一種黃曲霉毒素免疫親和柱及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種黃曲霉毒素免疫親和柱及其制備方法和用途。該免疫親和純化柱利用蛋白G偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠載體上，然后用抗黃曲霉毒素的抗體與瓊脂糖上的蛋白G偶聯(lián)。然后再利用交聯(lián)劑對黃曲霉毒素抗體-蛋白G-瓊脂糖凝膠載體進行交聯(lián)后裝填親和柱。該免疫親和柱主要用于對于食品、飼料、牛奶、血樣以及其他多種樣本中的黃曲霉毒素的純化，以便于后期對樣本中黃曲霉毒素的高效液相色譜(HPLC)檢測和熒光檢測。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種黃曲霉毒素的免疫親和柱及其制備方法和用途。屬食品安全檢測 領(lǐng)域。 一種黃曲霉毒素免疫親和柱及其制備方法和用途
【背景技術(shù)】：
[0002] 黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT)主要是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類有 毒次生代謝物。在世界不同地區(qū)都發(fā)現(xiàn)了這些真菌大量存在于供人類食用的食品中，黃曲 霉毒素污染已導(dǎo)致嚴(yán)重的食品安全問題。黃曲霉毒素是一類毒性極強的物質(zhì)，具有強致癌 性和強免疫抑制性。1993年AFT被世界衛(wèi)生組織（WHO)的癌癥研究機構(gòu)劃定為I類致癌 物。黃曲霉毒素廣泛的分布于發(fā)霉的糧食及其制品中，特別是花生、花生油、玉米及其制品、 乳及乳制品，發(fā)霉的飼料中也有發(fā)現(xiàn)含有較多的黃曲霉毒素。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的黃曲霉 毒素至少包含黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1、M2等17種結(jié)構(gòu)相似且特征已知的化合物。其 中黃曲霉毒素 B1是（AFTB1)是自然發(fā)生潛力最大、最為常見的一種毒素。是黃曲霉毒素中 的主要成份。其毒性和致癌性也最強。
[0003] 世界各國和地區(qū)均制定了嚴(yán)格的AFT限量標(biāo)準(zhǔn)，且限量要求日益嚴(yán)格。
[0004]目前黃曲霉毒素的檢測方法有薄層層析法、高效液相色譜法（HPLC)、酶聯(lián)免疫吸 附法（ELISA)、放射免疫分析法、微柱法等。
[0005] 其中薄層層析法是最早使用也是最廣泛使用的檢測黃曲霉毒素的方法，但是薄層 層析法對樣品處理繁瑣，實驗過程復(fù)雜，所需時間較多，容易受到雜質(zhì)的干擾。比較適合黃 曲霉毒素的定性檢測。
[0006] 放射免疫分析法由于使用到放射性元素，容易造成放射性污染，目前已經(jīng)很少人 使用。酶聯(lián)免疫分析法操作簡便，使用較為安全。但由于酶本身不穩(wěn)定，用此方法檢測有可 能帶來一定的假陽性和假陰性的問題。微柱法主要用于快速篩選出超標(biāo)樣本，很難對毒素 進行種類區(qū)分和定量檢驗。僅僅適用于定性檢測。
[0007] 高效液相色譜法在操作上較為簡便，可同時檢測多個黃曲霉毒素種類，適于大批 量的樣品分析。但是高效液相色譜檢測收到前期樣本處理的限制，只有前期將樣本進行純 化才能得到更好的檢測結(jié)果。而免疫親和純化柱很好的解決了這一問題。利用免疫親和純 化柱和高效液相色譜聯(lián)用能快速、準(zhǔn)確的得到結(jié)果，并且靈敏度很高。目前已經(jīng)被國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T18979-2003 采用。
