。自然，這需要泵閥的控制精度與之配合，但泵閥選型并不屬于本案需要考慮的內容，在較高精度的泵閥配置條件下，上述倍比是適用的。
[0099]但檢測區(qū)3不宜過長，如此會產生過大的結構和試劑的損耗，為此，取檢測區(qū)3長度為檢測溝道I長度3倍為上限。
[0100]加樣裝置為主要的改進點，至于檢測裝置，在涵蓋了加樣裝置的條件下，配置相關的檢測設備即可，檢測設備可以采用已知的匹配檢測區(qū)最終物的檢測設備。
[0101]加以匹配的，一檢測溝道1、一加樣溝道2和一輔助溝道5構成一個加樣單元，多個加樣單元的檢測溝道串接或者并接；
[0102]相應地，所述采集分析裝置配有驅動其順次移動到各個檢測區(qū)3檢測位置的驅動機構。
[0103]在如前所示的內容中，基底的面積非常小，相應地，各個檢測區(qū)之間的距離也會非常小，那么驅動機構必須有足夠的驅動精度，優(yōu)選地，所述驅動機構為滾珠絲杠絲母機構，已達到所需要的控制。
[0104]加以參考的，如陣列化芯片在熒光檢測時微溝道定位是影響檢測結果的一個重要因素，采用精密絲杠副作為定位的關鍵功能部件，精密滾珠絲杠副25可以達到0.5米的移動距離內只有幾個微米的定位誤差，能夠滿足生物芯片上多個微溝道檢測區(qū)的準確定位要求。
[0105]如圖12所示，在一些實施例中，一種采集分析裝置包括:
[0106]單色光源，按照給定的光路出射，如圖12中所示的光源23，第二濾光片24構成的光源，其中光源23可以直接采用激光二極管，也可以采用其他的激光泵浦產生激光，單色性比較好。也可以基于所述第二濾光片24產生單波長的激光。
[0107]進而配置整形鏡組，配置在單色光源的光路上，將光束整形為給定光束；整形鏡組被封裝后通常被稱為光束整形鏡或者光束整形器，主要用于產生合適的光束，尤其是直線度較好的光束，既能保證光路的可控性，又能夠獲得合適的光強。
[0108]進一步地，配置掩板15，開有過孔，用于所述給定光束通過而照射到選定的檢測區(qū)3，并用于檢測區(qū)3反射光束的通過；在如圖13所示的結構中，通過掩板15使待測的檢測區(qū)3暴露于激發(fā)光27下，而其它與其并行檢測區(qū)被掩蓋而不能激發(fā)，或即使被少量激發(fā)其熒光也不能傳遞出去，從而有效解決多溝道并行檢測時熒光相互干擾的問題。圖中清楚地可看中間的也就是目標檢測區(qū)3的反射光能夠從掩板15的欲開孔中出射，形成有效熒光26，而其他兩個檢測區(qū)的反射光為無效熒光28，不能夠為相應的光學器件所捕獲。
[0109]進而，配置預處理光學元件，配置在反射光束光路上，用于反射光束的預處理，預處理受限于后續(xù)的光學轉換器20，加以匹配即可，兩者協(xié)同選型。
[0110]加以匹配的，一光電轉換器20，接收經過預處理的所述反射光束，將光信號轉換成電信號。
[0111]數(shù)據(jù)處理模塊21，輸入連接所述光電轉換器20，對獲得的電信號按照預定的算法計算；以及
[0112]顯示器22，連接所述數(shù)據(jù)處理模塊21，用于輸出顯示計算結果。
[0113]那么，依據(jù)上述結構，首先光源發(fā)出激發(fā)光，激發(fā)光經過濾光片純化后被二向分色鏡反射，經透鏡聚焦到微溝道檢測區(qū)e，激發(fā)留在檢測區(qū)e的信號抗體8或者信號核酸適體11上的熒光分子探針，使其發(fā)出熒光信號，此熒光信號經過光路掩板、透鏡后透過二向分色鏡，經針孔和濾光片純化后被光電轉換器件轉化成電信號，再經過數(shù)據(jù)處理，將與待測靶物質的量顯示在液晶屏上。
[0114]關于二向分光鏡17，具體配置是反射光束與單色光源出射的光路垂直，進而所述采集分析裝置還包括配置在反射光束與單色光源出射的光路匯集處配有二向分光鏡17，對單色光源出射的光線圈反射，而對反射光束全透射；
[0115]相應地，二向分光鏡17介于所述預處理光學元件與所述整形鏡組之間。
