用于檢測液態(tài)介質(zhì)中纖溶酶原的方法、相關(guān)組合物及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測試樣中纖溶酶原的方法，所述方法具體包括將鏈激酶（R1）和鏈激酶激活劑與校核液或稀釋血漿試樣進(jìn)行反應(yīng)，其中所述鏈激酶激活劑選自纖維蛋白DD片段和/或至少一種DD片段衍生物組成的組。本發(fā)明還涉及液態(tài)組合物、用于實(shí)現(xiàn)該方法的纖溶酶原檢測試劑盒以及選自纖維蛋白DD片段和/或至少一種DD片段衍生物組成的組的鏈激酶激活劑的用途。
【專利說明】用于檢測液態(tài)介質(zhì)中纖溶酶原的方法、相關(guān)組合物及試劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于檢測試樣中纖溶酶原的方法，具體的涉及通過液體試劑來檢測試樣中纖溶酶原的方法，更具體的涉及通過可以長期保存的即用型試劑來檢測試樣中纖溶酶原的方法。
[0002]此類檢測要求激活試樣中的纖溶酶原，這一般是利用鏈激酶來實(shí)現(xiàn)的。
[0003]關(guān)于此點(diǎn)，溶液由鏈激酶和鏈激酶激活劑(纖維蛋白原)組成。但是，纖維蛋白原難以以液體形態(tài)保存，導(dǎo)致檢測結(jié)果會(huì)隨著纖維蛋白原的保存時(shí)間做函數(shù)變化。
【背景技術(shù)】
[0004]因此，為了克服以上缺陷，第5879823號(hào)美國專利公開了一種利用氨基酸確定的寡肽來進(jìn)行穩(wěn)定的纖溶酶溶液。該溶液并不完全令人滿意，因?yàn)樗鼉H局限于所述纖溶酶溶液的穩(wěn)定，而不適用于纖溶酶原激活劑溶液(如纖維蛋白原)的穩(wěn)定。另外，該溶液也無法滿足利用在病 人抽血很久之前制備的即用型液體制劑對患者血液中存在的纖溶酶原進(jìn)行檢測的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷并具體的提供用于檢測試樣中纖溶酶原的方法，所述方法包括以下步驟:
a將反應(yīng)物i，即鏈激酶和鏈激酶激活劑，與反應(yīng)物ii，即校核液或稀釋血漿試樣，進(jìn)行反應(yīng)；
b利用反應(yīng)追蹤物(SPm)來追蹤所述反應(yīng)；
c確定所述校核液或稀釋血漿試樣中纖溶酶原的量，將其作為所述反應(yīng)追蹤結(jié)果的函數(shù)。
[0006]在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述方法由以上步驟組成。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的方法中所使用的鏈激酶激活劑為一種或多種化合物，所述化合物選自纖維蛋白DD片段和/或DD片段衍生物組成的組。所述的DD (或D-二聚體)片段，是指含有兩個(gè)來自不同纖維蛋白原(fibrogen)分子的交叉連接D區(qū)域的纖維蛋白的次級片段，其可通過例如纖維蛋白酶解法來獲得。
[0008]因此，本發(fā)明所使用的DD片段可以來自纖維蛋白或裂解的血凝塊。也可以使用重組DD片段。還可以使用不純DD片段，例如纖維蛋白降解碎片。所述DD片段衍生物是指包括至少某些上述DD片段的分子，特別是鏈激酶激活過程中所涉及的DD片段的氨基酸。在優(yōu)選具體實(shí)施里中，所述衍生物與所述DD片段具有至少70%的序列一致性，更優(yōu)選的具有至少80%的序列一致性，最優(yōu)選的具有至少90%或95%以上的序列一致性。
[0009]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述DD片段衍生物可以包括例如比DD片段更多的氨基酸并且包括例如D- 二聚體/片段E復(fù)合物。[0010]所述反應(yīng)追蹤物或化合物(SPm)可以為例如接枝在基材、鏈激酶和鏈激酶激活劑形成的酶產(chǎn)物或所述酶上的分子。所述接枝可以通過例如化學(xué)合成來進(jìn)行。所述反應(yīng)追蹤物或化合物(SPm)也可以為能夠與基材、所述酶的產(chǎn)物或所述酶相連的分子。
[0011]被選定的所述追蹤物或化合物能夠通過例如生成顏色或熒光或?qū)е骂伾驘晒庀Щ蚴峭ㄟ^改變所述反應(yīng)介質(zhì)的吸光度來追蹤所述酶的反應(yīng)。
[0012]在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，反應(yīng)追蹤化合物為專門用于纖溶酶和纖溶酶-鏈激酶復(fù)合物的顯色基材。此類化合物在本領(lǐng)域內(nèi)已知的例子包括但不限于由Chromogenix出售的S-2403? 和 S-2251? 以及 Hyphen Biomed 公司出售的 SPm41。
[0013]在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述反應(yīng)可以在抗凝劑存在的情況下進(jìn)行，所述抗凝劑優(yōu)選的為水蛭素或任何其它凝血酶抑制劑。
