專利名稱：一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米功能材料、環(huán)境檢測(cè)、生物免疫技術(shù)和電化學(xué)分析領(lǐng)域，公開(kāi)了一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雌激素是一種重要的生理激素，雌激素生物體的生理調(diào)節(jié)與不孕癥、肥胖、絕經(jīng)期的乳腺癌、前列腺癌、老年癡呆和骨質(zhì)疏松癥等多種人體疾病有關(guān)。人造雌激素如己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚是醫(yī)學(xué)上常用于控制生理作用的藥物；也被廣泛用于促進(jìn)牲畜生長(zhǎng)，雌激素藥物一部分通過(guò)排泄物排出到環(huán)境水中，而其余仍保存在生物體中。
己烯雌酚是人工合成的非留體雌激素物質(zhì)，能產(chǎn)生與天然雌二醇相同的所有藥理與治療作用。主要用于雌激素低下癥及激素平衡失調(diào)引起的功能性出血、閉經(jīng)，還可用于死胎引產(chǎn)前，以提高子宮肌層對(duì)催產(chǎn)素的敏感性。許多證據(jù)證明這些天然的以及人工合成的藥物在低濃度(ng-mL—1)也可能成為人體健康的潛在危機(jī)，如癌癥和其他病癥等。在許多國(guó)家雌激素已經(jīng)被禁止添加到動(dòng)物的飼料中。因此，雌激素的禁止使用已經(jīng)成為亟待解決的問(wèn)題，而建立水中雌激素的高靈敏、特異性快速檢測(cè)方法迫在眉睫。目前對(duì)復(fù)合樣品中低濃度目標(biāo)雌激素的檢測(cè)方法存在許多不足。電化學(xué)免疫傳感器具有樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，成為研究的重要手段。本實(shí)驗(yàn)將Pt納米粒子雜化至孔徑較大的SBA-15的孔道及介孔壁上，制備了 Pt雜化的SBA-15納米復(fù)合材料(Pt@SBA-15)。該材料具有SBA-15和Pt納米粒子的雙重效應(yīng)，是一種高催化活性的納米復(fù)合材料。采用Pt@SBA-15標(biāo)記二抗，檢測(cè)其對(duì)底液中過(guò)氧化氫的催化性能，制備雙通道的絲網(wǎng)印刷電極生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了環(huán)境樣品中兩種環(huán)境雌激素己烯雌酚和雌二醇的同時(shí)檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器的制備方法。本發(fā)明的目的之二是將所制備的電化學(xué)傳感器，用于同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素己烯雌酚和雌二醇。本發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟。1.一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
(I)氨基化SBA-15的合成
將I g三嵌段共聚物E020P070E020 (P123)溶解在30 mL、1.5 2 mo I.!/1的HCl溶液中，加入2.215 g正硅酸乙酯(TE0S)，混合物在34°C下攪拌Γ5 h，轉(zhuǎn)移到高壓釜在100°C條件下加熱2(T22 h，冷卻后過(guò)濾，將獲得的白色粉末在空氣中干燥，然后在560°C條件下煅燒3 4 h除去模板，合成制得SBA-15 ;將所合成的SBA-15，加l(Tl5 mL無(wú)水乙醇，置于100mL三口燒瓶中，油浴，加熱到70°C后，迅速加入50 μ 3_氨丙基三乙氧基硅烷，70°C恒溫回流3h，離心，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀3次，室溫下真空干燥9 11 h，得到氨基功能化的SBA-15。(2) Pt雜化的SBA-15的合成
將氨基功能化的SBA-15與HPtCl4以質(zhì)量比1: 0.5 I混合并用水稀釋成溶液，將混合物在室溫下攪拌If 24 h，離心后用水重新稀釋，用稀HCl調(diào)節(jié)溶液的pH〈2，攪拌2(Γ25min，得到混合液；將4(Γ50 mmol-Γ1的NaBH4溶液逐滴加入到所述的混合液中，直到所有的HPtCl4全部還原成金屬Pt，將混合液離心、真空干燥，制得Pt雜化的SBA-15 (Pt@SBA_15)。(3)石墨烯(GS)溶液制備
將2mg GS溶解于ImL高純水中，超聲0.5^2 h，制成濃度為Ζπ^πιΓ1 GS溶液。(4) PtiSBA-15/ 二抗溶液的制備
取I 2 mg Pt@SBA-15分散在I mL的pH 7.4的PBS緩沖溶液中，加入0.5 1.5 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液，攪拌2 4 h;加入廣2 mL兩種環(huán)境雌激素二抗(Ab2)中的一種，將上述混合物在室溫下攪拌1(T12 h，離心，制得兩種Pt@SBA-15/Ab2溶液，置于4°C下儲(chǔ)存，備用；所述兩種環(huán) 境雌激素二抗的濃度為40(T50(^g/mL。(5)雙通道免疫傳感器的構(gòu)建
