專(zhuān)利名稱(chēng)：鏈霉素elisa檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中鏈霉素藥物的試劑盒。
背景技術(shù)：
鏈霉素(Str印tomycin，SM)是一種重要的氨基糖苷類(lèi)抗生素，其作為一種抗生素在治療家畜感染性疾病中發(fā)揮著重要作用，但其耐藥性強(qiáng)，毒副作用較大，若動(dòng)物性食品中有過(guò)量的鏈霉素殘留，則可能對(duì)人造成嚴(yán)重危害。為了保障動(dòng)物源性食品的安全，農(nóng)業(yè)部第235號(hào)文件《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定鏈霉素在牛奶中為200μ g/L，在肌肉、脂肪、肝中為600 μ g/kg，在腎中為1000 μ g/kg。目前鏈霉素殘留的檢測(cè)主要有儀器檢測(cè)方法、微生物學(xué)檢測(cè)法、免疫學(xué)法，如高效液相色譜法、熒光檢測(cè)法、薄層色譜法、質(zhì)譜法、杯碟法、紙片法、酶聯(lián)免疫法、光學(xué)免疫傳感 器等，由于儀器較昂貴，操作繁瑣、費(fèi)用高、不適合進(jìn)行大規(guī)模現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等，ELISA法具有靈敏度高、耗時(shí)少、成本低、大規(guī)模檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，目前市場(chǎng)上已有此類(lèi)檢測(cè)試劑盒。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型所要解決的問(wèn)題是提供一種小巧輕便的鏈霉素殘留量檢測(cè)試劑盒，其操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需要的技術(shù)含量不高，可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品中鏈霉素殘留量的測(cè)定，減少了檢測(cè)樣本所需要的時(shí)間。本實(shí)用新型的技術(shù)方案是一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中鏈霉素殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份說(shuō)明書(shū)和一份質(zhì)檢報(bào)告，其特征在于采用96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板作為固相載體，酶標(biāo)板由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔，在試劑盒酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被鏈霉素偶聯(lián)抗原制成檢測(cè)板，放入真空鋁箔袋中，盒體為硬紙盒，以塑料硬膜為蓋板膜，將6瓶Iml梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、Iml高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液、12ml酶標(biāo)二抗、7ml鏈霉素抗體工作液、7ml底物液A液、7ml底物液B液、7ml終止液、40ml濃縮洗滌液、50ml濃縮復(fù)溶液試劑用不同大小、不同顏色的塑料瓶和玻璃瓶盛裝并固定在泡沫塑料模具中與酶標(biāo)板、蓋板膜、自封袋、說(shuō)明書(shū)、質(zhì)檢報(bào)告一同封裝在硬紙盒內(nèi)，以便于攜帶和運(yùn)輸。每一個(gè)試劑盒中的試劑足夠進(jìn)行96次測(cè)定(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔)，既可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品的檢測(cè)，也可以將板孔拆開(kāi)多次檢測(cè)。將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。檢測(cè)時(shí)，樣本中的鏈霉素將和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的鏈霉素偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗鏈霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與樣本中所含鏈霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中鏈霉素含量，其操作簡(jiǎn)便易行。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒可以檢測(cè)鏈霉素、雙氣鏈霉素、硫Ife鏈霉素，具有很聞的靈敏度肌肉/肝臟樣本的最低檢測(cè)限為2 μ g/kg、血清樣本的最低檢測(cè)限為10 μ g/kg ;牛奶樣本的最低檢測(cè)限為4 μ g/kg ;奶粉樣本的最低檢測(cè)限為20 μ g/kg ;蜂王衆(zhòng)樣本的最低檢測(cè)限為2 μ g/kg ;蜂蜜樣本的最低檢測(cè)限為O. 5 μ g/kg ;肌肉/肝臟樣本的回收率為70%±10% ;血清樣本的回收率為70% ±10% ;牛奶、奶粉樣本的回收率為85% ±25% ;蜂王漿、蜂蜜樣本的回收率為90% ±15% ;相對(duì)于其他鏈霉素檢測(cè)方法，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、氮?dú)獯蹈裳b置、渦旋儀、離心機(jī)、振蕩機(jī)和微量加樣器等，同類(lèi)實(shí)驗(yàn)室一般均有配備,所需成本較低。本實(shí)用新型的有益效果是能快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確地用于鏈霉素殘留量的檢測(cè)。
圖I為本實(shí)用新型酶標(biāo)板的側(cè)面縱剖面圖(長(zhǎng)為8. 55cm)；圖2為本實(shí)用新型酶標(biāo)板的側(cè)面橫剖面圖(長(zhǎng)為12. 8cm)；圖3為本實(shí)用新型酶標(biāo)板的俯視圖； 圖4為本實(shí)用新型蓋板膜平面圖；圖5為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本實(shí)用新型固定泡沫模具俯視圖；圖7為本實(shí)用新型盒體與固定泡沫模具側(cè)視圖。