基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法
【專利摘要】基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法，包括以下步驟：①以免疫電極或者核酸適配體電極為工作電極，在空氣中接上電化學(xué)儀器并預(yù)先施加能夠?qū)崿F(xiàn)金屬標(biāo)記物的金屬離子電沉積的陰極電位，再將小體積釋放劑添加至該工作電極表面，并導(dǎo)通電解池，使金屬標(biāo)記物溶解釋放出金屬離子，并繼續(xù)被電還原成原子態(tài)金屬，從而在該工作電極表面富集上金屬層；②直接在原工作電極表面，使用陽極溶出伏安法獲得該工作電極上所富集到的金屬層的陽極溶出電流信號，從而間接實現(xiàn)樣品中目標(biāo)分析物的定量分析。本發(fā)明可用于基于生物親和、金屬標(biāo)記和陽極溶出伏安法的單目標(biāo)分析物檢測與多目標(biāo)分析物多通道檢測。
【專利說明】基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于金屬標(biāo)記和生物親和的電化學(xué)定量分析方法，具體地說，是涉及一種基于生物親和(如免疫、核酸適配體等生物親和類型)、金屬標(biāo)記和陽極溶出伏安分析法對樣品中目標(biāo)分析物進行定量分析的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，免疫分析和核酸適配體分析等基于生物親和原理的生物分析技術(shù)發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于健康和環(huán)保等領(lǐng)域[D.ff.Kimmel, G.LeBlanc, Μ.E.Meschievitz,and D.E.Cliffel, Anal.Chem.2012, 84，685-707]?？梢赃@樣認為，對于指定免疫對的免疫分析法，因免疫體系具有優(yōu)良的特異識別特性而呈現(xiàn)出極好的選擇性，故提高免疫分析的靈敏度已成為創(chuàng)新免疫分析法的關(guān)鍵切入點。因免疫檢測對象(如蛋白質(zhì))大都沒有顯著分析信號的直接輸出，采用信號輸出大的標(biāo)記物進行免疫標(biāo)記已成為免疫分析中的重要策略[X.Yu, B.Munge, V.Patel, G.Jensen, A.Bhirde, J.D.Gong, S.N.Kim, J.Gillespie, J.S.Gutkind, F.Papadimitrakopoulos, J.F.Rusling, J.Am.Chem.Soc.2006, 128，11199-11205]。迄今為止，免疫標(biāo)記采用分子標(biāo)記物(如酶標(biāo)記物)和納米標(biāo)記物。酶標(biāo)記物主要是利用酶的高效催化反應(yīng)特性，將免疫分析物轉(zhuǎn)換成可測的酶反應(yīng)底物或產(chǎn)物而予以靈敏檢出。納米材料如金、銀等金屬納米材料、金屬硫化物(或金屬硒化物、金屬碲化物)等量子點(QDs)、金屬氧化物納米材料、納米硅和納米碳具有獨特的光學(xué)、電學(xué)、電化學(xué)、催化和力學(xué)性質(zhì)，用于免疫標(biāo)記亦可得到高敏的免疫信號輸出[W.ff.Zhao , Z.Y.Ma , P.P.Yu , X.Y.Dong , J.J.Xu, H.Y.Chen, Anal.Chem.2012，84，917-923]。三明治型免疫電分析是重要的免疫分析實驗?zāi)Ｊ?，?yīng)用廣泛。例如，要實現(xiàn)抗原的三明治型免疫電分析，可在電極上修飾一抗，再免疫結(jié)合抗原，再免疫結(jié)合標(biāo)記的二抗，即得到三明治型免疫復(fù)合物修飾的免疫電極。金屬免疫電分析法采用金屬(及其化合物的)納米材料作為標(biāo)記物，這些標(biāo)記物可通過陽極溶出伏安法進行靈敏檢測。金標(biāo)銀染在可視化免疫分析中已得到實際應(yīng)用，在免疫電分析研究中也備受關(guān)注。