一種確定蚯蚓中土霉素殘留浸提劑的實(shí)驗(yàn)方法
【專利摘要】一種確定蚯蚓中土霉素殘留浸提劑的實(shí)驗(yàn)方法，步驟為：1）將蚯蚓樣品與Na2SO4研磨制備組織漿液，用浸提劑清洗得到浸提液；2）經(jīng)攪拌、振蕩、超聲提取、低溫高速離心分離，收集上清液；3）將上清液過聚四氟乙烯濾膜去除雜質(zhì)，用高效液相色譜測定土霉素含量；4）分別計(jì)算各種浸提劑對(duì)土霉素的加標(biāo)回收率；5）將確定的浸提劑，分別進(jìn)行一次浸提和二次浸提，通過方差分析確定最佳方案。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：該方法通過實(shí)驗(yàn)確定體積比為4:1的甲醇與水的混合液是提取蚯蚓中土霉素的最佳浸提劑；采用該最佳浸提劑在室溫下提取一次完全能夠達(dá)到有效浸提的目的，提取時(shí)間短、成本費(fèi)用低，方法簡單、易于實(shí)施且提取效率高，易于推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種確定蚯蚓中土霉素殘留浸提劑的實(shí)驗(yàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種確定蚯蚓中土霉素殘留浸提劑的實(shí)驗(yàn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]土霉素屬于四環(huán)素類抗生素的一種，具有十二氫化并四苯基結(jié)構(gòu)，是由放線菌產(chǎn)生的一種廣譜性抗生素，對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、厭氧菌等均具有抗性。
[0003]我國是抗生素使用大國，其中土霉素是生產(chǎn)量和使用量比較高的抗生素之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2000年我國僅土霉素產(chǎn)量I萬噸，占世界總產(chǎn)量的65%，參見:胡冠九、王冰、孫成.高效液相色譜法測定環(huán)境水樣中5種四環(huán)素類抗生素殘留[J].環(huán)境化學(xué)，2007，26(1)，106-107。土霉素主要用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，然而高達(dá)90-95%的土霉素殘留在畜禽糞便中，參見:Becon1-Barker M G, Hornish R E, et al.Ceftiofur hy drochloride: plasma andtissue distribution in swine following in tramuscular administration at variousdoses [J].Veterinary Pharmacology & therapeutics, 1996, 19(3)，192-199。隨著畜禽糞便作為廉價(jià)肥料用于農(nóng)田土壤，進(jìn)而給土壤環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，如在我國，土壤中可檢測到的土霉素含量高達(dá)200mg/kg，參見:王冉、劉鐵錚、王恬.抗生素在環(huán)境中的轉(zhuǎn)歸及其生態(tài)毒性[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2006,26(1):265-269。
[0004]近年來，由于土壤中土霉素的污染給土壤生態(tài)安全造成了不良的影響，因此對(duì)于生長在土霉素污染土壤中的生物對(duì)其吸收累積現(xiàn)象得到了廣泛的研究和關(guān)注。其中，生物體中土霉素的提取是準(zhǔn)確測定土霉素殘留量的關(guān)鍵技術(shù)，直接決定了最終測定土霉素含量的準(zhǔn)確性。由于生物種類存在差異性，因此同一浸提劑并不一定適合對(duì)所有生物種類中土霉素的提取。因此有必要對(duì)于不同的生物種類選擇最優(yōu)浸提劑進(jìn)行提取，并建立簡單、準(zhǔn)確有效的浸提方法。GB/T 5009.95-2003中，利用Na2EDTA-McIlvaine緩沖液對(duì)蜂蜜中的土霉素等四環(huán)素類抗生素進(jìn)行提取測定。