I)取一片雙通道絲網(wǎng)印刷電極，超純水沖洗；分別取4飛PLdmg.!!!!/1 GS溶液，滴涂到雙通道絲網(wǎng)印刷電極的2個(gè)工作電極表面上，室溫晾干。2)在I)中得到的2個(gè)工作電極的表面上分別滴加6 8μ 的1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)混合溶液，保持濕潤(rùn)、孵化f 2 h，超純水清洗，晾干；所述EDC和NHS的濃度分別為4 mg/mL和lmg/mL ；
3)分別取Γ8 PL兩種環(huán)境雌激素一抗(Ab1),分別滴涂于2)得到的對(duì)應(yīng)的兩個(gè)工作電極表面上，4°C條件下晾干；所述的環(huán)境雌激素選自己烯雌酚和雌二醇，兩種環(huán)境雌激素一抗的濃度為5 10Pg/mL。4)分別取4飛PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 1 %的BSA溶液，滴涂于3)得到兩個(gè)工作電極表面上，保持電極濕潤(rùn)3 4 h，4°C下晾干，超純水清洗、晾干，制得一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器。以上所述的環(huán)境雌激素選自己烯雌酚和雌二醇
2.如上所述的制備的一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器，用于己烯雌酚和雌二醇的同時(shí)檢測(cè)，步驟如下:
(I)將制得的免疫傳感器溫育在一系列濃度的兩種環(huán)境雌激素對(duì)應(yīng)的抗原溶液中，放置I h，4 °C下晾干，清洗電極。(2)滴涂6 PL、Pt@SBA_15/Ab2溶液到(I)得到的電極表面上，晾干、清洗，制得組裝的工作電極，置于4 C冰箱中備用。(3)將參比電極、對(duì)電極和組裝的工作電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入40^60 μ 、5 10 mmol/L H2O2的pH=7.0 7.8的PBS緩沖溶液，用循環(huán)伏安和方波伏安法檢測(cè)傳感器的電流響應(yīng)，根據(jù)所得電流響應(yīng)與己烯雌酚和雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線。(4)將待測(cè)樣品代替己烯雌酚和雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述己烯雌酚和雌二醇工作曲線的繪制方法進(jìn)行檢測(cè)。
所述一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器，所用原材料均可在化學(xué)試劑公司或生物制藥公司購(gòu)買。本發(fā)明具備以下優(yōu)勢(shì):
(I)本發(fā)明快速、準(zhǔn)確，可用于兩種環(huán)境雌激素的同時(shí)檢測(cè)。(2)本發(fā)明采用的Pt@SBA-15和石墨烯均可增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)，從而提高了傳感器的靈敏度。(3)本發(fā)明使用印刷電極，其制備簡(jiǎn)單、成本低、便于攜帶、樣品消耗少，易于微型化和集成化，應(yīng)用范圍廣。(4)本發(fā)明與其它的絲網(wǎng)印刷電極傳感器相比，可以一次性同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素，顯著提高了檢測(cè)效率，同時(shí)具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。該免疫傳感器的研制對(duì)環(huán)境分析和食品安全分析具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例中所述的環(huán)境雌激素選自己烯雌酚和雌二醇。實(shí)施例1納米功能材料制備 (I)氨基化SBA-15的合成
將I g三嵌段共聚物E020P070E020(P123)溶解在30 mL、1.5 ι οΙ.Γ1的HCl溶液中，加入2.215 g正硅酸乙酯(TE0S)，混合物在34°C下攪拌4h，轉(zhuǎn)移到高壓釜在100°C條件下加熱20 h，冷卻后過(guò)濾，將獲得的白色粉末在空氣中干燥，然后在560°C條件下煅燒3 h除去模板，合成制得SBA-15 ;將所合成`的SBA-15，加IOmL無(wú)水乙醇，置于三口燒瓶中，油浴，加熱到70°C后，迅速加入50 μ 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70°C恒溫回流3h，離心，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀3次，室溫下真空干燥9 h，得到氨基功能化的SBA-15。(2) Pt雜化的SBA-15的合成
