篩選方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及改善的篩選方法以及，具體地，涉及鑒定特異性針對(duì)差異的和/或不經(jīng)常表達(dá)的配體的抗配體的篩選抗配體文庫(kù)的方法。
【專利說(shuō)明】篩選方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及改進(jìn)的篩選方法以及，具體地，涉及篩選抗配體文庫(kù)的方法，以鑒定對(duì)差異化表達(dá)的和/或不經(jīng)常表達(dá)的配體特異的抗配體。
【背景技術(shù)】
[0002]基于蛋白質(zhì)或多肽的文庫(kù)經(jīng)常用于對(duì)某些配體具有特異性的抗配體分子的選擇。
[0003]此類文庫(kù)的構(gòu)造使蛋白質(zhì)分子以某種方式物理地連接到(physically linkedto)編碼特定蛋白質(zhì)分子的遺傳信息。因此，該蛋白分子與其基因一起被展示。
[0004]常用的展示形式依賴于細(xì)胞或病毒宿主顆粒來(lái)提呈所述蛋白分子；并且包括細(xì)菌展不(Francisco 等，1993)和卩遼菌體展不(Smith, 1985 ；Smith 和 Scott, 1993 ；ffinter 等，1994)。這些系統(tǒng)在宿主顆粒的表面展示潛在的抗配體分子，同時(shí)所展示分子的遺傳信息藏于顆粒內(nèi)部并且所述方法已被成功應(yīng)用于基于特異性蛋白質(zhì)的抗配體的篩選。
[0005]存在依賴于體外翻譯的其他展示形式；包括各種形式的依賴于遺傳信息與蛋白質(zhì)分子的非共價(jià)連接的核糖體展示(Mattheakis等，1994 ；Hanes和Pluckthun, 1997 ；He和Taussig, 1997);并且其他展示形式也依賴于體外翻譯，借此，在遺傳信息和潛在抗配體蛋白質(zhì)分子之間存在共價(jià)連接，例如Profusion (Weng等,2002)或共價(jià)展示技術(shù)(Gao等，1997)。
[0006]所展示的肽或蛋白質(zhì)類抗配體庫(kù)可以是完全隨機(jī)化的，例如，當(dāng)使用肽文庫(kù)時(shí)，或它們可以基于插入賦予變異性的其他結(jié)構(gòu)的恒定區(qū)的支架結(jié)構(gòu)(constant regionscaffold structure)。
[0007]通常使用的支架結(jié)構(gòu)基于抗體重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(McCafferty等，1990),但還可以基于其它支架例如纖維連接蛋白(fibronectin) (Jacobsson和Frykberg,1995 ；Koide等，1998)、蛋白A結(jié)構(gòu)域(Stahl等，1989)或小的穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)域，例如BPTI(Markland 等，1991)。
[0008]從展示文庫(kù)選擇顯示一定的結(jié)合特異性的抗配體通常通過(guò)使用所謂“生物淘選(biopanning)”的方法來(lái)進(jìn)行。
[0009]靶配體可以固定于固相表面并且文庫(kù)的特異性抗配體成員暴露給固定的靶配體以使感興趣的抗配體與靶配體結(jié)合。未結(jié)合的文庫(kù)成員隨后被洗去并且感興趣的抗配體被回收并擴(kuò)增。
[0010]除了抗配體文庫(kù)成員之外的蛋白質(zhì)類顆粒，例如表達(dá)抗體片段的噬菌體，可能是“粘性的(Sticky)”，導(dǎo)致一些非靶特異性分子的結(jié)合與分離。非特異性結(jié)合可以通過(guò)以下方式最小化:加入某些化合物至抗配體展示構(gòu)建體/配體混合物中以用作阻斷劑從而減少非特異性抗配體的背景結(jié)合，例如牛奶、牛血清白蛋白、血清(人/胎牛)、明膠以及對(duì)于某些(非細(xì)胞)應(yīng)用，去污劑(detergent)。
[0011]許多洗滌程序已經(jīng)被設(shè)計(jì)用來(lái)減少文庫(kù)成員與細(xì)胞的非特異性結(jié)合，并幫助細(xì)胞從污染和/或非特異性結(jié) 合的文庫(kù)成員上分離。[0012]此類方法包括洗滌通過(guò)磁力固定于柱子上的細(xì)胞(Siegel等，1997)，以最小化剪切力并允許解離的噬菌體的重新結(jié)合。洗滌細(xì)胞的另一個(gè)方法是在更高密度介質(zhì)例如Ficoll或Percoll中離心，以選擇性去除非特異性和低親和力抗配體，并且進(jìn)一步在空間上從游離抗配體和非特異性結(jié)合的抗配體中分離細(xì)胞和細(xì)胞結(jié)合的抗配體(Carlsson等，1988 !Williams和 Sharon，2002)。
[0013]取決于篩選方法(selection process)的有效性,可能需要幾輪淘選來(lái)去除或至少充分減少非特異性抗配體至期望的水平(Dower等，1991)。