Boonsaner和Hawker,參見:Boonsaner M， Hawker D W.Accumulation of oxytetracycline and norfloxacinfrom saline soil by soybeans.Science of the Total Environment.2010，408:1731-1737，利用Na2EDTA-McIlvaine緩沖液提取大豆體內(nèi)的土霉素，但并未對(duì)緩沖液的提取濃度進(jìn)行解釋和說明。Blackawell等，參見:Blackwell P A, Lutzhoft H C H，MaH P et al.Fast and robust simultaneous determination of three veterinaryantibiotics in groundwater and surface water using a tandem solid-phaseextraction with high-performance Iiquid chromatography-UV detection[J].Journal of Chromatography A，2004，1045(1-2)，111-117，研究發(fā)現(xiàn):在超聲輔助萃取下，用Na2EDTA-McIlvaine緩沖液-甲醇作為浸提劑提取土壤中的土霉素，加標(biāo)回收率可高達(dá) 27-75%。Juhel-Gauguin 等研究發(fā)現(xiàn)，參見:Juhel-Gaugain M.，McEvoy J.D.G.，VanGinkel L A.Measurements for certification of chlortetracycline referencematerials within the European Union Standards, Measuraments and Testingprogramme [J] Analytical Chemistry, 2000, 368(7)，656-663,用 EDTA 緩沖液-甲醇作為浸提劑對(duì)動(dòng)物組織中的土霉素具有較好的提取效果，加標(biāo)回收率可達(dá)到75%以上。胡獻(xiàn)剛等報(bào)道，參見:胡獻(xiàn)剛、羅義、周啟星、徐琳.2008.固相萃取-高效液相色譜法測定畜牧糞便中13種抗生素藥物殘留.分析化學(xué)，36 (9):1162-1166，檸檬酸緩沖液酸化的乙腈提取豬糞中土霉素等四環(huán)素類抗生素效果比較好。Anne,參見:Anne Marie Jacobsen,Bent HalIing-S0rensen, Flemming Ingerslev, Steen Honore Hansen.Simultaneousextraction of tetracycline, macrolide and sulfonamide antibiotics fromagricultural soils using pressurised liquid extraction, followed by solid-phaseextraction and liquid chromatography - tandem mass spectrometry.Journal ofChromatography A, 2004, 1038: 157-170,提出利用甲醇-草酸(體積比1:1)能夠?qū)ν寥乐械耐撩顾剡M(jìn)行很好的浸提。目前，已經(jīng)建立了完善的對(duì)畜禽肉類中土霉素的提取方法，采用的是國標(biāo)(GB/T 5009.116-2003)中提出的5%高氯酸浸提法。由于生物種類的差異性，對(duì)于土壤、糞便、蜂蜜、蔬菜、畜禽肉類中土霉素進(jìn)行提取的浸提劑并不一定適合于土壤生物蚯蚓中土霉素的提取，然而到目前為止還未見到關(guān)于利用何種浸提劑來提取蚯蚓中土霉素比較合適的研究報(bào)道。