例如，Chu等用納米金標(biāo)記的抗體催化銀沉積后，用酸將銀溶出，再轉(zhuǎn)移到含有電解質(zhì)溶液的電解池中，用陽極溶出伏安法進行檢測[X.Chu, X.Fu, K.Chen, G.L.Shen, R.Q.Yu, Biosens.Bioelectron.2005, 20, 1805-1812]。類似地，金屬半導(dǎo)體量子點既可用于體內(nèi)外標(biāo)記、生物光分析和生物光學(xué)成像，亦可用于免疫電分析[R.Gill, M.Zayats, 1.ffillner,Angew.Chem.1nt.Ed.2008, 47，7602-7625]。例如，Lu等將量子點標(biāo)記的免疫電極表面的生物復(fù)合物先用酸溶解再轉(zhuǎn)移，進行電化學(xué)檢測[D.L.Lu, J.Wang, L.M.Wang, D.Du, C.Timchalk, R.Barry, Y.H.Lin, Adv.Funct.Mater.2011, 21, 4371-4378]。然而，以往免疫電分析法通常采用先溶解金屬標(biāo)記物再轉(zhuǎn)移溶液進行伏安分析的策略，這樣，不可避免的溶液稀釋限制了金屬免疫電分析的檢測靈敏度，溶液的更換也加大了實驗操作的繁復(fù)性。
[0003]金屬標(biāo)記的核酸適配體電分析也同樣面臨著這些問題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法，該方法可以最大化地將金屬標(biāo)記物轉(zhuǎn)換成為可測信號，對樣品中的目標(biāo)分析物(如蛋白質(zhì))進行定量分析，并且通用性好，操作簡便。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法，包括以下步驟:
①以免疫電極或者核酸適配體電極為工作電極，在空氣中接上電化學(xué)儀器并預(yù)先施加能夠?qū)崿F(xiàn)金屬標(biāo)記物的金屬離子電沉積的陰極電位，再將小體積釋放劑添加至免疫電極或者核酸適配體電極表面，并導(dǎo)通電解池，使金屬標(biāo)記物溶解釋放出金屬離子，并繼續(xù)被電還原成原子態(tài)金屬，從而在免疫電極或者核酸適配體電極表面富集上金屬層；
②直接在原工作電極表面，使用陽極溶出伏安法獲得該工作電極上所富集到的金屬層的陽極溶出電流信號，從而間接實現(xiàn)樣品中目標(biāo)分析物的定量分析。
[0006]進一步，所述釋放劑為能溶解金屬標(biāo)記物的酸。所述小體積釋放劑為I mL?10mL體積的能溶解金屬標(biāo)記物的酸。
[0007]進一步，所述酸的濃度為I mmol/L稀酸?濃酸。
[0008]進一步，所述酸可為硝酸、硫酸、鹽酸、高氯酸、氫氟酸、醋酸或磷酸。
[0009]進一步，所述酸優(yōu)選硝酸，硝酸的濃度優(yōu)選0.01 mol/r6 mol/L。溶解銀納米粒子的硝酸濃度優(yōu)選I mol/L，溶解硫化鎘量子點的硝酸濃度優(yōu)選0.06 mol/L。
[0010]進一步,所述金屬標(biāo)記物的生物復(fù)合物的制備步驟為:將金屬納米粒子、金屬硫化物納米粒子、金屬氧化物納米粒子、金屬硒化物納米粒子或金屬締化物納米粒子與生物配體結(jié)合，形成生物復(fù)合物，所述生物復(fù)合物對樣品中目標(biāo)分析物具有生物親和性。
[0011]進一步，所述生物配體為抗原或抗體，或蛋白質(zhì)，或核酸適配體。例如，可以將金屬納米粒子與抗體或抗原結(jié)合，形成生物復(fù)合物；再將待測的抗體或抗原與該生物復(fù)合物結(jié)合，形成免疫電極。也可以是，將金屬納米粒子與核酸適配體結(jié)合，形成生物復(fù)合物，再將待測的凝血酶與該生物復(fù)合物結(jié)合，形成核酸適配體電極。
[0012]進一步，所述空氣中預(yù)先施加的能夠?qū)崿F(xiàn)金屬標(biāo)記物的金屬離子電沉積的陰極電位為足夠?qū)崿F(xiàn)擴散控制的金屬電沉積的陰極電位。所述足夠?qū)崿F(xiàn)擴散控制的金屬電沉積的陰極電位為1.0 V (vs.SCE)?-2.0 V (vs.SCE)?！皏s.SCE”意為相對于飽和甘汞電極的電位。