[0014]在另一個(gè)篩選方法(selection method)中，祀配體結(jié)合同處于溶液中的特異性抗配體文庫(kù)成員。然后結(jié)合的抗配體通過(guò)采用例如可回收的標(biāo)簽而分離，所述標(biāo)簽附加至靶配體。最常使用的標(biāo)簽是生物素，其允許靶分子和所展示的特異性文庫(kù)成員之間的復(fù)合體(complex)通過(guò)采用結(jié)合至固相支持物例如珠子上的親和素而得到回收(Siegel等，1997)。
[0015]當(dāng)靶配體是公知的且以純化的形式提供時(shí)采用這些方法。一次針對(duì)一個(gè)單獨(dú)靶配體的篩選是常規(guī)的。針對(duì)幾種限定的靶配體的篩選可同時(shí)進(jìn)行。靶配體可以是一種或更多種的小的半抗原、蛋白質(zhì)、碳水化合物、DNA和脂類。
[0016]對(duì)于許多應(yīng)用，針對(duì)差異表達(dá)的配體的特異性抗配體是感興趣的。例如，當(dāng)與那些健康對(duì)照相比，蛋白質(zhì)可在源自患有疾病的患者的細(xì)胞和組織上差異表達(dá)。這些疾病包括微生物、病毒或寄生蟲感染，哮喘，慢性炎癥和自身免疫性疾病，癌癥，神經(jīng)、心血管或胃腸道疾病。相似的，體液的蛋白質(zhì)組成，例如，血漿、腦脊液、尿液、精液、唾液和粘液，可能在健康對(duì)照和患有疾病的患者之間存在差異。
[0017]因此，除了它們作為鑒定差異表達(dá)的配體的研究工具的常規(guī)應(yīng)用，特異性針對(duì)差異表達(dá)的配體的抗配體可以用作診斷、預(yù)防和/或治療疾病的工具。
[0018]基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的最新進(jìn)展已經(jīng)表明了許多至今尚未確定為差異表達(dá)的分子的存在，強(qiáng)調(diào)了用于針對(duì)這些潛在的靶配體產(chǎn)生特異性的抗配體的方法的重要性。
[0019]許多這些差異表達(dá)的分子被期望著表達(dá)在細(xì)胞表面上，借此組成采用例如特異性抗體的靶向治療的潛在靶標(biāo)，所述特異性抗體可以偶聯(lián)至生物活性(例如細(xì)胞毒性)試劑上。
[0020]巨大并且高度多樣性的抗配體展示文庫(kù)提供特異性針對(duì)碳水化合物、蛋白質(zhì)、月旨類或其組合作用的未知細(xì)胞配體的抗配體的分離方法。
[0021]原則上，當(dāng)前可用的生物淘選過(guò)程包括基于全細(xì)胞、細(xì)胞部分和細(xì)胞膜的方法，其允許顯示特異性針對(duì)天然構(gòu)型的細(xì)胞膜配體的抗配體的展示構(gòu)建體的分離。
[0022]人類和人源化的治療性抗體日益被用于治療各種疾病，包括急性和慢性炎癥性疾病、免疫和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及癌癥。人類治療性抗體被認(rèn)為是治療人類疾病最吸引人的方式，這是由于它們完全的人類來(lái)源以及相關(guān)的免疫原性的缺乏，參與抗體Fe依賴的宿主免疫效應(yīng)機(jī)制的優(yōu)化能力，以及它們與其鼠源、嵌合和人源化的相似抗體相比優(yōu)異的體內(nèi)半衰期。現(xiàn)在人類抗體通常通過(guò)不同的技術(shù)產(chǎn)生，包括人源化小鼠和高度多樣性的噬菌體抗體文庫(kù)。
[0023]大的(>105獨(dú)特 的(unique)抗體克隆)人類抗體文庫(kù)足夠多樣性，包含特異性針對(duì)顯著數(shù)量的抗原的高親和力抗體，所述抗原包括幾乎所有種類的自體抗原。在自體免疫疾病中，自體抗原是除了作為正常組織成分之外還是體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的靶標(biāo)，代表了突出的治療意義上的抗原種類。
[0024]人類抗體文庫(kù)還被認(rèn)為與攜帶人類免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠相比，當(dāng)選擇結(jié)合人類和小鼠之間結(jié)構(gòu)上保守的受體表位的抗體時(shí)，提供了優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@類抗體在體內(nèi)是通過(guò)自身耐受機(jī)制負(fù)向選擇的。這些保守的區(qū)域尤其具有治療意義，因?yàn)楸Ｊ貐^(qū)域經(jīng)常是功能相關(guān)的(例如結(jié)合所必須的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且賦予配體/受體誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng))，并且靶向這些保守表位的抗體可被篩選為協(xié)同實(shí)驗(yàn)疾病模型系統(tǒng)內(nèi)的體內(nèi)治療活性。