參見(jiàn)附圖酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被鏈霉素偶聯(lián)抗原(3)固定于酶標(biāo)板的外框支撐架(I)上，酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標(biāo)板置水浴或恒溫箱內(nèi)反應(yīng)時(shí)封蓋酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)，蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；透明帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝40ml濃縮洗滌液；藍(lán)色帽的半透明塑料試劑瓶(5)用于封裝50ml濃縮復(fù)溶液；白色帽(6)的白色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml底物液A液，紅色帽(6)的黑色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml底物液B液，黃色帽(6)的白色塑料試劑瓶(7)用于封裝7ml終止液，紅色帽的黃色塑料試劑瓶(8)用于封裝12ml酶標(biāo)二抗，綠色帽的黃色塑料試劑瓶(8)用于封裝7ml鏈霉素抗體工作液，白色帽的白色塑料試劑瓶(9)用于封裝Iml/瓶的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及Iml高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液；泡沫塑料模具(10)有15個(gè)瓶位，放置位置依次為40ml濃縮洗滌液瓶位(11)，50ml濃縮復(fù)溶液瓶位(18)，7ml底物液A液瓶位(12)，7ml底物液B液瓶位(13)，7ml終止液瓶位(14)，7ml鏈霉素抗體工作液瓶位(15)，12ml酶標(biāo)二抗瓶位(16)，6種Iml/瓶各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液及I瓶Iml高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液瓶位(17)，盒體為(19)是硬紙盒。
具體實(shí)施方式
一、樣本的前處理I.配液配液I :PBST緩沖液(雞肉、肝臟提取用)稱(chēng)取5. 2g十二水合磷酸氫二鈉、O. 88g 二水合磷酸二氫鈉、9g氯化鈉和Iml吐溫-20加IL去離子水溶解混勻(用于雞肉、肝臟樣本提取用)。配液2 :提取緩沖液(蜂蜜前處理方法一專(zhuān)用)稱(chēng)取I. 5g十二水合磷酸氫二鈉和Ig庚烷-磺酸鈉鹽，(大約M= 202. 2)加IOOml去離子水溶解混勻，加入O. 75ml濃磷酸調(diào)pH至2. O。配液3:復(fù)溶工作液[0023]用去離子水將IOX濃縮復(fù)溶液按I : 9體積比進(jìn)行稀釋(I份IOX濃縮復(fù)溶液+9份去離子水)用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4°C環(huán)境可保存一個(gè)月。配液4 :洗滌工作液用去離子水將20 X濃縮洗滌液按I : 19體積比進(jìn)行稀釋(I份20 X濃縮洗滌液+19份去離子水)用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4°C環(huán)境可保存一個(gè)月。2.樣本前處理方法 (I)肌肉前處理方法除去肌肉中的脂肪部分，用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱(chēng)取2g±0. 05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml PBST緩沖液用振蕩器振蕩5min，加入正己烷5ml充分上下振蕩混合IOmin后靜置Ih ；3000g以上，室溫(20-25°C /68-77。F)離心15min ;移取Iml中間層至5ml聚苯乙烯離心管中，加入Iml正己燒,用振蕩器充分振蕩5min,3000g以上,室溫(20-250C /68-77° F)離心15min ;除去上層，取下層清液用復(fù)溶工作液按I : 9體積比進(jìn)行稀釋混勻；取50 μ I用于分析。(2)肝臟前處理方法除去肝臟中的脂肪部分，用均質(zhì)器均質(zhì)肝臟樣本，稱(chēng)取5. 0g±0. 05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入20mlPBST緩沖液用振蕩器振蕩30min ；3000g以上，室溫(20-250C /68-77° F)離心IOmin ;移取2ml上層清液至IOml玻璃離心管中，加入3ml正己烷用振蕩器充分振蕩5min ；3000g以上，室溫(20_25°C /68-77° F)離心IOmin ;除去上層，取下層清液用復(fù)溶工作液按I : 9體積比進(jìn)行稀釋混勻；取50 μ I水相進(jìn)行分析。(3)血清前處理方法用加有肝素鈉(20-30單位/ml血)的離心管采集血清樣本(建議采血注射器也用肝素鈉潤(rùn)洗)，血清樣本室溫靜置lh，待析出血漿后，3000g以上，15°C離心IOmin ;取制備好的血漿樣本20μ I至5ml聚苯乙烯離心管，用復(fù)溶工作液按I : 199體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)蝗?0 μ I用于分析。(4)牛奶前處理方法取20 μ I牛奶樣本，加入780 μ I復(fù)溶工作液，混勻；取50 μ I用于分析。(5)奶粉前處理方法稱(chēng)取I. 0g±0. 05g奶粉樣本；加入5ml去離子水，充分振蕩至奶粉全部溶解；取出50 μ 1，加入1950 μ I復(fù)溶工作液，混勻；取50μ I用于分析。(6)蜂蜜前處理方法一稱(chēng)取I. 0g±0. 05g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入IOml提取緩沖液，用振蕩器振蕩IOmin至蜂蜜全部溶解，3000g以上，室溫(20_25°C /68-77° F)離心lOmin，直至清亮。用RIDA C18柱(純化提取物)，用2ml甲醇洗柱子，流速為60d/min ;用2ml去離子水洗柱子，流速為60d/min ;取2ml樣本以流速為15d/min過(guò)柱；用3ml去離子水洗柱子，45d/min ;用氮?dú)饣蚩諝獯蹈芍?；除去柱中水分，用Iml甲醇洗脫樣本,流速為15d/min ；在40 50°C，水浴氮?dú)饬飨峦耆舭l(fā)溶劑；用2!111復(fù)溶工作液溶解干燥的殘留物；取5(^ I進(jìn)行分析。蜂蜜前處理方法二稱(chēng)取I. 0g±0. 05g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中；加入5ml復(fù)溶工作液，用振蕩器振蕩IOmin至蜂蜜全部溶解，3000g以上，室溫(20_25°C /68-77° F)離心lOmin，直至清亮；取200 μ I清亮上清液，加入600 μ I復(fù)溶工作液中，混勻；取50 μ I進(jìn)行分析。(7)蜂王漿前處理方法稱(chēng)取1.0g±0. 05g蜂王漿樣本至50ml聚苯乙烯離心管中；加入4ml去離子水，用振蕩器振蕩混勻；加入2. Og中性氧化鋁，用振蕩器充分振蕩5min后，3000g以上，室溫(20-250C /68-77。F)離心IOmin ;取100 μ I清亮上清液，加入900 μ I復(fù)溶工作液，混勻后；取50 μ I進(jìn)行分析。二、使用試劑盒的操作步驟I、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20_25°C )平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C?！?、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號(hào)將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。5、加標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣本和抗體工作液加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μ I到對(duì)應(yīng)的微孔中，再加入抗體工作液50 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置于37°C避光環(huán)境中反應(yīng)30mino6、洗板小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μ I/孔，充分洗滌4-5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)。