[0013]進一步，使用陽極溶出伏安法對金屬離子進行定量分析時，采用2組或2組以上電極，每組電極之間形成一個測量通道；每組電極為兩電極或三電極體系。
[0014]進一步，所述目標(biāo)分析物可為蛋白質(zhì)。
[0015]本發(fā)明的有益效果:(I)陰極電位的預(yù)先施加，小體積的釋放劑如酸溶解液的使用，促使金屬沉積擴散層的厚度趨于最小化，這樣，金屬標(biāo)記物能以最大的富集效率被“捕獲”到工作電極表面，因而顯著改善了電化學(xué)信號輸出，極大地提高了檢測靈敏度；(2)在免疫電極或核酸適配體電極原位的微量溶液中，進行陽極溶出伏安分析，減小了常規(guī)法中轉(zhuǎn)移過程中分析信號的損失，并且簡化了操作步驟。
[0016]經(jīng)實驗證明，本發(fā)明與常規(guī)法相比，本發(fā)明的金屬標(biāo)記物的陰極富集效率可提高82倍左右。對人免疫球蛋白(hlgG)、癌胚抗原(hCEA)、甲胎蛋白(hAFP)和凝血酶的分析檢測實驗表明，本發(fā)明具有跨7個數(shù)量級左右的寬線性范圍，檢測下限低至fg/mL或fmol/L濃度級，顯著優(yōu)于文獻報道值。本發(fā)明用于實際樣品檢測亦獲滿意結(jié)果。本發(fā)明用于電極組多通道同時檢測，也同樣獲得很好的效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明方法的實驗步驟示意圖。
[0018]圖2 (Al)為實施例1中本發(fā)明方法在金納米顆粒(Au NPs)標(biāo)記的hlgG免疫電極上，采用差分脈沖陽極溶出伏安法檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的原圖。
[0019]圖2 (A2)為實施例1中常規(guī)方法在金納米顆粒(Au NPs)標(biāo)記的hlgG免疫電極上，采用差分脈沖陽極溶出伏安法檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的原圖。
[0020]圖2 (A3)為實施例1中本發(fā)明方法(A3-1)和常規(guī)方法(A3-2)在金納米顆粒(AuNPs)標(biāo)記的hlgG免疫電極上檢測得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0021]圖2 (BI)為實施例1中本發(fā)明方法在CdS QDs標(biāo)記的hlgG免疫電極上，采用差分脈沖陽極溶出伏安法檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的原圖。
[0022]圖2 (B2)為實施例1中常規(guī)方法在CdS QDs標(biāo)記的hlgG免疫電極上，采用差分脈沖陽極溶出伏安法檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的原圖。
[0023]圖2 (B3)為實施例1中本發(fā)明方法(B3-3)和常規(guī)方法(B3-4)在CdS QDs標(biāo)記的hlgG免疫電極上檢測得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0024]圖3 (A)為實施例2中本發(fā)明法采用Au NPs標(biāo)記的核酸適配體電極上檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的原圖。
[0025]圖3 (B)為實施例2中本發(fā)明法采用Au NPs標(biāo)記的核酸適配體電極上檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0026]圖3 (C)為實施例2中常規(guī)方法采用CdS QDs標(biāo)記的核酸適配體電極上檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的原圖。
[0027]圖3 (D)為實施例2中常規(guī)方法采用CdS QDs標(biāo)記的核酸適配體電極上檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0028]圖4為絲網(wǎng)印刷電極的模型圖。其中Cl和C2為對電極，Rl和R2為參比電極，Wl和W2為工作電極。