[0008] 目前制備免疫親和純化柱的方法大概有：溴化氰活化直接偶聯(lián)法、環(huán)氧氯丙烷法、 過碘酸鈉法等。這些方法的基本原理都是將載體基質(zhì)進行化學(xué)活化后，將抗體偶聯(lián)到載體 上。但是由于偶聯(lián)是非特異性的，抗體的任何部位都有可能和載體偶聯(lián)，方向性是不可控制 的。勢必影響親和純化柱純化黃曲霉毒素的效率。對于這一弊端，目前有了一些解決辦法， 上海大學(xué)的陳宇光等（CN101241128A)通過將抗體進行酰肼化修飾，然后與醛基化的基質(zhì) 相結(jié)合。使抗體的Fc片段與基質(zhì)結(jié)合，抗體的Fab片段暴露在外，提高了抗體捕捉抗原的 效率。但是由于需要對抗體進行酰肼化的化學(xué)修飾，步驟較繁瑣，并且化學(xué)修飾抗體可能會 影響抗體本身的親和力，進而影響黃曲霉毒素的純化效率。
【發(fā)明內(nèi)容】
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[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種黃曲霉毒素免疫親和柱及其制備方法和用途
[0010] 為了達(dá)到上述目的，在本發(fā)明中，利用了蛋白G的功能，蛋白G是一種G型鏈球菌 細(xì)胞壁上的蛋白，能特異性的與多種動物抗體的Fc部位相結(jié)合。并且具有很高的親和力。 我們克隆了蛋白G的基因序列，并且對其密碼子進行了優(yōu)化、重組后，在大腸桿菌中表達(dá)出 了與抗體有高親和力的基因重組蛋白G。將基因重組的蛋白G偶聯(lián)到載體上后，再將黃曲 霉毒素抗體偶聯(lián)到蛋白G上，制備出了黃曲霉毒素-蛋白G-載體，再用交聯(lián)劑將載體進行 交聯(lián)。交聯(lián)后的載體裝柱后就形成了高親和力的黃曲霉毒素免疫親和柱。該親和柱操作簡 便，純化黃曲霉毒素效率高。樣本經(jīng)過簡單的處理后就可以進行純化，得到純度很高的黃曲 霉毒素。用于高效液相色譜檢測和熒光儀檢測。
[0011] 具體操作如下：
[0012] 本發(fā)明最大的優(yōu)勢就是利用了蛋白G與Ig抗體特異性結(jié)合的特點，IgG抗體由兩 條重鏈和兩條輕鏈構(gòu)成，抗體分為Fab區(qū)和Fc區(qū)，其中，F(xiàn)ab區(qū)是抗原結(jié)合的區(qū)域。
[0013] 蛋白G是鏈球菌細(xì)胞壁上的一種特殊的蛋白，與抗體的Fc區(qū)域有特異性的結(jié)合能 力。蛋白G與抗體結(jié)合后，抗體的Fab區(qū)域游離在外，不影響抗體的抗原結(jié)合能力。經(jīng)過我 們基因優(yōu)化重組后的蛋白G，1個分子的蛋白G可以結(jié)合3個分子的IgG抗體，具有很高的 抗體親和力。并且只有抗體能與蛋白G結(jié)合，其余蛋白均不能與蛋白G結(jié)合，特異性很高。 以此蛋白G為基礎(chǔ)制備的免疫親和柱具有特異性好，黃曲霉毒素結(jié)合量大，純化效率高的 特點。
[0014] 黃曲霉毒素免疫親和柱及其制備方法說明如下
[0015] 1.載體活化
[0016] 選擇瓊脂糖載體，s印harose4B，以環(huán)氧氯丙烷活化法進行活化。
[0017] 取2 %的預(yù)溶脹的瓊脂糖凝膠sepharose4B，用20倍體積的蒸饋水充分沖洗，洗去 殘存的乙醇，用漏斗過濾掉水分。
[0018] 稱取濾去水份后的濕凝膠5克，加入7. 5毫升0. 8M的NaOH，30 %的環(huán)氧氯丙烷2 毫升，2mg/ml的硼氫化鈉 NaBH4, 5毫升，在25°C下?lián)u床反應(yīng)8小時。
[0019] 反應(yīng)后，用大量的蒸餾水洗滌，去除凝膠中混雜的環(huán)氧氯丙烷。
[0020] 2.將蛋白G與活化載體sepharose4B的偶聯(lián)
[0021] 將活化好的瓊脂糖凝膠s印harose4B用偶聯(lián)緩沖液（0. 1M的NaHC03,0. 8M NaCl， PH8. 9)洗滌3次。加入2mg/ml的蛋白G，室溫偶聯(lián)4小時。
[0022] 將偶聯(lián)好的瓊脂糖載體用20mM，PH7. 4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次。偶聯(lián)有蛋白 G的瓊脂糖載體sepharose命名為蛋白G-sepharose。
[0023] 3.抗黃曲霉毒素抗體與蛋白G-sepharose載體上的蛋白G連接