[0025]特異性針對(duì)幾乎所有種類人類可溶性抗原(例如細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、脂類、碳水化合物和綴合分子等)，以及細(xì)胞表面受體(例如1TM、4TM、7TM和多TM跨膜受體等)的高親和力抗體已經(jīng)成功從高度多樣性人類抗體文庫(kù)中分離出來(lái)。
[0026]細(xì)胞表面受體組成了一類具有突出的治療意義的靶標(biāo)，并且結(jié)合不同癌癥細(xì)胞相關(guān)受體的幾種抗體已被證實(shí)用于癌癥治療，包括利妥昔單抗(rituximab)(抗⑶20)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(抗 Her2)和西妥昔單抗(cetuximab)(抗 EGFR)。
[0027]但是，從抗體受體特異性并不能很容易地預(yù)測(cè)治療的有效性；針對(duì)相同靶受體的抗體可能在治療有效性上差別很大，不依賴于它們的結(jié)合親和力(Beers等，2008 ；Cragg和Glennie，2004)，并且針對(duì)替代的分子靶標(biāo)的抗體可能顯示是有希望的，并且有時(shí)是意想不到的治療潛力(Beck等，2010 ;Cheson和Leonard，2008)。例如，不同CD20特異性抗體克隆與CD20抗原具有相似的結(jié)合親和力并攜帶相同的小鼠IgG2a恒定區(qū)，但在體內(nèi)消耗B細(xì)胞的能力根本上不同(Beers等，2008 ；Cragg和Glennie，2004)，并且針對(duì)其他不是CD20的腫瘤相關(guān)細(xì)胞表面 受體的抗體可能具有針對(duì)B細(xì)胞癌癥的顯著抗腫瘤活性(綜述請(qǐng)參見Cheson 和 Leonard,2008)。
[0028]因此，在高度多樣性的抗體文庫(kù)中，對(duì)任何給定類型的癌癥最具治療有效性的、強(qiáng)力的和最耐受的抗體很可能是特異性針對(duì)幾種不同受體的任何一種，并且在高度多樣性的文庫(kù)中鑒定治療性優(yōu)化的抗體克隆需要對(duì)多個(gè)并且理想狀況下所有的特異性針對(duì)不同疾病細(xì)胞相關(guān)的受體的文庫(kù)成員進(jìn)行功能篩選。
[0029] 申請(qǐng)人:之前已經(jīng)開發(fā)了能夠從人類噬菌體抗體文庫(kù)回收結(jié)合至不同表面受體的抗體克隆的篩選技術(shù)(生物淘選方法)，與其他細(xì)胞群體(非靶細(xì)胞)相比所述受體在一種細(xì)胞群體(靶細(xì)胞)上差異表達(dá)(W02004/023140，F(xiàn)ransson 等，2006 ；Frendeus, 2006)(在下文中被稱為差異生物淘選)。W02004/023140的公開內(nèi)容(和其所有國(guó)家階段遞交的衍生內(nèi)容)全文作為參考引入本發(fā)明。
[0030]這個(gè)篩選方法實(shí)質(zhì)上包括六個(gè)步驟，如圖1所示。重要的是，這個(gè)方法包括以下順序的篩選步驟:
[0031]I)差異生物淘選，然后
[0032]2)篩選靶標(biāo)對(duì)非靶標(biāo)的特異性，然后
[0033]3)更小量的克隆通過(guò)Sanger技術(shù)進(jìn)行常規(guī)測(cè)序
[0034]采用這個(gè)技術(shù)，使得產(chǎn)生顯示針對(duì)差異表達(dá)表面受體的靶細(xì)胞對(duì)非靶細(xì)胞的高特異性的抗體池成為可能。
[0035]Sanger測(cè)序是當(dāng)前用于在“低通量”方式下鑒定獨(dú)特結(jié)合物的技術(shù)的一個(gè)例子。其他例子包括在限制性酶消化之前和之后跑抗體基因DNA的膠，并通過(guò)對(duì)不同的限制性酶(間接地，不同的序列)不同的敏感性揭示獨(dú)特大小。
[0036]當(dāng)用于分離靶向癌癥B細(xì)胞(靶標(biāo))對(duì)T細(xì)胞(非靶標(biāo))差異表達(dá)的表面受體的抗體時(shí)(“B非T” (BnonT)差異淘選)，該方法鑒定了針對(duì)不同靶細(xì)胞差異表達(dá)的表面受體的抗體，包括HLA-DR、表面Ig和ICAM-1 (表1)。
[0037]表1.通過(guò)現(xiàn)有篩選方法分離的抗體的頻率和特異性，例如連續(xù)差異生物淘選、結(jié)合篩選和Sanger測(cè)序，靶向癌癥B細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞差異表達(dá)的表面受體(“B非T”差異淘選)
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種分離針對(duì)至少一種差異表達(dá)的靶配體的至少一種抗配體的方法，包括以下步驟: (a)對(duì)抗配體的文庫(kù)進(jìn)行差異生物淘選以分離至少一種抗配體；以及 (b)對(duì)步驟(a)中分離的抗配體進(jìn)行高通量測(cè)序。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括以下步驟: (c)對(duì)特異性針對(duì)差異表達(dá)的配體的抗體進(jìn)行驗(yàn)證篩選。