[0029]圖5 (A)為實施例3中采用金標(biāo)銀染的癌胚抗原(hCEA)免疫電極組及本發(fā)明方法測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0030]圖5 (B)為實施例3中采用金標(biāo)銀染的甲胎蛋白(hAFP)免疫電極組及本發(fā)明方法測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
【具體實施方式】
[0031]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0032]參考例:
1.以下實施例1使用的免疫電極和納米材料按照以下方法制備:
實施例1使用的金納米粒子(AuNPs)標(biāo)記的二抗、CdS量子點(CdS QDs)標(biāo)記的二抗(Ab2-CdS)、免疫電極按照下述方法制備:
(I)AuNPs標(biāo)記的二抗的制備(Ab2-AuNPs):在100 mL沸水中，劇烈攪拌下，加入250 mL4% (質(zhì)量濃度)的HAuCl4，再逐滴滴加1% (質(zhì)量濃度)的檸檬酸鈉2.5 mL,當(dāng)溶液變成酒紅色后，再加熱15 mirio停止加熱后，攪拌冷卻至室溫。在I mL的金膠中加入30 mg的二抗(Ab2),吸附過夜。4800 rpm低速離心30 min后,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩次。最后，結(jié)合物再次分散在含有1%牛血清白蛋白(BSA)的I mL 0.1 mol/L PBS中，增加免疫金膠的穩(wěn)定性，減小分析中的非特異性吸附。未使用時，制備的Ab2-AuNPs保存于冰箱(4 0C)中。
[0033](2) CdS QDs (CdS納米粒子)標(biāo)記的二抗的制備(Ab2-CdS):向50 mL燒杯中依次加入 10 mL 0.01 mol/L Cd (CH3COO) 2 溶液和 5 mL 0.01 mol/L CH3CSNH2 溶液，混合均勻，再緩慢滴加0.3 mL 0.1 mol/L六偏磷酸鈉溶液作為穩(wěn)定劑。然后用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)初始pH值為9.5，在滴加NaOH溶液的同時劇烈攪拌，反應(yīng)約I h左右，有淡黃色的CdS納米粒子溶膠生成。I h后，向乳黃色的溶膠中加入2.5 mL的0.70 mg/L半胱氨酸溶液，置入容量瓶中，放置24 h后備用。取1.5 mL功能性CdS納米粒子于試管中，向其加入50 mL
0.10 mol/L的EDC-HCl (1-乙基_(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)和50 mL 0.10mol/L的NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)，室溫下反應(yīng)I h后，用緩沖液徹底地清洗以除去過量的EDC和NHS。接著，在試管中加入20 mL I mg/mL 二抗于4 °C下反應(yīng)20 h，用緩沖液清洗除去物理吸附的抗體。然后，在試管中加入150 mL 3% BSA, 4 °C下2 h，封閉非特異性結(jié)合位點。未使用時，制備的Ab2-CdS保存于冰箱(4 0C)中。
[0034](3)免疫電極的制備:玻碳電極(GCE)先后在0.5和0.05 mm的氧化鋁懸濁液中打磨拋光處理，再用超純水充分地沖洗電極表面，接下來分別在超純水、乙醇、超純水中各超聲5 min以除去電極表面殘留的氧化鋁粉末；然后，在電極表面滴加濃H2SO4洗液并保持15 S，用超純水沖洗；最后用電化學(xué)清洗以徹底除去污染物。電化學(xué)清洗步驟為:在10 mL0.50 mol/L H2SO4中以-1.0 V到1.0 V以0.1 V/s的掃速循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定。處理好的玻碳電極用大量水沖洗，然后用氮氣吹干用于電沉積Auplate;。