[0116]在預處理光學元件與二向分光鏡17之間還配有一針孔元件，如圖12所示的針孔18，用于透過給定截面的光束，而預處理光學元件為第一濾光片19，以獲得匹配光學轉換器20采集所需要波段的光束。
[0117]以及基礎的檢測方法，我們把基底4和成型在基底4上的溝道定義為一個生物芯片，這樣，基底4各端分別匹配設有與各溝道相應相通的進液口和廢液出口。如圖1a所示。通過控制微溝道液體流動，可在生物芯片上實現(xiàn)對液體精確加樣。
[0118]微溝道上設有檢測區(qū)e，檢測區(qū)e內固定有待測靶物質的捕捉抗體6或者捕捉核酸適體10，按照加樣步驟可以在檢測區(qū)形成對待測靶物質的三明治結構，利用探針分子9和納米增敏作用在檢測區(qū)將痕量靶標物質信號轉換成光學或者電學信號。
[0119]具體包括以下步驟:
[0120]I)取一個加樣裝置，并在檢測區(qū)3固定用于捕獲待檢測標志物質的生物芯片。
[0121]2)進而關閉加樣溝道2和輔助溝道5，向檢測溝道I泵入緩沖液，至少灌滿加樣溝道2與輔助溝道5之間的檢測溝道I ;如圖1所示，一般通過觀察是不是有緩沖液從出液口流出來判斷緩沖液的充填狀態(tài)，這種情況需要加滿整個檢測溝道，當然，可以通過流量控制，進行流量與溝道的容量匹配進行控制，在這樣的控制條件下，相關液體不必充滿整個溝道。[0122]3)關閉檢測溝道1，通過加樣溝道2泵入含有待測樣本，輔助溝道5泄流，待測樣本至少灌滿加樣溝道2與輔助溝道5之間的檢測溝道1，該段內的待測樣本構成檢測段，其中待測樣本為含有所述帶檢測標志物質的樣本；如圖Ic所示，Cd段的緩沖液被待測樣本推出，而待測樣本滯留在bcdb’管道內，其中Cd段行成所需要的液段。
[0123]應當理解，關于溝道的啟閉描述在此處只說明關閉，而通過上下文可以清楚地知曉那些溝道開啟。
[0124]4)進而，如圖I所示，關閉加樣溝道2和輔助溝道5，向檢測溝道I泵入緩沖液，把檢測段推送到檢測區(qū)3，并覆蓋檢測區(qū)3 ;圖中不同的剖面線表示了不同的液體，圖中有清楚地表現(xiàn)。
[0125]5)第一結合反應,檢測段內的待測樣本與生物芯片反應第一給定的時間，關于相關液體之間的反應時間，為本領域的技術人員所熟知，對此，不再贅述。
[0126]6)第一結合反應完畢后，使用緩沖液把所述檢測段推出檢測區(qū)，然后關閉檢測溝道。
[0127]7)利用步驟3和4相同的方式，使用信號物質液體替代待測樣本而產生信號段，覆蓋檢測區(qū)3 ;由于信號段液體的獲得方式與檢測段液體的獲得方式一致，再次不再贅述。
[0128]8)第二結合反應，使信號物質與檢測區(qū)經過第一次結合反應產生的物質在第二給定的時間內進行第二次結合反應，產生樣品，形成一種三明治結構，如“固定的捕捉抗體6或捕捉核酸適體10-待測蛋白質-信號抗體8或信號核酸適體11”的三明治結構。
[0129]9)關閉加樣溝道2和輔助溝道5，利用緩沖液通過檢測溝道I把檢測區(qū)完成第二次結合反應后殘余的物質液體推出檢測溝道I。
[0130]10)利用采集分析裝置對檢測區(qū)的樣品進行采集分析。
[0131]所述的生物芯片上的微溝道檢測區(qū)e，固定有待測靶標物質7的捕捉抗體6或者捕捉核酸適體10。當樣本中有待測靶標物質7時，固定在檢測區(qū)e的捕捉抗體6或者捕捉核酸適體10就會捕獲靶標物質7，在加入信號抗體8或者信號核酸適體11后會在檢測區(qū)形成對靶標物質7的三明治結構。如圖2a和圖2b所示。
[0132]本領域的技術人員可參考抗體捕獲法相關的文獻認識三明治結構，由于本文不涉及此類方案的改進，在此不再贅述。
[0133]所述的信號抗體8或者信號核酸適體11是指標記有探針分子9的能夠待測靶標物質7特異性結合的抗體或者核酸適體，所述的探針分子9可以是酶分子、熒光分子或者其它探針分子9。
[0134]在一些實施例中，一個概念我們稱之為納米增敏作用，主要包括以下兩部分內容：