將氨基功能化的SBA-15與HPtCl4以質(zhì)量比1: 0.5混合并用水稀釋成溶液，將混合物在室溫下攪拌18 h，離心后用水重新稀釋，用稀HCl調(diào)節(jié)溶液的pH〈2，攪拌20 min，得到混合液；將40 mmol-Γ1的NaBH4溶液逐滴加入到所述的混合液中，直到所有的HPtCl4全部還原成金屬Pt，將混合液離心、真空干燥，制得Pt雜化的SBA-15 (Pt@SBA-15)。(3)石墨烯(GS)溶液制備
將2.0 mg GS溶解于ImL高純水中，超聲0.5 h，制成濃度為Zmg.mL—1 GS溶液。實(shí)施例2納米功能材料制備 (I)氨基化SBA-15的合成
將I g三嵌段共聚物E020P070E020(P123)溶解在30 mL、1.8 ι οΙ.Γ1的HCl溶液中，加入2.215 g正硅酸乙酯(TE0S)，混合物在34°C下攪拌4.5h，轉(zhuǎn)移到高壓釜在100°C條件下加熱21 h，冷卻后過(guò)濾，將獲得的白色粉末在空氣中干燥，然后在560°C條件下煅燒3.5 h除去模板，合成制得SBA-15 ;將所合成的SBA-15，加入12 mL無(wú)水乙醇，置于100 mL三口燒瓶中，油浴，加熱到70°C后，迅速加入50 μ 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70°C恒溫回流3h，離心，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀3次，室溫下真空干燥10 h，得到氨基功能化的SBA-15。(2) Pt雜化的SBA-15的合成將氨基功能化的SBA-15與HPtCl4以質(zhì)量比1: 0.7混合并用水稀釋成溶液，將混合物在室溫下攪拌21h，離心后用水重新稀釋，用稀HCl調(diào)節(jié)溶液的pH〈2，攪拌22 min，得到混合液；將45 mmol-Γ1的NaBH4溶液逐滴加入到所述的混合液中，直到所有的HPtCl4全部還原成金屬Pt，將混合液離心、真空干燥，制得Pt雜化的SBA-15 (Pt@SBA-15)。(3)石墨烯(GS)溶液制備
將2mg GS溶解于ImL高純水中，超聲I h，制成濃度為2 mg-πιΓ1 GS溶液。實(shí)施例3納米功能材料制備 (1)氨基化SBA-15的合成
將I g三嵌段共聚物E020P070E020 (P123)溶解在30 mL、2 mol.L—1的HCl溶液中，加入2.215 g正硅酸乙酯(TE0S)，混合物在34°C下攪拌5 h，轉(zhuǎn)移到高壓釜在100°C條件下加熱22 h，冷卻后過(guò)濾，將獲得的白色粉末在空氣中干燥，然后在560°C條件下煅燒4 h除去模板，合成制得SBA-15 ;將所合成的SBA-15，加入15 mL無(wú)水乙醇，置于100 mL三口燒瓶中，油浴，加熱到70°C后，迅速加入50 μ 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70°C恒溫回流3h，離心，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀3次，室溫下真空干燥11 h，得到氨基功能化的SBA-15。(2) Pt雜化的SBA-15的合成
將氨基功能化的SBA-15與HPtCl4以質(zhì)量比1:1混合并用水稀釋成溶液，將混合物在室溫下攪拌24 h，離心后用水重新稀釋，用稀HCl調(diào)節(jié)溶液的pH〈2，攪拌25 min，得到混合液；將50 mmol-Γ1的NaBH4溶液逐滴加入到所述的混合液中，直到所有的HPtCl4全部還原成金屬Pt，將混合液離心、真空干燥，制得Pt雜化的SBA-15 (Pt@SBA-15)。(3)石墨烯(GS)溶液制備
將2 mg GS溶解于ImL高純水中，超聲2 h，制成濃度為Zmg'mL—1 GS溶液。實(shí)施例4
PtOSBA-15/ 二抗溶液的制備
取I mg PtiSBA-15分散在I mL的pH 7.4的PBS緩沖溶液中，加入0.5 mL、2.5%的戊二醛溶液，攪拌2 h;加入I mL兩種環(huán)境雌激素二抗(Ab2)中的一種，將上述混合物在室溫下攪拌10h，離心，制得兩種Pt@SBA-15/Ab2溶液，置于4 C下儲(chǔ)存，備用；所述兩種環(huán)境雌激素二抗的濃度為40(^g/mL。實(shí)施例5 PtiSBA-15/ 二抗溶液的制備
取1.5mg PtiSBA-15分散在I mL的pH 7.4的PBS緩沖溶液中，加入1.0 mL、2.5%的戊二醛溶液，攪拌3 h ;加入1.5mL兩種環(huán)境雌激素二抗(Ab2)中的一種，將上述混合物在室溫下攪拌llh，離心，制得兩種Pt@SBA-15/Ab2溶液，置于4 C下儲(chǔ)存，備用；所述兩種環(huán)境雌激素二抗的濃度為450Pg/mL。實(shí)施例6 PtiSBA-15/ 二抗溶液的制備