3.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中差異生物淘選步驟包括以下子步驟: (i)提供抗配體的文庫(kù)； (ii)提供含有固定至或整合入減法配體構(gòu)建體的配體的第一配體群； (iii)提供含有固定至或整合入靶配體構(gòu)建體的、與步驟(ii)的配體相同的配體的第二配體群； (iv)通過(guò)使用從質(zhì)量作用的普遍規(guī)律得出的一個(gè)或多個(gè)方程確定群中減法配體構(gòu)建體和靶配體構(gòu)建體的量:
4.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中高通量測(cè)序步驟利用454測(cè)序、Illumina、SOLiD方法或Helicos系統(tǒng)進(jìn)行。
5.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中驗(yàn)證篩選步驟利用流式細(xì)胞術(shù)、FMAT、ELISA、MSD 或 CBA 進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其中配體不表達(dá)于靶構(gòu)建體或減法構(gòu)建體之一。
7.如權(quán)利要求3或6所述的方法，包括從配體釋放抗配體的進(jìn)一步步驟。
8.如權(quán)利要求3或6或7所述的方法，其中步驟(ii)至(ix)平行進(jìn)行，以分離針對(duì)多個(gè)不同配體的多個(gè)抗配體。
9.如權(quán)利要求3或6-8所述的方法，其中步驟(ii)至(ix)重復(fù)一次或多次。
10.如權(quán)利要求3或6-9所述的方法，其中減法構(gòu)建體或靶構(gòu)建體之一的量以過(guò)量于減法構(gòu)建體或靶構(gòu)建體另一個(gè)的方式提供。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中配體的過(guò)量在10和1000倍之間或在2和10倍之間或1000和I, 000，000倍之間。
12.如權(quán)利要求3或6-11所述的方法，其中步驟(iv)的方程是:
13.如權(quán)利要求3或6-12所述的方法，其中分離裝置選自固相支持物、細(xì)胞膜和/或其部分、合成膜、珠子、化學(xué)標(biāo)簽和自由配體的至少一種。
14.如權(quán)利要求3或6-13所述的方法，其中減法構(gòu)建體和靶構(gòu)建體的分離裝置具有不同的密度。
15.如權(quán)利要求3或6-14所述的方法，其中減法構(gòu)建體的分離裝置為膜囊或整個(gè)細(xì)胞膜。
16.如權(quán)利要求3或6-15所述的方法，其中步驟(ix)利用密度離心、固相支持封存、磁珠封存、化學(xué)標(biāo)簽結(jié)合和水相分配的至少一種進(jìn)行。
17.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(a)的文庫(kù)是包含多個(gè)展示抗配體的文庫(kù)成員的展示文庫(kù)。
18.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中文庫(kù)是噬菌體展示文庫(kù)。
19.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中配體是抗原；受體配體；以及含有碳水化合物、蛋白質(zhì)、肽、脂類、多核苷酸、無(wú)機(jī)分子和綴合分子的至少一種的酶靶標(biāo)的至少一種。
20.如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中抗配體文庫(kù)可通過(guò)抗體和抗原結(jié)合性變體、其衍生物或其片段；具有工程化的可變表面的支架分子；受體；和酶的至少一種進(jìn)行構(gòu)建。
21.如權(quán)利要求3或6-20所述的方法，其還包括暴露配體及其分離裝置至影響靶配體在所述配體構(gòu)建體上的表達(dá)的刺激物的進(jìn)一步步驟。
22.—種制備藥物組合物的方法，其包括，在通過(guò)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法鑒定具有期望性質(zhì)的抗配體后，將所述抗配體加至藥學(xué)上可接受的載體。
23.由權(quán)利要求22的方法制備的藥物組合物，其用于醫(yī)藥中。
24.權(quán)利要求23的藥物組合物在制備用于預(yù)防、治療、成像、診斷或預(yù)后疾病的藥物中的用途。
25.實(shí)質(zhì)上如本發(fā)明·實(shí)施例和附圖所述的方法。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103827302SQ201280046053
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月22日
【發(fā)明者】比約恩·弗倫多斯, 詹妮·馬特森 申請(qǐng)人:生物發(fā)明國(guó)際公司