一種快速三維超分辨率顯微方法和裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于超分辨領(lǐng)域，尤其涉及一種能在遠(yuǎn)場快速實現(xiàn)三維超衍射極限分辨率 的方法和裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 光學(xué)顯微成像是一種常用的、有效的觀測亞微米級微觀結(jié)構(gòu)的手段，然而光學(xué)衍 射極限的存在極大限制了光學(xué)顯微成像的分辨率。根據(jù)阿貝衍射極限原理，理想點光源經(jīng) 過顯微物鏡聚焦后不是成一個理想像點，而是一個衍射光斑，其尺寸用衍射斑強度分布曲 線的半高全寬
來衡量，式中λ為顯微鏡所使用的照明光波長，NA為所使用顯微物 鏡的數(shù)值孔徑，由于NA = n sina，式中η是被觀察物體與物鏡之間介質(zhì)的折射率，α是物鏡孔 徑角(物鏡光軸上的物點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度)的一半，ΝΑ值約為1，因此 衍射斑尺寸最小約為工作波長的一半，這也是常規(guī)光學(xué)顯微成像的極限分辨率。對于更加 精細(xì)、微小的微觀結(jié)構(gòu)，常規(guī)光學(xué)顯微成像的方法就有所受限。
[0003] 1990年共聚焦顯微鏡的提出，是光學(xué)顯微領(lǐng)域的一次革命。共聚焦顯微鏡利用一 個小孔進行空間濾波，能夠?qū)⒎直媛侍岣?倍，且能提高顯微圖像的信噪比和對比度，另外， 共聚焦顯微鏡還有光學(xué)切片能力，使高精度三維成像變?yōu)榭赡堋ｋm然共聚焦顯微鏡仍受到 光學(xué)衍射極限的限制，但它是后來提出的很多超越衍射極限的光學(xué)顯微方法的基礎(chǔ)。
[0004] 在共聚焦顯微鏡提出后二十年里，有多種超分辨光學(xué)顯微方法被提出，比如結(jié)構(gòu) 光照明焚光顯微術(shù)（SIM:Structured Illumination Microscopy)、光活化定位顯微術(shù) (PALM:Photo_activated Localization Microscopy)、隨機光場重建顯微術(shù)（STORM: Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)、受激發(fā)射損耗顯微術(shù)（STED: Stimulated Emission Depletion Microscopy)、焚光受激微分顯微術(shù)(FED:Fluorescence Emission Difference Microscopy)等。其中焚光受激微分顯微術(shù)(FED)是最近提出的一種 新穎的超分辨成像手段，它在共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上，利用兩種不同模式的激發(fā)光激發(fā)產(chǎn) 生熒光圖像的強度差異實現(xiàn)超分辨，是一種差值成像法。差值成像法是在數(shù)十年前被提出 的，通過相同激發(fā)光下不同尺寸小孔收集的共焦信號差異，可以提高一定程度的分辨率，但 此種方法的信噪比比較低。為了克服此缺陷，科研工作者提出了熒光受激微分顯微術(shù)和激 光模式切換顯微術(shù)(SLAM:Switching Laser Mode Microscopy)，通過利用相同尺寸小孔、 不同模式的激發(fā)光下收集到的熒光信號差異實現(xiàn)超分辨。熒光受激微分顯微術(shù)采用橫向不 同強度分布的兩種模式的激發(fā)光交替照明熒光樣品，一種是實心光斑，另一種是面包圈狀 的中空光斑，其中心是一個尺寸小于衍射極限的暗斑，通過差值消除邊緣激發(fā)的信號光，提 取中心小于衍射極限區(qū)域激發(fā)的信號光，繼而達到超越衍射極限的分辨率。
[0005] 例如，現(xiàn)有公開號為CN 102735617 A的專利文獻公開了一種超分辨顯微方法，包 括:將激光器發(fā)出的激光光束準(zhǔn)直后轉(zhuǎn)換為線偏振光;線偏振光經(jīng)第一次相位調(diào)制后進行 光路偏轉(zhuǎn);偏轉(zhuǎn)后的光束經(jīng)聚焦和準(zhǔn)直后轉(zhuǎn)換為圓偏振光投射到待測樣品上，收集待測樣 品各掃描點發(fā)出的信號光，得到第一信號光強;切換調(diào)制函數(shù)，對線偏振光進行第二次相位 調(diào)制后投射到待測樣品上，收集待測樣品各掃描點發(fā)出的信號光，得到第二信號光強;計算 有效信號光強，并得到超分辨圖像;該顯微方法僅可實現(xiàn)二維成像。