[0135]( I)在檢測區(qū)e修飾納米薄膜層，利用納米材料表面效應實現(xiàn)在檢測區(qū)e固定更多的捕捉抗體6或捕捉核酸適體10，提高對樣本中待測靶物質捕捉能力，從而增加生物芯片的靈敏度。
[0136]納米薄膜通常的概念是納米膜，顆粒膜與致密膜。顆粒膜是納米顆粒粘在一起，中間有極為細小的間隙的薄膜。致密膜指膜層致密但晶粒尺寸為納米級的薄膜。
[0137]納濾（NF)膜的研制與應用較反滲透膜大約晚20年。20世紀70年代J ·Ε -Cadotte研究NS-300膜，即為研究NF膜的開始。[0138]納米膜能夠截留相對分子量為300?100000 (被分離物料粒徑相當于0.3?100納米)的分子，能夠為本案所用。
[0139]“納米貯存單元”可表示為“多個探針分子9修飾在納米粒子上形成的單元體”。其中探針分子9的數(shù)量跟納米粒子的表面積和其表面的官能團有關。一般說來，納米粒子的表面積越大，在其表面修飾的官能團越多，那么探針分子9固定在納米粒子表面的數(shù)量越多。但納米粒子不宜過大，過大的納米粒子會使得信號抗體8或者信號核酸適體11與靶標物質7之間的結合力不足以將信號抗體8或者信號核酸適體11形成的單元體留在檢測區(qū)，反而使檢測信號降低。
[0140](2)設計納米貯存單元對信號抗體8或者信號核酸適體11上標記的探針分子9進行擴增。首先在納米粒子表面修飾親和素，并與生物素化的探針分子9偶聯(lián)，設計不同的枝接方法增加結合位點，使探針分子9在納米粒子表面富集，每一個納米粒子形成包含數(shù)十個或者更多探針分子9的貯存單元(如圖3所示)。
[0141]將納米探針分子9貯存單元修飾在與待測靶物質特異性結合的抗體或者核酸適體上，相比于普通的將單個或者少量探針分子9修飾在抗體或者核酸適體上,在相同條件下，前者可以顯著增加探針分子9在傳感器上的固定量，使傳感器輸出信號放大，從而明顯提高傳感器靈敏度。
[0142]圖4為三種情況的敏感效果比較(僅以發(fā)光探針為例):圖4中(a)為通常的三明治結構；(b)為在檢測區(qū)e修飾高疏松納米薄膜層，利用納米層比表面效應在檢測區(qū)e可以固定更多捕捉抗體6或者捕捉核酸適體10，增加對樣本中靶物質捕捉幾率，提高檢測靈敏度；(c)為在檢測區(qū)e修飾高疏松納米薄膜層的基礎上，采用了圖3所示的納米探針貯存單元，增加了信號強度，提高檢測靈敏度。
[0143]圖5為不同靶物質濃度的樣本通過上述檢測方法得到的檢測結果，檢測對象是腦納肽。腦納肽BNP(Brain natriuretic peptide)是反映心功能衰竭程度的一個重要指標，BNP在血液中含量僅有納克/毫升量級，以樣本中痕量BNP檢測為例，標記探針為發(fā)光探針。
[0144]從圖5中可以看出，依據(jù)上述方法，可以獲得比較高的檢測精度。
[0145]再一個實施例中，取3個生物芯片，其中I號芯片在檢測區(qū)e固定捕捉核酸適體10，2號芯片和3號芯片在檢測區(qū)e修飾高疏松納米薄膜層后再固定捕捉核酸適體10，按照上述加樣方式對生物芯片進行加樣。
[0146]第一，3個生物芯片分別在其a-a’通道通入緩沖液；
[0147]第二，3個生物芯片分別在其b-b’通道通入含有待測BNP的血清樣本；
[0148]第三，3個生物芯片分別在其a-a’通道通入緩沖液，將血清樣本推入檢測區(qū)，在一定條件下與檢測區(qū)固定的捕捉核酸適體10發(fā)生特異性結合；
[0149]第四，特異性結合反應完成之后，3個生物芯片分別在其a-a’通道繼續(xù)通入緩沖液,將血清樣本推出檢測區(qū)；
[0150]第五，I號芯片和2號芯片的b-b’通道通入普通的信號核酸適體11，3號芯片的b-b’通道通入的是修飾納米探針貯存單元的信號核酸適體11 ；
[0151]第六，3個生物芯片分別在其a-a’通道通入緩沖液，將信號核酸適體11推入檢測區(qū)，在一定條件下信號核酸適體11與被捕捉在檢測區(qū)的BNP發(fā)生特異性結合；