取2 mg PtiSBA-15分散在I mL的pH 7.4的PBS緩沖溶液中，加入1.5 mL、2.5%的戊二醛溶液，攪拌4 h ;加入2.0 mL兩種環(huán)境雌激素二抗(Ab2)中的一種，將上述混合物在室溫下攪拌12 h，離心，制得兩種Pt@SBA-15/Ab2溶液，置于4 C下儲(chǔ)存，備用；所述兩種環(huán)境雌激素二抗的濃度為500Pg/mL。
實(shí)施例7
雙通道免疫傳感器的構(gòu)建
(I)取一片雙通道絲網(wǎng)印刷電極，超純水沖洗；分別取4μ 、2 mg-πιΓ1 GS溶液，滴涂到雙通道絲網(wǎng)印刷電極的2個(gè)工作電極表面上，室溫晾干。(2)在(I)中得到的2個(gè)工作電極的表面上分別滴加6μ 的1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)混合溶液，保持濕潤(rùn)、孵化I h，超純水清洗，晾干；所述EDC和NHS的濃度分別為I mg/mL和lmg/mL ；
(3)分別取4 PL兩種環(huán)境雌激素一抗(Ab1),分別滴涂于(2)得到的對(duì)應(yīng)的兩個(gè)工作電極表面上，4 °C條件下晾干。(4)分別取4 PL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8 %的BSA溶液，滴涂于(3)得到兩個(gè)工作電極表面上，保持電極濕潤(rùn)3.5 h，4°C下晾干，超純水清洗、晾干，制得一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器。實(shí)施例8
雙通道免疫傳感器的構(gòu)建
(I)取一片雙通道絲網(wǎng)印刷電極，超純水沖洗；分別取5μ 、2 mg-πιΓ1 GS溶液，滴涂到雙通道絲網(wǎng)印刷電極的2個(gè)工作電極表面上，室溫晾干。(2)在(I)中得到的2個(gè)工作電極的表面上分別滴加7PL的1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)混合溶液，保持濕潤(rùn)、孵化1.5 h，超純水清洗，晾干；所述 EDC和NHS的濃度分別為2 mg/mL和lmg/mL。(3)分別取6μ L兩種環(huán)境雌激素一抗(Ab1),分別滴涂于(2)得到的對(duì)應(yīng)的兩個(gè)工作電極表面上，4 °C條件下晾干。(4)分別取5 PL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的BSA溶液，滴涂于(3)得到兩個(gè)工作電極表面上，保持電極濕潤(rùn)3.5 h，4°C下晾干，超純水清洗、晾干，制得一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器。實(shí)施例9
雙通道免疫傳感器的構(gòu)建
(I)取一片雙通道絲網(wǎng)印刷電極，超純水沖洗；分別取6 PLdmgmr1 GS溶液，滴涂到雙通道絲網(wǎng)印刷電極的2個(gè)工作電極表面上，室溫晾干。(2)在(I)中得到的2個(gè)工作電極的表面上分別滴加8μ 的1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)混合溶液，保持濕潤(rùn)、孵化2 h，超純水清洗，晾干；所述EDC和NHS的濃度分別為4 mg/mL和lmg/mL。(3)分別取8 PL兩種環(huán)境雌激素一抗(Ab1),分別滴涂于(2)得到的對(duì)應(yīng)的兩個(gè)工作電極表面上，4 °C條件下晾干。(4)分別取6 μ ，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I %的BSA溶液，滴涂于(3)得到兩個(gè)工作電極表面上，保持電極濕潤(rùn)4 h，4°C下晾干，超純水清洗、晾干，制得一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器。實(shí)施例10
上述制備的一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器，用于己烯雌酚和雌二醇的同時(shí)檢測(cè)，步驟如下:(I)將制得的免疫傳感器溫育在一系列濃度的兩種環(huán)境雌激素對(duì)應(yīng)的抗原溶液中，放置I h，4°C下晾干，清洗電極。(2)滴涂6 PL、Pt@SBA-15/Ab2溶液到(I)得到的電極表面上，晾干、清洗，制得組裝的工作電極，置于4 C冰箱中備用。(3)將參比電極、對(duì)電極和組裝的工作電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入40μ 、5 mmol/L H2O2的pH=7.0的PBS緩沖溶液，用循環(huán)伏安和方波伏安法檢測(cè)傳感器的電流響應(yīng)，根據(jù)所得電流響應(yīng)與己烯雌酚和雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線。(4)將待測(cè)樣品代替己烯雌酚和雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述己烯雌酚和雌二醇工作曲線的繪制方法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例11