[0006] 熒光受激顯微術(shù)具有低功耗、弱漂白、成快像、光路簡單等優(yōu)點，但當(dāng)其應(yīng)用于三 維超分辨率顯微成像時，需要將激發(fā)光分為三路分別調(diào)制，再將調(diào)制完畢的三路光進行合 束，這無疑大大增大了光學(xué)顯微系統(tǒng)的空間復(fù)雜度。另外，還需要設(shè)計三路快門開關(guān)控制激 發(fā)光模式的切換，也大大增大了顯微系統(tǒng)的時間復(fù)雜度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種快速三維超分辨顯微方法和裝置，可以在遠(yuǎn)場快速實現(xiàn)三維的 超越衍射極限的分辨率;該種方法和裝置具有成像速度快、三維成像、裝置簡易、分辨率高 等特點，可以很好的應(yīng)用于熒光樣品的檢測之中。
[0008] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
[0009] 一種快速三維超分辨率顯微方法，包括以下步驟：
[0010] 1)將激光器發(fā)出的激光光束準(zhǔn)直后轉(zhuǎn)換為線偏振光；
[0011] 2)對所述線偏振光進行相位調(diào)制，調(diào)制函數(shù)為
，其中p為光束上某點與 光軸的距離，Φ為光束垂直光軸剖面內(nèi)位置極坐標(biāo)矢量與X軸的夾角；
[0012] 3)將所述相位調(diào)制后的線偏振光進行光路偏轉(zhuǎn)；
[0013] 4)偏轉(zhuǎn)后的光束轉(zhuǎn)換為圓偏振光經(jīng)準(zhǔn)直和聚焦后投射到待測樣品上，以實現(xiàn)對待 測樣品的二維掃描，沿z軸方向移動待測樣品，以實現(xiàn)對待測樣品的三維掃描；
[0014] 5)在三維掃描過程中收集所述待測樣品各掃描點發(fā)出的信號光，濾去雜散光得到 第一信號光強Ii(x，y，z)，其中X，y，z為掃描點的三維坐標(biāo)；
[0015] 6)對步驟2)中所述線偏振光的s光分量進行相位調(diào)制，調(diào)制函數(shù)為.（(A的= <?，其 中P為光束上某點與光軸的距離，9為光束垂直光軸剖面內(nèi)位置極坐標(biāo)矢量與X軸的夾角；
[0016] 7 )對步驟2 )中所述線偏振光的ρ光分量進行相位調(diào)制，調(diào)制函數(shù)為
，其中Ρ為光束上某點與光軸的距離，PQ為光束半徑，Φ為光束垂直 光軸剖面內(nèi)位置極坐標(biāo)矢量與X軸的夾角；
[0017] 8)重復(fù)步驟3)和步驟4)，對步驟5)中的各掃描點進行第二次掃描，收集得到的第 二信號光強I 2(x，y，z)，其中x，y，z為掃描點的三維坐標(biāo)；
[0018] 9)根據(jù)公式1(1，7,2) = 11(1，7,2)-丫12(1，7,2)計算有效信號光強1(1，7,2)，并利 用I(x，y，z)得到超分辨圖像，其中，
為第一信號光強ΙΚχ,Υ,ζ)中的最大值， /Γχ為第二信號光強12(1，7,2)中的最大值。
[0019] 本發(fā)明中，待測樣品上的x，y，z軸方向由三維掃描方向決定。
[0020] 其中，所述有效信號光強I (X，y，Z)為負(fù)值時，將其設(shè)為零值。
[0021]本發(fā)明提供一種快速三維超分辨顯微裝置，包括光源、承載待測樣品平臺和將光 線投射到所述樣品平臺的顯微物鏡等，所述光源與顯微物鏡之間依次設(shè)有：
[0022]用于將所述激光光束濾波和準(zhǔn)直的單模光纖和準(zhǔn)直透鏡；
[0023 ]用于將所述濾波和準(zhǔn)時后的激光光束轉(zhuǎn)變?yōu)榫€偏振光的起偏器；
[0024] 用于調(diào)節(jié)所述線偏振光s光和p光分量比例的1/2波片；
[0025] 用于對所述線偏振光s光分量進行相位調(diào)制的空間光調(diào)制器；
[0026] 用于對所述線偏振光p光分量進行相位調(diào)制的空間光調(diào)制器；
[0027] 用于對所述相位調(diào)制后的光束進行光路偏轉(zhuǎn)的掃描振鏡系統(tǒng)；
[0028] 用于對所述掃描振鏡系統(tǒng)的出射光束進行聚焦和準(zhǔn)直的掃描透鏡和場鏡；