[0152]第七，3個生物芯片分別在其a-a’通道通入發(fā)光試劑，在光學檢測儀上對生物芯片檢測區(qū)進行發(fā)光檢測。
[0153]3個生物芯片的檢測結果如圖6所示，①為I號芯片；②為2號芯片；③為3號芯片的檢測結果。
[0154]如圖5所示的不同靶物質濃度的樣本通過本發(fā)明實施例方法檢測實現(xiàn)的痕量靶標物質7的定量檢測效果圖，從結果可以看出，在生物芯片檢測區(qū)修飾納米薄膜層再固定捕捉抗體6或者捕捉核酸適體10，然后使用修飾納米探針貯存單元的信號核酸適體11的生物芯片的信號得到明顯放大，從而實現(xiàn)對痕量靶標物質7的定量測量。
[0155]上述雖然結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內。
【權利要求】
1.一種用于痕量靶標物質測量的檢測方法，其特征是，所使用檢測裝置包括加樣裝置和對加樣裝置所獲得樣品進行檢測的采樣分析裝置，所述檢測方法包括: 1)取一個加樣裝置，并在檢測區(qū)固定用于捕獲待檢測標志物質的生物芯片； 2)關閉加樣溝道和輔助溝道，向檢測溝道泵入緩沖液，至少灌滿加樣溝道與輔助溝道之間的檢測溝道； 3)關閉檢測溝道，通過加樣溝道泵入含有待測樣本，輔助溝道泄流，待測樣本至少灌滿加樣溝道與輔助溝道之間的檢測溝道，該段內的待測樣本構成檢測段，其中待測樣本為含有所述帶檢測標志物質的樣本； 4)關閉加樣溝道和輔助溝道，向檢測溝道泵入緩沖液，把檢測段推送到檢測區(qū)，并覆蓋檢測區(qū)； 5)第一結合反應，檢測段內的待測樣本與生物芯片反應第一給定的時間； 6)第一結合反應完畢后，使用緩沖液把所述檢測段推出檢測區(qū)，然后關閉檢測溝道； 7)利用步驟3)和4)相同的方式，使用信號物質液體替代待測樣本而產生信號段，覆蓋檢測區(qū)； 8)第二結合反應，使信號物質與檢測區(qū)經過第一次結合反應產生的物質在第二給定的時間內進行第二次結合反應，產生樣品； 9)關閉加樣溝道和輔助溝道，利用緩沖液通過檢測溝道把檢測區(qū)完成第二次結合反應后殘余的物質液體推出檢測溝道； 10)利用采集分析裝置對檢測區(qū)的樣品進行采集分析。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征是，所述檢測區(qū)修飾為匹配吸收生物芯片的納米薄膜層。
3.如權利要求2所述的檢測方法，其特征是，所述納米薄膜層表面進一步修飾親和素，以與生物素化的探針分子偶聯(lián)，并通過枝接方法增加結合點，形成貯存單元。
4.如權利要求1至3任一所述的檢測方法，其特征是，所述信號物質為信號抗體或者信號核酸適體，且兩者均標記有探針分子，而探針分子為酶分子或者熒光分子。
5.如權利要求1所述的檢測方法，其特征是，所述加樣裝置包括: 檢測溝道，其下游的一段溝道構造為檢測區(qū)，并至少在檢測區(qū)處留有檢測窗； 加樣溝道，連接于檢測溝道的上游段而構成加樣旁路； 輔助溝道，連接于加樣溝道連接點與檢測區(qū)之間的檢測溝道上，構成用于加樣泄流的旁路；且加樣溝道與輔助溝道之間的檢測溝道長度大于檢測區(qū)的長度； 檢測管路單元，配接于檢測溝道，并設有控制閥； 加樣管路單元組，配接于加樣溝道和輔助溝道，并設有控制閥組； 檢測泵，通過所述檢測管路單元及相應的控制閥接入檢測溝道的上游端，以泵送檢測輔助液； 加樣泵組，通過所述加樣管路單元組及相應的控制閥組接入加樣溝道，以對應泵送加樣液組； 以及控制單元，連接檢測泵、加樣泵及控制閥和控制閥組，以邏輯控制檢測泵、加樣泵組及相配控制閥、控制閥組的動作順序。
【文檔編號】G01N33/48GK103529195SQ201310507020
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權日:2013年10月24日
【發(fā)明者】劉劍 申請人:山東大學