[0035]通過雙電位階躍法將Auplate沉積到處理好的玻碳電極上，即在含有2.0 mmol/LHAuCl4 的 0.50 mol/L H2SO4 中，從 1.1 V 至 0 V 脈沖電鍍 180 s (Auplate/GCE)即可。將電極洗凈，氮氣吹干，迅速將6.0 含有1.0 mg/mL 一抗(Ab1)的PBS溶液滴至Auplate/GCE電極上，冰箱(4 °C)保存、過夜，以保證抗體在電極表面的飽和吸附，得到Abi/AiVw/GCE修飾電極。將電極依次用PBS溶液清洗、吹干后，將6.0 含有3% BSA的PBS溶液滴至電極上，4 °C保持I h以封閉非特異性吸附位點，得到BSA/Ab/AUpuyGCE修飾電極。未使用時，電極保存在4中。
[0036]將制備好的BSA/Ab1/Auplate/GCE修飾電極，滴加6.0 含有 5 fg/mL、50 fg/mL、500 fg/mL、5 pg/mL、50 pg/mL、500 pg/mL、5 ng/mL、50 ng/mL 或 500 ng/mL 不同濃度抗原(hlgG，人免疫球蛋白G)的PBS，在37 °C下溫育1 h，然后用PBS溶液清洗電極表面，得到hlgG/BSA/AtVAu—e/GCE修飾電極，該修飾電極上再滴加6 mL含Ab2-AuNPs或Ab2-CdS的 PBS 溶液于 37 °C 下溫育 40 min，得到 AbfAuNPs/hlgG/BSA/AtVAplate/GCE 或 Ab2-CdS/hlgG/BSA/Ab/AUplate/GCE電極。(AbpAb2為羊抗人免疫球蛋白G)。
[0037]免疫電極的金標(biāo)銀染步驟如下AbfAuNPs/hlgG/BSA/Ab/Aumte/GCE電極用PBS溶液充分清洗，以除去非特異性吸附的二抗，待干后，滴加6.0 mL的銀增強溶液(組分:1.0g 對苯二酚，35 mg 硝酸銀，50 mL pH 3.5 檸檬酸緩沖液(0.243 mol/L C6H8O7XH2CH0.163mol/L Na3C6H5O7X 2H20)和50 mL去離子水)，暗反應(yīng)30 min，用超純水洗凈，吹干。
[0038]2.實施例2使用的核酸適配體電極按照以下方法制備:
實施例使用的AuNPs-核酸適配體1、CdS-核酸適配體1、核酸適配體電極按照下述方法制備:
(I)制備AuNPs-核酸適配體1:在500 mL AuNPs溶液中滴加10 mL 100 mmol/L巰基化凝血酶核酸適配體I，室溫下混合4 h后,加入PBS反應(yīng)16 ho 1000 rpm離心15 min,隨后用BSA封閉非特異性吸附位點，用Tris-HCl充分洗滌，儲存于冰箱中(4 0C)備用。
[0039](2)制備CdS-核酸適配體1:在半胱氨酸修飾的CdS溶液中依次加入10 mmol/L的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺碳二亞胺(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)；反應(yīng)I h以激活-C00H官能團，加入I mmol/L核酸適配體I，反應(yīng)24 h以使含胺基的核酸適配體I通過酰胺反應(yīng)固定至CdS表面；最后，將所得CdS-核酸適配體I用Tris-HCl充分洗滌，儲存于冰箱中(4 0C)備用。
[0040](3)制備金標(biāo)銀染的三明治型凝血酶核酸適配體電極:納米金標(biāo)記的核酸適配體電極的制備。玻璃碳電極的處理與實施例1 一致，將10 mL I mmol/L的巰基化凝血酶核酸適配體II溶液滴于Auplate/GCE電極上，反應(yīng)16 h ;接下來用100 mmol/L的BSA溶液(Tris-HCl緩沖液配制)封閉電極上的非特異性吸附位點；隨后將所制電極在I fmol/L、3fmol/L、5 fmol/L、10 fmol/L、100 fmol/L、I pmol/L、10 pmol/L、100 pmol/L、l nmol/L 或
10nmol/L不同濃度的凝血酶溶液(Tris-HCl緩沖液配制)中溫育2 h ;最后將制備的電極浸入AuNPs-核酸適配體I溶液中溫育2 h，得到的電極銀染30 min (金標(biāo)銀染步驟同前)。每一步驟后，均用PBS徹底清洗電極并用氮氣小心吹干。