[0014]優(yōu)選的，所述方法包括在反應(yīng)步驟a之前的將所述鏈激酶激活劑存放在即用型溶液中的步驟。因此，所述方法并不要求在使用前才制備鏈激酶激活劑溶液。另外，所述鏈激酶激活劑在溶液中處于穩(wěn)定狀態(tài)并可與例如鏈激酶共同保存，而不會(huì)改變其理化性質(zhì)和在所述纖溶酶原檢測進(jìn)行中的效能。在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述鏈激酶和鏈激酶激活劑可以共同封裝。
[0015]在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述鏈激酶激活劑存放步驟在溫度處于-20°C和37°C之間時(shí)進(jìn)行。在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述鏈激酶激活劑的存放溫度為2-10°C，更優(yōu)選的為4_8°C。在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述鏈激酶激活劑適于存放在室溫下或不要求特定存放條件。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的 一個(gè)【具體實(shí)施方式】，所述存放步驟可以持續(xù)12小時(shí)以上，優(yōu)選的持續(xù)24小時(shí)至24個(gè)月，更優(yōu)選的持續(xù)24小時(shí)至18個(gè)月。
[0017]作為可選項(xiàng)，所述鏈激酶激活劑在防腐劑和/或抗生素(如環(huán)丙沙星)存在的情況下存放。
[0018]優(yōu)選的，所述方法還包括在所述反應(yīng)步驟a之前將所述鏈激酶(Rl)和鏈激酶激活劑保持在約37?的預(yù)溫育(pre-1ncubation)步驟。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】，所述反應(yīng)步驟a在約37°C的條件下進(jìn)行，優(yōu)選的進(jìn)行約3至6分鐘。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】，所述反應(yīng)步驟a通過酸化步驟停止，優(yōu)選的通過添加檸檬酸來停止。
[0021]本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于檢測試樣中存在的纖溶酶原的組合物，其中所述組合物包括鏈激酶激活劑，其特征在于所述鏈激酶激活劑為一種或多種化合物，所述化合物選自纖維蛋白DD片段和/或至少一種DD片段衍生物組成的組。
[0022]在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述組合物還包括抗凝劑，所述抗凝劑優(yōu)選的為水蛭素。
[0023]在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述組合物為即用型溶液。
[0024]在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中,包括所述鏈激酶激活劑的所述組合物還包括鏈激酶。
[0025]在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述組合物適于作為即用型溶液。在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述組合物包括約100μ g/ml或可以簡單的稀釋至100μ g/ml的濃度(例如100 μ g/ml至lmg/ml的濃度)的鏈激酶激活劑溶液。在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述組合物在使用前無需進(jìn)一步處理，也無需進(jìn)一步稀釋。[0026]在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述組合物不包括纖維蛋白原。在更加優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，所述組合物包括DD片段和/或一種或多種DD片段衍生物，而不包括另一種鏈激酶激活劑。在更加優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，所述組合物僅包括一種鏈激酶激活劑，所述鏈激酶激活劑優(yōu)選的為DD片段和/或一種或多種DD片段衍生物。
[0027]本發(fā)明還涉及用于檢測試樣中纖溶酶原的試劑盒，所述試劑盒包括一個(gè)或多個(gè)上述【具體實(shí)施方式】中所述的組合物。
[0028]優(yōu)選的，所述試劑盒被設(shè)置為用于實(shí)施上文所述的方法。