[0005]在土霉素的提取過程中，通常采用多次提取液的總和來測定其中土霉素含量，步驟繁瑣費(fèi)時(shí)費(fèi)力且浪費(fèi)耗材。因此有必要在選擇最佳提取劑的基礎(chǔ)上，在不影響提取效率和提取穩(wěn)定性的前提下，簡化提取步驟，提高提取速率，將為準(zhǔn)確預(yù)測土霉素在土壤生物蚯蚓體內(nèi)的吸收累積及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)上述存在問題，提供一種確定蚯蚓中土霉素殘留浸提劑的實(shí)驗(yàn)方法，通過篩選適合于蚯蚓中土霉素殘留的提取劑以及建立簡單、經(jīng)濟(jì)、有效的提取方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:
一種確定蚯蚓中土霉素殘留浸提劑的實(shí)驗(yàn)方法，包括以下步驟:
1)將新鮮的蚯蚓樣品置于瓷質(zhì)研缽中，加入無水Na2SO4,在氮?dú)鈼l件下研磨制備組織漿液，轉(zhuǎn)移磨碎后的組織漿液，用浸提劑反復(fù)清洗研缽至洗凈殘留物，收集全部清洗液并加入浸提劑至所需的體積，得到浸提液，所述浸提劑為具有潛力的各種浸提劑；
2)將上述浸提液在18-25°C、200r/min條件下振蕩20min，然后在100W條件下超聲提取20min,用冷凍離心機(jī)在2500rmp、4°C條件下進(jìn)行高速離心分離25min,收集上清液；
3)將上述上清液過0.45 μ m聚四氟乙烯濾膜去除雜質(zhì)，采用高效液相色譜測定土霉素含量;
4)分別計(jì)算各種浸提劑對(duì)土霉素的加標(biāo)回收率，選擇提取率在80%以上的浸提劑，在此基礎(chǔ)上，選擇同一浸提劑對(duì)土霉素浸提率的重復(fù)性差異性較小、浸提比較穩(wěn)定的浸提劑，從而確定對(duì)蚯蚓中土霉素提取比較適合的浸提劑；
5)采用上述確定的浸提劑，分別進(jìn)行一次浸提和二次浸提，通過方差分析進(jìn)行比較其浸提效果的差異性，并進(jìn)一步對(duì)其浸提穩(wěn)定性進(jìn)行檢測，在一次浸提和二次浸提總量之間不呈現(xiàn)顯著差異的基礎(chǔ)上，選擇一次浸提對(duì)土霉素進(jìn)行浸提，從而簡化提取次數(shù)，提高提取效率。
[0008]所述具有潛力的各種浸提劑包括pH為4.7的檸檬酸酸化乙腈、0.1 mol/LpH4.0±0.05的Na2EDTA-McIlvaine、濃度為5w%的高氯酸、體積比為1:1的甲醇與檸檬酸的混合液、體積比為1:1的甲醇與EDTA緩沖液的混合液和不同體積比的甲醇與水的混合液。
[0009]所述蚯蚓樣品與無水NaSO4的質(zhì)量比為3:1。
[0010]所述蚯蚓樣品與浸提液的用量比為1.50g/20mL。
[0011]所述實(shí)驗(yàn)確定的適合于蚯蚓中土霉素殘留一次浸提的浸提劑為體積比4:1的甲醇與水的混合液。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
該方法通過對(duì)具有潛力的幾種浸提劑提取效果的比較，發(fā)現(xiàn)體積比為4:1的甲醇與水的混合液，是提取蚯蚓中土霉素的最佳浸提劑；采用該最佳浸提劑在室溫下提取一次完全能夠達(dá)到有效浸提的目的，從而節(jié)省了提取時(shí)間和因?yàn)樵噭┑群牟膸淼馁M(fèi)用，方法簡單、易于實(shí)施且提取效率高，易于推廣應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例:
確定蚯蚓中土霉素殘留浸提劑的實(shí)驗(yàn)方法的前期準(zhǔn)備工作，包括以下項(xiàng)目:
(一)浸提劑的準(zhǔn)備
本發(fā)明選擇具有潛力的浸提劑包括PH為4.7的檸檬酸酸化乙腈、0.1 mol/LpH4.0±0.05的Na2EDTA-McIlvaine (以下簡稱EDTA緩沖液)、濃度為5w%的高氯酸、體積比為1:1的甲醇與檸檬酸的混合液、體積比為1:1的甲醇與EDTA緩沖液的混合液和體積比分別為2:1、3:1、4:1的甲醇與水的混合液，其配制方法如下。
[0014]I) EDTA緩沖液的配制
將Na2HP04、Na2EDTA和檸檬酸分別配制成0.2、0.4和0.2 mol/L的水溶液，先將檸檬酸溶液與Na2HPO4溶液按體積比為8:5配制成McIlvaine緩沖液，然后將McIlvaine緩沖液與Na2EDTA溶液按體積比為1:1混合，最后用6mol/L HCl或6mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至
4.0±0.05，得至Ij 0.1 mol/L 的 Na2EDTA-McIlvaine 緩沖液。
[0015]2) pH為4.7的檸檬酸酸化乙腈的配制