[0041](4)制備量子點標(biāo)記的核酸適配體電極。將2.5 mL 0.25%的殼聚糖滴于玻璃碳電極(GCE)上，干燥后滴加2.5 mL 2.5%的戊二醛反應(yīng)2 h，然后滴加10 mL I mmol/L氨基修飾的核酸適配體II進行反應(yīng)60 min，然后置于冰箱中過夜；接下來用100 mmol/L的BSA溶液(Tris-HCl緩沖液配制)封閉電極上的非特異性吸附位點；隨后將所制電極在I fmol/L、3 fmol/L、5 fmol/L、10 fmol/L、100 fmol/L、I pmol/L、10 pmol/L、100 pmol/L、l nmol/L或10 nmol/L不同濃度的凝血酶溶液(Tris-HCl緩沖液配制)中溫育2 h ;最后將制備的電極浸入CdS-核酸適配體I溶液中溫育2 h，得到所需核酸適配體電極。每一步驟后，均用PBS徹底清洗電極并用氮氣小心吹干。
[0042]3.實施例3使用的免疫電極組按照以下方法制備:
與實施例1中金標(biāo)銀染免疫電極制備過程相同，抗原抗體分別為人癌胚抗原(hCEA)和人甲胎蛋白(hAFP)即對應(yīng)的抗體。反應(yīng)過程中滴加的不同濃度抗原均為4 fg/mL,40 fg/mL、400 fg/mL、4 pg/mL、40 pg/mL、400 pg/mL、4 ng/mL>40 ng/mL 或 400 ng/mL。工作電極為圖4所示的幾何面積為2 mm2的絲網(wǎng)印刷碳電極，用雙通道同時進行檢測。各通道分別采用三電極系統(tǒng)檢測。
[0043]實施例1:免疫電分析
本實施例為基于免疫親和、金屬標(biāo)記和陽極溶出伏安法的檢測目標(biāo)分析物hlgG的電分析，比較本發(fā)明方法與常規(guī)檢測方法在免疫電極中的響應(yīng)。
[0044]本實施例包括以下步驟:1.金標(biāo)銀染免疫分析: (I)本發(fā)明方法:①在三電極系統(tǒng)中(工作電極為上述參考例中的金標(biāo)銀染的免疫電極)，空氣中接上電化學(xué)儀器并預(yù)先施加能夠充分實現(xiàn)金標(biāo)銀染的金屬Ag離子電沉積的陰極電位-0.3 V (vs.SCE)，再將8 mL I mol/L HNO3加至免疫電極表面并導(dǎo)通電解池，使金屬標(biāo)記物溶解為Ag+,并同時將Ag+電還原成原子態(tài)金屬Ag,從而在免疫電極表面富集上金屬銀。②直接在原工作電極表面，使用差分脈沖陽極溶出伏安法(DPV)檢測金屬銀陽極溶出為銀離子的信號，檢測條件為:-0.3 V (vs.SCE (飽和甘汞電極))沉積10 min，掃描區(qū)間為-0.3~0.7 V，獲得該工作電極上所富集到的金屬銀的陽極溶出電流信號，從而間接實現(xiàn)樣品中目標(biāo)分析物hlgG的定量分析。
[0045](2)常規(guī)檢測法:①在上述參考例中的金標(biāo)銀染的免疫電極上，滴加8 mL I mol/L HNO3溶解電極表面的金屬銀，使金屬銀溶解為Ag+，反應(yīng)30 min待金屬銀全部溶解后，將溶液轉(zhuǎn)移到含有0.1 mol/L的KNO3和0.6 mol/L HNO3、體積為992 mL電解質(zhì)溶液中。②連接好線路，固定燒杯以及各電極、磁力攪拌子的位置，用Auplato/GCE電極對溶解得到的銀離子進行DPV定量，檢測條件為:-0.3 V (vs.SCE (飽和甘汞電極))沉積10 min (溶液前面攪拌，后50 s溶液靜置)，掃描區(qū)間為-0.3~0.7 V。每次測量后，電極在+ 1.0 V (vs.SCE)處極化2 min,清洗電極。
[0046]2.CdS QDs標(biāo)記的免疫分析:
(I)本發(fā)明方法:①在三電極系統(tǒng)中(工作電極為上述參考例中的CdS QDs標(biāo)記的免疫電極)，空氣中接上電化學(xué)儀器并預(yù)先施加能夠充分實現(xiàn)金屬標(biāo)記物的金屬Cd離子電沉積的陰極電位-1.0 V (vs.SCE)，再將5 mL 0.06 mol/L HNO3加至免疫電極表面并導(dǎo)通電解池，使金屬標(biāo)記物溶解為Cd2+，并同時將Cd2+陰極還原成原子態(tài)金屬Cd，從而在免疫電極表面富集上金屬鎘。②直接在原工作電極表面，使用差分脈沖陽極溶出伏安法(DPV)檢測金屬鎘陽極溶出為Cd2+的信號，檢測條件為:-1.0 V (vs.SCE (飽和甘汞電極))沉積500 s,掃描區(qū)間為-1.0~-0.45 V，獲得該工作電極上所富集到的金屬鎘的陽極溶出電流信號，從而間接實現(xiàn)樣品中目標(biāo)分析物hlgG的定量分析。