[0029]具體而言，本發(fā)明涉及用于檢測試樣中纖溶酶原的試劑盒，所述試劑盒包括鏈激酶、鏈激酶激活劑和用于追蹤鏈激酶、鏈激酶激活劑和稀釋血漿試樣之間反應(yīng)的反應(yīng)追蹤物，其中，所述鏈激酶激活劑為一種或多種化合物，所述化合物選自纖維蛋白DD片段和/或至少一種DD片段衍生物組成的組。更優(yōu)選的，特定試劑盒設(shè)想為供體外使用。這表明所述試劑適于體外使用并可能包括不適于體外使用的試劑，如防腐劑。在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述用于檢測試樣中纖溶酶原的試劑盒包括鏈激酶和鏈激酶激活劑，所述鏈激酶激活劑選自纖維蛋白DD片段和/或至少一種DD片段衍生物組成的組。在更加優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，所述試劑盒還包括追蹤反應(yīng)(即鏈激酶、所述鏈激酶激活劑和稀釋血漿試樣之間的反應(yīng))的反應(yīng)追蹤(SPm)物。
[0030]在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述鏈激酶和鏈激酶激活劑被共同封裝在所述試劑盒中。在更加優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，所述試劑盒中的所述鏈激酶溶液特別適合以約12500至15000IU/ml的量使用。
[0031]在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述用于檢測的試劑盒的特征在于至少一種組合物經(jīng)過體積和重量校準(zhǔn)，從而與校核液或稀釋血漿試樣反應(yīng)，以便基于對所述酶與所述基材之間反應(yīng)的追蹤來快速確定所述校核液或所述稀釋血漿試樣中纖溶酶原的量。
[0032]舉例而言，選定所述試劑盒的組合物使得一體積的鏈激酶/鏈激酶激活劑組合物與一體積的校核液或稀釋血衆(zhòng)試樣混合。在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，選定所述試劑盒的組合物使得所述鏈激酶溶液的濃度約為12500至15000IU/ml。在優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，所述鏈激酶激活劑的濃度約為100μ g/ml.本發(fā)明的另一個(gè)目的是鏈激酶激活劑在檢測試樣中的纖溶酶原過程中的用途，所述鏈激酶激活劑選自纖維蛋白DD片段和/或至少一種DD片段衍生物組成的組。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]通過下文的描述，并結(jié)合附圖，本發(fā)明的其它特征、細(xì)節(jié)和優(yōu)點(diǎn)將被進(jìn)一步闡明。附圖如下:
圖1是根據(jù)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】的方法的總體圖；
圖2是纖維蛋白原替換測試中的校準(zhǔn)曲線；
圖3是具有不同纖維蛋白DD片段濃度的示例性測試中的校準(zhǔn)曲線；
圖4是示例性【具體實(shí)施方式】中用于確定鏈激酶最佳用量的曲線；
圖5展示了經(jīng)過30°C水浴溫育的含有所述DD片段(A)的示例性Rl試劑和作為參照含有纖維蛋白原(B)的示例性Rl試劑的穩(wěn)定性。
[0034] 為了更加明確，相同或近似要素在所有的圖中均以相同的參考標(biāo)記表示?！揪唧w實(shí)施方式】
[0035]參考圖1，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法示例是基于試劑組合物Rl和R2，所述試劑組合物Rl和R2采用例如液體試劑技術(shù)(LRT)以即用型液體形態(tài)保存。
[0036]所述第一試劑組合物Rl包括所述DD片段。DD通過以下方式獲得:通過凝血酶將纖維蛋白原與纖維蛋白凝結(jié)以獲得凝塊；在纖溶酶原存在的條件下通過tPA使所述凝塊降解，以生成纖維蛋白降解產(chǎn)物；通過離子交換層析法進(jìn)一步提純D-二聚體，如有必要還可以采用補(bǔ)充性質(zhì)的凝膠過濾層析法。所述第一試劑組合物Rl中DD片段的濃度優(yōu)選為約0.lmg/ml ;優(yōu)選的采用包括Tris、Na2EDTA、NaCl和BSA的試劑組合(base matrix),但是也可以采用其它試劑組合。為了進(jìn)行質(zhì)量檢測，優(yōu)選的使用‘無Pig’DD片段，即包括微量的纖溶酶原或優(yōu)選的不含纖溶酶原。
[0037]所述第一試劑組合物Rl還包括至少一種防腐劑(preservative),優(yōu)選為環(huán)丙沙星、0.9g/l的疊氮化鈉和0.25ATU/ml的水蛭素。
[0038]最后，所述第一試劑組合物Rl包括鏈激酶。如上所述，最優(yōu)選的鏈激酶激活劑為纖維蛋白D-二聚體。
[0039]所述第二試劑組合物R2包括Hyphen Biomed公司出售的合成基材SPm41、鏈激酶和纖維蛋白原(或DD片段)，其中所述合成基材SPm41能夠在纖溶酶原(pig)存在的條件下釋放出對硝基苯胺(paranitroanilin)。R2還可以包括另一個(gè)基材,所述另一個(gè)基材與所述酶(在此，即所述纖溶酶原-鏈激酶復(fù)合物)的相互反應(yīng)改變了所述反應(yīng)介質(zhì)的吸光度或熒光性。