[0024] 蛋白G與抗體具有特異性的親和力，在一定的反應(yīng)條件下，將偶聯(lián)有蛋白G的瓊脂 糖凝膠與抗體進行連接。將抗體連接于瓊脂糖上。由于蛋白G與抗體的結(jié)合部位是抗體的 Fc區(qū)域，抗體的抗原結(jié)合區(qū)不受影響，充分保證了抗體的抗原結(jié)合能力。
[0025] 將抗黃曲霉毒素抗體溶于20mM、PH7. 4的PBS中，終濃度2mg/ml。將抗體加入用 20Mm PH7. 4的PBS緩沖液洗滌過的蛋白G-s印harose中。室溫結(jié)合30分鐘。結(jié)合后的載 體用PBS洗漆。連接有抗體的載體命名為抗體-蛋白G-sepharose。
[0026] 4.載體交聯(lián)
[0027] 將抗體-蛋白G-s印harose用0· 1M PH9. 0的硼酸緩沖液洗滌3次。然后加入0· 1M PH9. 0的硼酸緩沖液，在緩沖液中加入交聯(lián)劑如庚二亞氨酸二甲酯（DMP)至終濃度20mM。室 溫交聯(lián)1小時。
[0028] 加入50mM，PH9. 0的乙醇胺終止反應(yīng)。并用50mM的乙醇胺封閉10分鐘。
[0029] 交聯(lián)后的抗體-蛋白G-sepharose載體用20mM，PH7. 4的PBS洗漆3次。
[0030] 5.裝柱
[0031] 將交聯(lián)后的抗體-瓊脂糖載體根據(jù)需要裝入層析柱中，可根據(jù)需要制備不同容量 的黃曲霉毒素親和純化柱。層析柱的結(jié)構(gòu)如附圖1所示：
[0032] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0033] 1)充分的利用了蛋白G與IgG抗體特異性結(jié)合的特性，使抗體通過蛋白G偶聯(lián)到 載體上。并且IgG抗體的Fab片段充分的暴露在外，大幅度提高了黃曲霉毒素的捕捉能力， 黃曲霉毒素的純化效率也得到有效提1?。
[0034] 2)本發(fā)明使用了基因改造后的蛋白G，通過對密碼子的優(yōu)化和IgG結(jié)合域基因的 優(yōu)化。使蛋白G的抗體結(jié)合能力大幅度提1?，進而提1?了黃曲霉毒素的純化效率。
[0035] 3)使用本發(fā)明純化黃曲霉毒素操作簡便，幾步就可以得到純度較高的黃曲霉毒 素，更方便操作者使用。
[0036] 4)使用本發(fā)明得到的黃曲霉毒素純度很高，后續(xù)不用再做別的純化處理就可以直 接用于高效液相色譜檢測或者熒光檢測，節(jié)省了操作者的時間和費用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037] 圖1 :黃曲霉毒素免疫親和柱結(jié)構(gòu)示意圖
[0038] A :進樣口；B :柱體；C :篩板；D :黃曲霉毒素抗體-蛋白G-sepharose填料E :篩板； F :出樣口
[0039] 圖2 :花生柏中AFT含量檢測HPLC圖譜
[0040] A :黃曲霉毒素 B1檢出峰；B :黃曲霉毒素 B2檢出峰；C :黃曲霉毒素 G2檢出峰
[0041]
[0042] 實施例1 :黃曲霉毒素免疫親和純化柱的制備
[0043] 本發(fā)明制備黃曲霉毒素免疫親和純化柱的一個優(yōu)選的實施方案如下：
[0044] 1.瓊脂糖凝膠活化
[0045] 取2%的瓊脂糖凝膠s印harose2B，用20倍體積的蒸餾水充分沖洗，洗去殘存的乙 醇。用漏斗過濾掉水分。稱取濾去水份后的濕凝膠5克，加入7. 5毫升0. 8M的NaOH，30% 的環(huán)氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氫化鈉 NaBH4, 5毫升，在25°C下?lián)u床反應(yīng)8小時。
[0046] 反應(yīng)后，用50毫升蒸餾水洗滌，去除凝膠中混雜的環(huán)氧氯丙烷。
[0047] 2.蛋白G與活化的瓊脂糖凝膠的偶聯(lián)
[0048] 取1克活化后的瓊脂糖凝膠，用偶聯(lián)緩沖液（0. 1M的NaHC03,0. 8M NaCl，PH8. 9)洗 漆3次。加入2mg/ml的蛋白620ml，室溫偶聯(lián)4小時。
[0049] 將偶聯(lián)好的瓊脂糖載體用20mM，PH7. 4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次。偶聯(lián)有蛋白 G的瓊脂糖載體sepharose命名為蛋白G-sepharose。