將檸檬酸鈉和檸檬酸分別與水混合配制成0.1M的溶液，然后按照體積比為18.6:1.4混合兩種溶液，配制成檸檬酸緩沖液，用檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)乙腈PH為4.7即可。
[0016]3)甲醇與檸檬酸的混合液的配置
將甲醇和0.lmol/L的檸檬酸溶液按照體積比1:1混合即可。
[0017]其他浸提劑的配制方法參照3)即可。
[0018](二)土霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
1)標(biāo)準(zhǔn)母液的制備:稱取土霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.5000g，用甲醇定容于IOOml棕色容量瓶中，作為母液使用；
2)定量曲線標(biāo)液的制備:用甲醇稀釋母液配制2組定量曲線標(biāo)液，一組為低濃度組，設(shè)置濃度分別為0.1mg/L、0.2 mg/L、0.5mg/L、0.8mg/L、l.0mg/L ;另一組為高濃度組，設(shè)置濃度分別為 I mg/L、3mg/L、9mg/L、12mg/L、16 mg/L。[0019](三)樣品染毒處理
選擇未受土霉素污染的蚯蚓樣品，將其放入研缽中研磨處理，稱取1.50g的樣品放入40ml棕色PE瓶中，設(shè)置3個(gè)平行樣品，加入濃度為15 mg/kg的土霉素母液0.5mL進(jìn)行染毒，用漩渦處理使其混勻，使生物樣品中土霉素的污染濃度為5mg/kg，室溫密封避光條件下靜置6h保存。
[0020]該實(shí)施例確定蚯蚓中土霉素殘留浸提液的實(shí)驗(yàn)方法，包括以下步驟:
1)將新鮮的蚯蚓樣品1.50g置于瓷質(zhì)研缽中，加入0.50g無水Na2SO4，在氮?dú)鈼l件下研磨制備組織漿液，轉(zhuǎn)移磨碎后的組織漿液，分別用不同浸提劑反復(fù)清洗研缽至洗凈殘留物，收集全部清洗液并加入浸提劑至所需的體積，得到浸提液；
2)將上述浸提液在18-25°C、200r/min條件下振蕩20min，然后在100W條件下超聲提取20min,用冷凍離心機(jī)在2500rmp、4°C條件下進(jìn)行高速離心分離25min,收集上清液；
3)將上述上清液過0.45 μ m聚四氟乙烯濾膜去除雜質(zhì)，采用高效液相色譜測定土霉素含量；所述液相色譜測定條件為:沃特世(Waters)高效液相色譜儀(HPLC)(包括:1525 二元泵、717型自動(dòng)進(jìn)樣器、2487紫外檢測器)、沃特世C18反相色譜柱(5 μ mX0.46X250 mm)，進(jìn)樣量為20yL，柱溫30°C，流速為lml/min，流動(dòng)相為乙腈/ 0.0lmol/L草酸(v/v=20:80)，檢測波長355 nm，保留時(shí)間為5.230 min，檢測限0.01 mg/L，定量限0.05 mg/L ；
4)計(jì)算不同浸提劑對(duì)土霉素的加標(biāo)回收率，選擇提取率在80%以上的浸提劑，在此基礎(chǔ)上，選擇同一浸提劑對(duì)土霉素浸提率的重復(fù)性差異性較小、浸提比較穩(wěn)定的浸提劑，從而確定對(duì)蚯蚓中土霉素提取比較適合的浸提劑；
5)采用上述優(yōu)選出的浸提劑，分別進(jìn)行一次浸提和二次浸提，通過方差分析進(jìn)行比較其浸提效果的差異性，并進(jìn)一步對(duì)其浸提穩(wěn)定性進(jìn)行檢測，在一次浸提和二次浸提總量之間不呈現(xiàn)顯著差異的基礎(chǔ)上，選擇一次浸提對(duì)土霉素進(jìn)行浸提，從而簡化提取次數(shù)，提高提取效率。
[0021]該實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
I)蚯蚓中土霉素提取的浸提劑篩選