上述制備的一種同時(shí)檢 測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器，用于己烯雌酚和雌二醇的同時(shí)檢測(cè)，步驟如下:
(I)將制得的免疫傳感器溫育在一系列濃度的兩種環(huán)境雌激素對(duì)應(yīng)的抗原溶液中，放置I h，4 °C下晾干，清洗電極。(2)滴涂6 PL、Pt@SBA_15/Ab2溶液到(I)得到的電極表面上，晾干、清洗，制得組裝的工作電極，置于4°C冰箱中備用。(3)將參比電極、對(duì)電極和組裝的工作電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入50 μ 、7 mmol/L H2O2的pH=7.4的PBS緩沖溶液，用循環(huán)伏安和方波伏安法檢測(cè)傳感器的電流響應(yīng)，根據(jù)所得電流響應(yīng)與己烯雌酚和雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線。(4)將待測(cè)樣品代替己烯雌酚和雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述己烯雌酚和雌二醇工作曲線的繪制方法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例12
上述制備的一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器，用于己烯雌酚和雌二醇的同時(shí)檢測(cè)，步驟如下:
(I)將制得的免疫傳感器溫育在一系列濃度的兩種環(huán)境雌激素對(duì)應(yīng)的抗原溶液中，放置I h，4 °C下晾干，清洗電極。(2)滴涂6PL、PtiSBA-15/Ab2溶液到(I)得到的電極表面上，晾干、清洗，制得組裝的工作電極，置于4 C冰箱中備用。(3)將參比電極、對(duì)電極和組裝的工作電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入60 μ 、10 mmol/L H2O2的pH=7.8的PBS緩沖溶液，用循環(huán)伏安和方波伏安法檢測(cè)傳感器的電流響應(yīng)，根據(jù)所得電流響應(yīng)與己烯雌酚和雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線。(4)將待測(cè)樣品代替己烯雌酚和雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述己烯雌酚和雌二醇工作曲線的繪制方法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例1(Γ12用于兩種環(huán)境刺激素己烯雌酚和雌二醇的檢測(cè)，己烯雌酚的線性范圍0.001 10.0 ng-mr1，檢測(cè)限為0.28 pg-πιΓ1 ;雌二醇的線性范圍為0.005 8.0 ng-πι Λ檢測(cè)限為1.2 pg'mL—1。
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)氨基化SBA-15的合成 將I g三嵌段共聚物E020P070E020 (P123)溶解在30 mL、1.5 2 mold HCl溶液中，加入2.215 g正硅酸乙酯(TEOS)，混合物在34°C下攪拌Γ5 h，轉(zhuǎn)移到高壓釜在100°C條件下加熱2(T22 h，冷卻后過(guò)濾，將獲得的白色粉末在空氣中干燥，然后在560°C條件下煅燒3 4 h除去模板，合成制得SBA-15 ;將所合成的SBA-15，加l(Tl5mL無(wú)水乙醇，置于100 mL三口燒瓶中，油浴，加熱到70°C后，迅速加入50 μ L 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70°C恒溫回流3h，離心，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀3次，室溫下真空干燥擴(kuò)11 h，得到氨基功能化的SBA-15 ； (2)Pt雜化的SBA-15的合成 將氨基功能化的SBA-15與HPtCl4以質(zhì)量比1: 0.5 I混合并用水稀釋成溶液，將混合物在室溫下攪拌If 24 h，離心后用水重新稀釋，用稀HCl調(diào)節(jié)溶液的pH〈2，攪拌2(Γ25min，得到混合液；將4(Γ50 mmol-Γ1的NaBH4溶液逐滴加入到所述的混合液中，直到所有的HPtCl4全部還原成金屬Pt，將混合液離心、真空干燥，制得Pt雜化的SBA-15 (PtiSBA-15)； (3)石墨烯(GS)溶液制備 將2.0 mg GS溶解于ImL高純水中，超聲0.5^2 h，制成濃度為GS溶液； (4)PtOSBA-15/ 二抗溶液的制備 取I 2 mg Pt@SBA-15分散在I mL的pH 7.4的PBS緩沖溶液中，加入0.5 1.5 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液，攪拌2 4 11;加入廣2 mL兩種環(huán)境雌激素二抗(Ab2)中的一種，將上述混合物在室溫下 攪拌1(T12 h，離心，制得兩種Pt@SBA-15/Ab2溶液，置于4 C下儲(chǔ)存，備用； (5)雙通道免疫傳感器的構(gòu)建 I)取一片雙通道絲網(wǎng)印刷電極，超純水沖洗；分別取4飛PLdmg.!!!!