[0047](2)常規(guī)檢測法:①在上述參考例中的CdS QDs標(biāo)記的免疫電極上，滴加5 mL 0.06mol/L HNO3溶解電極表面的CdS QDs，使CdS QDs溶解為Cd2+，待全部溶解為Cd2+后，將溶液轉(zhuǎn)入含有995 mL 0.1 mol/L的醋酸緩沖液(pH=4.5)的電解質(zhì)溶液中。②連接好線路，固定燒杯以及各電極、磁力攪拌子的位置，用Auplat^GCE電極對溶解得到的Cd2+進行DPV定量，檢測條件為:在-1.0 V (vs.SCE)電位下富集500 s (前面攪拌，后50 s溶液靜置)，每次測量后，電極在+ 0.6 V (vs.SCE)處極化200 S，清洗電極。
[0048]測定結(jié)果分析:結(jié)合圖2進行討論。圖2給出了兩種方法中兩種不同標(biāo)記物構(gòu)建的免疫電極對不同濃度抗原的信號響應(yīng)。從圖中可知，隨著抗原濃度增加，電流響應(yīng)也隨之增加；對于同一抗原濃度，本發(fā)明法的響應(yīng)信號明顯大于常規(guī)法。本發(fā)明中電流與抗原濃度線性范圍為5 fg/mL~500 ng/mL，AuNPs和CdS QDs標(biāo)記的檢測限分別為1.2 fg/mL和4.5fg/mL (信噪比為3),而常規(guī)方法檢測線則分別為0.1 pg/mL和0.4 pg/mL。本發(fā)明方法線性范圍寬，檢測限低，顯著優(yōu)于常規(guī)檢測方法。
[0049]實施例2:基于本發(fā)明方法的核酸適配體電分析
本實施例為基于核酸適配體親和、金屬標(biāo)記和陽極溶出伏安法的檢測凝血酶的電分析，用本發(fā)明的技術(shù)方案得到核酸適配體電極中的響應(yīng)。
[0050]本實施例包括以下步驟:
樣品測定:
1.金標(biāo)銀染的核酸適配體分析:
本發(fā)明方法:與實施例1中的“金標(biāo)銀染免疫分析”中的“本發(fā)明方法”的實施步驟相同。
[0051]2.CdS QDs標(biāo)記的核酸適配體分析:
本發(fā)明方法:與實施例1中的“CdS QDs標(biāo)記的免疫分析”中的“本發(fā)明方法”的實施步驟相同。
[0052]測定結(jié)果分析:結(jié)合圖3進行討論。圖3給出了本發(fā)明方法所測的核酸適配體電極對不同濃度凝血酶的信號響應(yīng)。從圖中可知，隨著凝血酶濃度增加，電流響應(yīng)也隨之增力口，線性范圍為I fmol/L?10 nmol/L。金標(biāo)銀染和CdS QDs標(biāo)記的核酸適配體分析得到的凝血酶濃度檢測限分別為0.3 fmol/L和0.9 fmol/L (信噪比為3)。本發(fā)明方法檢測金屬標(biāo)記的核酸適配體電極線性范圍寬，檢測限低。優(yōu)于常規(guī)的檢測方法。
[0053]實施例3:基于同時檢測癌胚抗原(hCEA)和甲胎蛋白(hAFP)兩種目標(biāo)分析物的金標(biāo)銀染免疫電極組的本發(fā)明方法
樣品測定:與實施例1中的“金標(biāo)銀染免疫分析”中的“本發(fā)明方法”的實施步驟相同。測試條件中添加釋放劑5 mL I mol/L ΗΝ03。
[0054]測定結(jié)果分析:結(jié)合圖5進行討論。圖5給出了本發(fā)明基于電極組陽極溶出伏安法檢測不同濃度抗原的金標(biāo)免疫電極的信號響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。從圖中可知，隨著抗原濃度增加，電流響應(yīng)也隨之增加，hCEA和hAFP的線性范圍為4 fg/mL?400 ng/mL，檢測下限分別為2.8 fg/mL和3.0 fg/mL。本發(fā)明可用于多種分析物以及不同濃度的分析物的同時檢測。方便快捷，節(jié)省時間，優(yōu)于常規(guī)的檢測方法。