在相同用量和提取時(shí)間條件下，先振蕩后超聲提取蚯蚓中的土霉素，不同浸提劑的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表I所示。對(duì)于甲醇:水，隨著甲醇提及比例的增大，加標(biāo)回收率有逐漸增大趨勢，但當(dāng)這個(gè)比例增加到4:1時(shí)這種增大的趨勢逐漸穩(wěn)定，與體積比為3:1時(shí)得到的加標(biāo)回收率差異不顯著b>0.05)，但與其他浸提劑得到的土霉素的加標(biāo)回收率有顯著的差異&〈0.05)。另外，用EDTA緩沖液、甲醇-檸檬酸和5%高氯酸提取蚯蚓體內(nèi)土霉素均得至IJ了較好的效果，根據(jù)平均的加標(biāo)回收率，不同浸提劑對(duì)蚯蚓體內(nèi)土霉素的浸提效果為:甲醇-水(V:V=4:1) >甲醇-水(V:V=3:1)> EDTA緩沖液〉甲醇:水(V:V=2:1)>甲醇-檸檬酸(V: V=1:1) >5%的高氯酸，而檸檬酸酸化乙腈、甲醇:EDTA緩沖液(V:V=1:1)由于加標(biāo)回收率小于15%，因此并不適合用來浸提蚯蚓中的殘留土霉素。
[0022]表I不同的浸提劑對(duì)蚯蚓中土霉素提取的加標(biāo)回收率比較
【權(quán)利要求】
1.一種確定蚯蚓中土霉素殘留浸提劑的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將新鮮的蚯蚓樣品置于瓷質(zhì)研缽中，加入無水Na2SO4,在氮?dú)鈼l件下研磨制備組織漿液，轉(zhuǎn)移磨碎后的組織漿液，用浸提劑反復(fù)清洗研缽至洗凈殘留物，收集全部清洗液并加入浸提劑至所需的體積，得到浸提液，所述浸提劑為具有潛力的各種浸提劑； 2)將上述浸提液在18-25°C、200r/min條件下振蕩20min，然后在100W條件下超聲提取20min,用冷凍離心機(jī)在2500rmp、4°C條件下進(jìn)行高速離心分離25min,收集上清液； 3)將上述上清液過0.45 μ m聚四氟乙烯濾膜去除雜質(zhì)，采用高效液相色譜測定土霉素含量; 4)分別計(jì)算各種浸提劑對(duì)土霉素的加標(biāo)回收率，選擇提取率在80%以上的浸提劑，在此基礎(chǔ)上，選擇同一浸提劑對(duì)土霉素浸提率的重復(fù)性差異性較小、浸提比較穩(wěn)定的浸提劑，從而確定對(duì)蚯蚓中土霉素提取比較適合的浸提劑； 5)采用上述確定的浸提劑，分別進(jìn)行一次浸提和二次浸提，通過方差分析進(jìn)行比較其浸提效果的差異性，并進(jìn)一步對(duì)其浸提穩(wěn)定性進(jìn)行檢測，在一次浸提和二次浸提總量之間不呈現(xiàn)顯著差異的基礎(chǔ)上，選擇一次浸提對(duì)土霉素進(jìn)行浸提，從而簡化提取次數(shù)，提高提取效率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述確定蚯蚓中土霉素殘留浸提劑的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于:所述具有潛力的各種浸提劑包括PH為4.7的檸檬酸酸化乙腈、0.1 mol/L pH4.0±0.05的Na2EDTA-McIlvaine、濃度為5?%的高氯酸、體積比為1:1的甲醇與檸檬酸的混合液、體積比為1:1的甲醇與EDTA緩沖液的混合液和不同體積比的甲醇與水的混合液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述確定蚯蚓中土霉素殘留浸提劑的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于:所述蚯蚓樣品與無水NaSO4的質(zhì)量比為3:1。`
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述確定蚯蚓中土霉素殘留浸提劑的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于:所述蚯蚓樣品與浸提液的用量比為1.50g/20mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述確定蚯蚓中土霉素殘留浸提劑的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于:所述實(shí)驗(yàn)確定的適合于蚯蚓中土霉素殘留一次浸提的浸提劑為體積比為4:1的甲醇與水的混合液。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103439419SQ201310291856
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月12日
【發(fā)明者】鮑艷宇, 劉雨霞 申請(qǐng)人:南開大學(xué)