[0050] 3.抗黃曲霉毒素 IgG單抗與蛋白G-sepharose結(jié)合
[0051] 將抗黃曲霉毒素抗體溶于20mM、PH7. 4的PBS中，終濃度2mg/ml，總體積10ml。
[0052] 將蛋白G-s印harose用20Mm PH7. 4的PBS緩沖液洗滌三次，每次30ml。將溶解于 PBS中的黃曲霉毒素抗體加入洗滌過的蛋白G-s印harose中。室溫結(jié)合30分鐘。
[0053] 結(jié)合后的載體用20Mm PH7. 4的PBS洗滌三次，每次30ml。連接有抗體的載體命名 為抗體_蛋白G-sepharose。
[0054] 4.結(jié)合IgG的瓊脂糖sepharose交聯(lián)
[0055] 將抗體-蛋白G-sepharose用0· 1M PH9. 0的硼酸緩沖液洗漆3次，每次30ml。
[0056] 將濕凝膠固體，加入0. 1M PH9.0的硼酸緩沖液20ml，在緩沖液中加入交聯(lián)劑庚 二亞氨酸二甲酯（DMP)至終濃度20mM。室溫交聯(lián)1小時。
[0057] 加入100mM，PH9. 0的乙醇胺20ml終止反應(yīng)。并用50mM的乙醇胺20ml封閉10分 鐘。
[0058] 交聯(lián)后的抗體-蛋白G-sepharose載體用20mM，PH7. 4的PBS洗漆3次，每次30ml。
[0059] 5.裝柱
[0060] 將交聯(lián)后的s印harose用10毫升20mM PBS PH7. 4重懸，然后裝入空的親和純化 柱柱體中。
[0061] 實施例2 :利用黃曲霉毒素免疫親和柱純化和檢測玉米中的黃曲霉毒素
[0062] 1.玉米樣品處理：
[0063] 將玉米樣品粉碎，過2mm分樣篩；
[0064] --25g過篩粉碎的樣品加入125mL 2X的上樣緩沖液溶液混勻；
[0065] -高速勻楽lmin (或用搖床劇烈振蕩20min)，用快速定性濾紙過濾；
[0066] --用10mL蒸餾水稀釋10mL濾液，再用微纖維濾紙過濾；
[0067] --取10mL上樣檢測。
[0068] 2.將黃曲霉毒素免疫親和純化柱室溫平衡30分鐘。
[0069] 3.取出免疫親和柱，進樣口與注射器針筒連接，注射器接入到氣控操作架上。
[0070] 4.用去離子水洗滌親和柱3次，每次10毫升，調(diào)節(jié)氣孔操作架氣泵壓力，使液體以 3滴/秒的流速流出。
[0071] 5.將樣品加入純化柱中，調(diào)節(jié)流量至1-2滴/秒。直至樣品全部流出純化柱。
[0072] 6.用蒸餾水洗滌純化柱3次，每次5毫升。
[0073] 7.加入1ml甲醇，收集洗脫產(chǎn)物。
[0074] 8.洗脫產(chǎn)物用高效液相色譜HPLC檢測。
[0075] 9.高效液相色譜檢測結(jié)果見表1，色譜圖見附圖2 :
[0076] 表1花生柏中黃曲霉毒素含量HPLC檢測結(jié)果
[0077] 保留時間 類型 峰面積 含量/峰面積 含量 組 名稱
[min] [LU*S] [ng/ul] 16. 133 -一 一一一 19.459 G2 1.06642 1. 74E-02 1. 74E-02 23.711 B2 423.42651 4. 21E-03 3.56339 29.202 B1 1046. 61926 8.55E-03 17.90694 總量： 21.50744
[0078] 從檢測結(jié)果可以看出，花生柏樣品經(jīng)黃曲霉毒素免疫親和柱純化后，用高效液相 色譜HPLC可以檢測到3個峰，峰值分別為19. 459、23. 71U29. 202.出峰位置分別對應(yīng)黃曲 霉毒素 G2，、B2、B1。
[0079] 結(jié)果說明這一份花生柏樣品中含有黃曲霉毒素 B1、B2和G1.含量分別為黃曲霉毒 素 G2 :含量 0· 037ng/ul ;
[0080] 黃曲霉毒素 B2 :含量3. 56ng/ul ;
[0081] 黃曲霉毒素 B1 :含量17. 91ng/ul
[0082] 黃曲霉毒素總量：21. 51ng/ul。
【權(quán)利要求】