[0040]優(yōu)選的，所述第二試劑組合物R2通過酸性pH來緩沖，優(yōu)選的使用酒石酸。
[0041]在步驟(a1-aii)中，一體積的所述第一試劑組合物Rl與一體積的校核液(cal)或稀釋血漿試樣(sam)混合，對所得混合物以37°C的溫度溫育3分鐘。
[0042]在步驟(aiii )中，一體積的第二試劑組合物R2被添加至所述混合物并與之混合，然后以37 °C的溫度溫育3分鐘。
[0043]之后，在步驟(b)中，通過改變與所述基材(在此即SPm41)的消耗相關(guān)的吸光度或光密度(OD)來觀察反應(yīng)變化。在使用SPm41的情況下，測定405nm處的吸光度。
[0044]吸光度(光密度)的變化使得在步驟(c )中通過例如校準(zhǔn)曲線來確定纖溶酶原含量(%plg)成為可能。
[0045]所述反應(yīng)優(yōu)選的在步驟(d)中通過例如添加一體積的20g/l的檸檬酸(Η+)來停
止。
[0046]已經(jīng)進(jìn)行了多次對比纖溶酶原檢測試驗(yàn)，包括使用了已知的纖維蛋白原的(+fbg)、未使用纖維蛋白原的(_fbg)以及通過纖維蛋白衍生物使用纖維蛋白原取代物的，參見下表1:
表1:采用纖維蛋白原取代物的測試:
【權(quán)利要求】
1.用于檢測試樣中纖溶酶原的方法，所述方法包括以下步驟: a將反應(yīng)物i，即鏈激酶和鏈激酶激活劑，與反應(yīng)物ii，即校核液或稀釋血漿試樣，進(jìn)行反應(yīng)； b利用反應(yīng)追蹤物(SPm)來追蹤所述反應(yīng)； c確定所述校核液或所述稀釋血漿試樣中纖溶酶原的量，將其作為所述反應(yīng)追蹤結(jié)果的函數(shù)， 其特征在于所述鏈激酶激活劑選自纖維蛋白DD片段和/或至少一種DD片段衍生物組成的組。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)步驟a可以在抗凝劑存在的情況下進(jìn)行，所述抗凝劑優(yōu)選為水蛭素。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，還包括在反應(yīng)步驟a之前的將所述鏈激酶激活劑存放在即用型溶液中的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述存放步驟在溫度處于-20°C和37°C之間時(shí)進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述存放步驟持續(xù)12小時(shí)以上，優(yōu)選的持續(xù)24小時(shí)至24個(gè)月，更優(yōu)選的持續(xù)24小時(shí)至18個(gè)月。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法還包括在所述反應(yīng)步驟a之前將所述鏈激酶(Rl)和鏈激酶激活劑保持在約37°C的預(yù)溫育步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)步驟a在約37°C的條件下進(jìn)行，優(yōu)選的進(jìn)行約3至6分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)步驟a通過酸化步驟停止，優(yōu)選的通過添加檸檬酸來停止。
9.用于檢測試樣中纖溶酶原的組合物，所述組合物含有鏈激酶激活劑，其特征在于所述鏈激酶激活劑選自纖維蛋白DD片段和/或至少一種DD片段衍生物組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于所述組合物還包括抗凝劑，所述抗凝劑優(yōu)選為水蛭素。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的組合物，其特征在于所述組合物存放在即用型溶液中。
12.用于檢測試樣中纖溶酶原的試劑盒，所述試劑盒含有第一試劑組合物(R1)，所述第一試劑組合物包括: -鏈激酶和鏈激酶激活劑，所述鏈激酶激活劑選自纖維蛋白DD片段和/或至少一種DD片段衍生物組成的組；和 -用于追蹤鏈激酶、鏈激酶激活劑和稀釋血漿試樣之間反應(yīng)的反應(yīng)追蹤物(SPm)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其中所述反應(yīng)追蹤物以第二試劑組合物的形式提供，所述第二試劑組合物包括專門用于纖溶酶和纖溶酶-鏈激酶復(fù)合物的顯色基材。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的試劑盒，其中所述第一試劑組合物還包括抗凝劑。
15.含有鏈激酶激活劑的試劑在檢測試樣中纖溶酶原中的用途，其特征在于所述鏈激酶激活劑選自纖維蛋白DD片段和/或至少一種DD片段衍生物組成的組。
【文檔編號(hào)】G01N33/86GK103946390SQ201280043372
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月7日
【發(fā)明者】讓·埃米雷爾 申請人:希森美康株式會(huì)社