/1 GS溶液，滴涂到雙通道絲網(wǎng)印刷電極的2個(gè)工作電極表面上，室溫晾干； 2)在I)中得到的2個(gè)工作電極的表面上分別滴加的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)混合溶液，保持濕潤(rùn)、孵化f 2 h，超純水清洗，晾干；所述EDC和NHS的濃度分別為4 mg/mL和lmg/mL ； 3)分別取Γ8PL兩種環(huán)境雌激素一抗(Ab1),分別滴涂于2)得到的對(duì)應(yīng)的兩個(gè)工作電極表面上，4 °C條件下晾干； 4)分別取Γ6PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 1溶液，滴涂于3)得到兩個(gè)工作電極表面上，保持電極濕潤(rùn):Γ4 h，4 °C下晾干，超純水清洗、晾干，制得一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器。
2.如權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器的制備方法，所述的環(huán)境雌激素選自己烯雌酚和雌二醇。
3.如權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器的制備方法，(4)中所述兩種環(huán)境雌激素二抗的濃度為40(T50(^g/mL。
4.如權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器的制備方法，(5)中所述兩種環(huán)境雌激素一抗的濃度為5 l(^g/mL。
5.如權(quán)利要求1所述的制備的一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器，用于兩種環(huán)境雌激素己烯雌酚和雌二醇的同時(shí)檢測(cè)，步驟如下: (1)將制得的免疫傳感器溫育在一系列濃度不同的己烯雌酚和雌二醇對(duì)應(yīng)的抗原溶液中，放置I h，4 °C下晾干，清洗電極； (2)滴涂6μ 、PtiSBA-15/Ab2溶液到(I)得到的電極表面上，晾干、清洗，制得組裝的工作電極，置于4 C冰箱中備用； (3 )將參比電極、對(duì)電極和組裝的工作電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入40 60 μ 、5 10 mmol/L H2O2的pH=7.0 7.8的PBS緩沖溶液，用循環(huán)伏安和方波伏安法檢測(cè)傳感器的電流響應(yīng)，根據(jù)所得電流響應(yīng)與兩種環(huán)境雌激素己烯雌酚和雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線； (4)將待測(cè)樣品代替兩種環(huán)境雌激素己烯雌酚和雌二醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照所述己烯雌酚和雌二醇工作曲線的繪制方 法進(jìn)行檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種同時(shí)檢測(cè)兩種環(huán)境雌激素的傳感器的制備方法及應(yīng)用，屬于納米功能材料、環(huán)境檢測(cè)、生物免疫技術(shù)和電化學(xué)分析領(lǐng)域。將Pt雜化的SBA-15納米復(fù)合材料標(biāo)記二抗，通過(guò)測(cè)定材料對(duì)底液中過(guò)氧化氫的催化性能，制備一種雙通道印刷電極電化學(xué)免疫傳感器，實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種環(huán)境雌激素己烯雌酚和雌二醇的同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明制備簡(jiǎn)單、加工方便、便于攜帶；該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性好。
文檔編號(hào)G01N27/48GK103235144SQ20131013686
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者魏琴, 杜斌, 于海琴, 吳丹, 張勇, 毛珂霞, 李賀, 馬洪敏 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)