1. 一種黃曲霉毒素的免疫親和柱，其特征在于包含有載體、蛋白G和黃曲霉毒素抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的免疫親和柱，其特征在于蛋白G通過化學(xué)鍵偶聯(lián)在載體上， 黃曲霉毒素抗體與蛋白G結(jié)合后用交聯(lián)劑交聯(lián)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的免疫親和柱，其特征在于蛋白G是基因重組表達(dá)的蛋白G。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2中所述的免疫親和柱，其特征在于所述的蛋白G包括按照GenBank CAA27638. 1序列表達(dá)的蛋白G，以及進過序列優(yōu)化后表達(dá)的蛋白G。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3中所述的免疫親和柱，其特征在于所述的序列優(yōu)化的蛋白G，包括針 對大腸桿菌表達(dá)進行的蛋白G密碼子進行優(yōu)化、對蛋白G進行抗體結(jié)合區(qū)域進行序列改變 以增加親和力以及增加蛋白G基因序列中抗體結(jié)合區(qū)域數(shù)量以提高抗體親和能力。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的免疫親和柱，其特征在于所述的載體是瓊脂糖凝膠。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6中所述的免疫親和柱，其特征在于所述的瓊脂糖凝膠包含但不限于 溴化氰活化的瓊脂糖凝膠、交聯(lián)的瓊脂糖凝膠、聚丙烯酸瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺瓊脂糖凝 膠、葡聚糖凝膠以及纖維素。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6中所述的免疫親和柱，其特征在于所述的抗黃曲霉毒素抗體包括單 克隆IgG抗體和多克隆抗體。
9. 一種純化黃曲霉毒素的免疫親和柱制備方法，其特征在于： 1) 瓊脂糖sepharose4B，加入0· 8M的NaOH，30 %的環(huán)氧氯丙燒，2mg/ml的硼氫化鈉 NaBH4,，在25°C下?lián)u床反應(yīng)8小時進行活化。或者購買溴化氰活化的sepharose4B。 2) 每克活化的 s印harose4B 加入 30-200nmol 的蛋白 G，在 0· 1M NaHC03,0. 5M NaCl PH8. 8的緩沖液中，室溫偶聯(lián)2小時?；蛘?°C偶聯(lián)過夜。 3) 偶聯(lián)產(chǎn)物用1M Tris. HC1 PH8. 0室溫反應(yīng)2小時。 4) 偶連好的s印harose-蛋白G，用20mM PH7. 4的PBS洗滌。 5) 將黃曲霉毒素抗體溶解在同樣的20mM PH7. 4的PBS中，每克蛋白G-sepharose加入 200nmol-1.2umol抗體。室溫反應(yīng)30分鐘。 6) 將黃曲霉毒素抗體-蛋白G-sepharose載體用20mM PBS PH7. 4洗漆，然后加入終濃 度0. 2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯（DMP)，PH8. 3.室溫反應(yīng)1小時。 7) 用20禮？!17.4的乙醇胺終止反應(yīng)，用含有0.01%硫柳汞的1〇11110^5?!17.4洗滌黃 曲霉毒素抗體-蛋白G-sepharose載體。裝柱，放于4°C保存。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫親和柱檢測黃曲霉毒素的用途。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于：包含但不限于糧食、飼料、牛奶及乳制 品、水產(chǎn)、血液、尿液、水中黃曲霉毒素的分離純化。
【文檔編號】G01N1/34GK104117229SQ201310153243
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月28日
【發(fā)明者】王瑩 申請人:北京華安麥科生物技術(shù)有限公司