[0029] 用于將準(zhǔn)直之后的光束轉(zhuǎn)換為圓偏振光的1/4波片；
[0030] 所述圓偏振光通過所述顯微物鏡投射到所述待測樣品上。
[0031] 所述待測樣品固定在納米位移平臺上，用于對所述待測樣品進行軸向掃描。
[0032] 并設(shè)有用于控制所述空間光調(diào)制器、掃描振鏡系統(tǒng)和納米位移平臺的控制器及收 集所述待測樣品發(fā)出的信號光的探測系統(tǒng)。
[0033]探測系統(tǒng)包括：
[0034] 布置在空間光調(diào)制器和掃描振鏡系統(tǒng)之間的二色鏡；
[0035] 用于濾去通過二色鏡信號光中的雜散光的帶通濾波片；
[0036]用于探測信號光束光強信號的探測器，所述探測器選用雪崩二極管(APD);
[0037] 用于將所述濾光過的信號光束聚焦到探測器上的會聚透鏡；
[0038] 用于對所述信號光束進行空間濾波的空間濾波器，其位于所述聚焦透鏡的焦平面 處，所述空間濾波器可以采用針孔或多模光纖，若采用針孔，所用針孔的直徑應(yīng)小于一個艾 里斑的直徑；
[0039] 所述兩個空間光調(diào)制器分別具有可切換的第一調(diào)制函數(shù)
和第二調(diào)制 函數(shù)
，其中P為光束上某點與光軸的距離，PQ為光束 半徑，Φ為光束垂直光軸剖面內(nèi)位置極坐標(biāo)矢量與X軸的夾角。
[0040] 本發(fā)明中，所述兩個空間光調(diào)制器的調(diào)制函數(shù)的切換頻率與掃描振鏡系統(tǒng)的幀掃 描頻率相同，從而實現(xiàn)掃描振鏡系統(tǒng)每掃描一幀圖像，兩個空間光調(diào)制器的調(diào)制函數(shù)均切 換一次。
[0041] 優(yōu)選的，所述顯微物鏡的數(shù)值孔徑選擇NA= 1.4。
[0042] 本發(fā)明的原理如下：
[0043]根據(jù)阿貝衍射理論，傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡受限于光學(xué)衍射極限，分辨能力無法突破照 明光波長的一半。平行的照明光束經(jīng)過物鏡聚焦后，在焦平面附近形成一個具有一定體積 的橢球狀光斑，而不是理想的一個像點，在焦平面上形成一個具有一定面積的彌散的光斑。 在橫向方向，被彌散光斑照亮的熒光樣品區(qū)域均會受激發(fā)射出熒光，熒光被顯微物鏡收集 并通過和所述掃描振鏡系統(tǒng)，經(jīng)探測系統(tǒng)收集，此過程同樣受光學(xué)衍射極限的限制。彌散光 斑的橫向尺寸（用半高全寬來衡量)一般為一個艾里斑大小，根據(jù)瑞利判據(jù)，彌散斑照亮的 熒光樣品區(qū)域內(nèi)的細(xì)節(jié)無法被分辨，因此限制了光學(xué)顯微鏡的橫向分辨能力。在縱向方向， 橢球狀光斑的縱向尺寸約為其橫向尺寸的2.5倍，因此光學(xué)顯微鏡的縱向分辨率更差，約為 橫向分辨率的2.5倍。
[0044]在本發(fā)明中，我們把熒光受激微分顯微術(shù)應(yīng)用于三維顯微成像，來同時提高顯微 系統(tǒng)的橫向和縱向分辨率，實現(xiàn)快速三維超分辨率顯微成像。當(dāng)兩個空間光調(diào)制器加載的 相位調(diào)制函數(shù)均為
時，s光分量和p光分量均未被調(diào)制，通過1/4波片轉(zhuǎn)換為圓偏 振光后經(jīng)顯微物鏡聚焦，在樣品上形成一個三維實心光斑，該實心光斑照亮的樣品區(qū)域所 激發(fā)出的熒光被探測器所收集，得到當(dāng)前掃描點處的第一信號光強h。當(dāng)兩個空間光調(diào)制 器分別加載〇-2π禍旋位相板和0-JT位相板時，s光分量和p光分量分別被兩個空間光調(diào)制器 調(diào)制，通過1/4波片轉(zhuǎn)換為圓偏振光后經(jīng)顯微物鏡聚焦，分別在樣品上形成一個橫向方向的 二維空心光斑和一個縱向方向的ζ軸暗斑，兩者疊加后形成一個三維空心光斑，該空心光斑 照亮的樣品區(qū)域所激發(fā)出的熒光被探測器所收集，得到當(dāng)前掃描點處的第二信號光強1 2。 對于同一掃描點探測得到的11和12，利用公式1(1，7, 2;) = 11(1，7,2;)-7 12(1，7,2;)，計算得 至lJKx，y，z)。實心光斑減去空心光斑，只保留了中心區(qū)域的信號光，相當(dāng)于縮小了實心光斑 的尺寸，因此I (X，y，ζ)所對應(yīng)的掃描點處的有效信號光發(fā)光面積將小于I i (X，y，ζ)所對應(yīng) 的各掃描點處的第一信號光