7、加酶標(biāo)二抗加入酶標(biāo)二抗100 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min，取出重復(fù)洗板步驟6。8、顯色加入底物液A液50μ I/孔，再加底物液B液50μ I/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min。9、測(cè)定加入終止液50 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測(cè)定每孔OD值。三、結(jié)果判定結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第I種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與鏈霉素含量成負(fù)相關(guān)。I、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值比較即可得出其濃度范圍(μ g/L)。假設(shè)樣本I的吸光度值為O. 152，樣本2的吸光度值為O. 532，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是O μ g/L 為 I. 552 ；0. 05 μ g/L 為 I. 281 ；0. 15 μ g/L 為 0· 901 ；0. 45 μ g/L 為 O. 511 ；1. 35 μ g/L為O. 25 ；4. 05 μ g/L為O. 111。則樣本I的濃度范圍是I. 35 μ g/L-4. 05 μ g/L再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中鏈霉素殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是O. 15 μ g/L-O. 45 μ g/L再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中鏈霉素殘留的濃度范圍。2、定量分析(I)百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，SP百分吸光度值(％) =
權(quán)利要求1.一種鏈霉素ELISA檢測(cè)試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、14瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份說(shuō)明書(shū)和一份質(zhì)檢報(bào)告，其特征在于酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被鏈霉素偶聯(lián)抗原制成的檢測(cè)板，14瓶試劑分別為6瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、I瓶高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、抗體工作液、底物液A液、底物液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液，下凹瓶位共15個(gè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鏈霉素ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標(biāo)板，放于真空鋁箔袋內(nèi)；蓋板膜是塑料硬膜；標(biāo)準(zhǔn)品溶液和高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液均用白色帽的白色塑料瓶，酶標(biāo)二抗用紅色帽的黃色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的黃色PE塑料瓶，底物液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，底物液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶，濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復(fù)溶液用藍(lán)色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶位由塑料泡沫制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鏈霉素ELISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔預(yù)包被鏈霉素偶聯(lián)抗原；蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；標(biāo)準(zhǔn)品溶液 6 瓶，Iml/ 瓶，濃度分另Ij 為 O μ g/L, O. 05 μ g/L, 0. 15 μ g/L, 0. 45 μ g/L, I. 35 μ g/L,.4.05 μ g/L ;高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液I瓶，Iml ;酶標(biāo)二抗I瓶，12ml ;抗體工作液I瓶，7ml ;底物液A液I瓶，7ml ;底物液B液I瓶，7ml ;終止液I瓶，7ml ;濃縮洗滌液I瓶，40ml ;濃縮復(fù)溶液 I 瓶，50ml ο
專(zhuān)利摘要本實(shí)用新型公布一種鏈霉素ELISA檢測(cè)試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、鏈霉素抗體工作液、6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品、底物液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液。采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中含有的鏈霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗鏈霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中鏈霉素藥物的含量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度等特點(diǎn)，可在動(dòng)物源性食品中鏈霉素藥物的含量檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)G01N33/549GK202720227SQ20122018567
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2012年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月26日
發(fā)明者萬(wàn)宇平, 羅曉琴, 孫震, 馮靜, 李勇, 楊秀賢, 劉琳, 扶勝, 李曉芳 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司