[0055]綜上所述，本發(fā)明涉及的分析方法靈敏度高、操作簡便、通用性好，在實際血樣中的檢測結(jié)果令人滿意，可廣泛用于基于生物親和、金屬標(biāo)記和陽極溶出伏安法的單目標(biāo)分析物檢測與多目標(biāo)分析物多通道檢測。
【權(quán)利要求】
1.基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法，其特征在于，包括以下步驟: ①以免疫電極或者核酸適配體電極為工作電極，在空氣中接上電化學(xué)儀器并預(yù)先施加能夠?qū)崿F(xiàn)金屬標(biāo)記物的金屬離子電沉積的陰極電位，再將小體積釋放劑添加至該工作電極表面，并導(dǎo)通電解池，使金屬標(biāo)記物溶解釋放出金屬離子，并繼續(xù)被電還原成原子態(tài)金屬，從而在該工作電極表面富集上金屬層； ②直接在原工作電極表面，使用陽極溶出伏安法獲得該工作電極上所富集到的金屬層的陽極溶出電流信號，從而間接實現(xiàn)樣品中目標(biāo)分析物的定量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法，其特征在于，所述釋放劑為能溶解金屬標(biāo)記物的酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法，其特征在于，所述酸的濃度為I mmol/L稀酸~濃酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法，其特征在于，所述能溶解金屬標(biāo)記物的酸為硝酸、硫酸、鹽酸、高氯酸、氫氟酸、醋酸或磷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法，其特征在于，所述硝酸的濃度為0.01mol/L^6mol/Lo
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法，其特征在于，所述小體積釋放劑為ImL~IOmL體積的能溶解金屬標(biāo)記物的酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6之一所述基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法，其特征在于，所述金屬標(biāo).記物的生物復(fù)合物的制備步驟為:將金屬納米粒子、金屬硫化物納米粒子、金屬氧化物納米粒子、金屬硒化物納米粒子或金屬締化物納米粒子與生物配體結(jié)合成生物復(fù)合物，所述生物配體為抗原或抗體，或蛋白質(zhì)，或核酸適配體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1~6所述基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法，其特征在于，所述空氣中預(yù)先施加的能夠?qū)崿F(xiàn)金屬標(biāo)記物的金屬離子電沉積的陰極電位為足夠?qū)崿F(xiàn)擴散控制的金屬電沉積的陰極電位。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法，其特征在于，所述足夠?qū)崿F(xiàn)擴散控制的金屬電沉積的陰極電位為1.0 V~-2.0 V;所述電位為相對于飽和甘萊電極的電位。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~6之一所述基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法，其特征在于，使用陽極溶出伏安法對金屬離子進行定量分析時，采用2組或2組以上電極，每組電極之間形成一個測量通道；每組電極為兩電極或三電極體系。
【文檔編號】G01N27/327GK103472123SQ201310459224
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】謝青季, 覃曉麗, 傅迎春, 陳超, 譚月明, 黃毅, 部麗娟 申請人:湖南師范大學(xué)