專(zhuān)利名稱(chēng)：用于測(cè)定肝素及其鹽相對(duì)分子量及分子量分布的對(duì)照品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于高效凝膠排阻色譜(HPSEC)測(cè)定肝素及其鹽相對(duì)分子量及分子量分布的對(duì)照品，以及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝素是哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在的一種糖胺聚糖，由己糖醛酸和葡萄糖胺通過(guò)1，4_糖苷鍵連接形成，其相對(duì)分子量主要分布在300010000之間，是一種混合物。自1937年起，肝素就被作為抗凝劑應(yīng)用于臨床治療。大量研究表明，肝素的多種生理活性及其體內(nèi)過(guò)程都有分子量依賴(lài)性。首先，肝素的抗凝活性具有分子量依賴(lài)性。肝素分子內(nèi)存在的一種五糖結(jié)構(gòu)能特異性地催化AT III與 凝血因子FXa的結(jié)合，從而抑制FXa的活性。而AT III對(duì)凝血因子FIIa的抑制，除上述五糖結(jié)構(gòu)外，還需要至少13個(gè)單糖殘基，即需要至少含18個(gè)單糖殘基的肝素分子。因此，分子量較大的肝素的抗凝活性?xún)?yōu)于分子量較小的肝素，但同時(shí)前者引發(fā)出血的風(fēng)險(xiǎn)也高于后者。正是基于這一機(jī)制，低分子肝素被開(kāi)發(fā)并應(yīng)用于臨床，其安全性得到顯著提高。第二，肝素的體內(nèi)清除機(jī)制也與其分子量密切相關(guān)。肝素進(jìn)入血液后，可與多種血漿蛋白和血管內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合，進(jìn)而通過(guò)巨噬細(xì)胞及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，這一清除機(jī)制與肝素的分子量及劑量有關(guān)，一般來(lái)說(shuō)，高分子量的肝素更容易被清除。因此，肝素的分子量和分子量分布也是影響其代謝的重要因素。第三，肝素在臨床應(yīng)用過(guò)程中可能會(huì)引發(fā)
的重要副反應(yīng)-血小板減少癥(heparin-1nduced thrombocytopenia, HIT)也與肝素的
分子量有關(guān)。肝素在人體內(nèi)與血小板因子4 (platelet factor4, PF4)形成復(fù)合物,會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生肝素依賴(lài)性抗體，進(jìn)而導(dǎo)致血小板活化，引起強(qiáng)烈的血小板聚集，最終造成血小板減少和血栓形成。有研究證明，未分級(jí)肝素的免疫原性遠(yuǎn)大于低分子肝素。第四，肝素被硫酸魚(yú)精蛋白中和的能力也具有分子量依賴(lài)性。在使用肝素過(guò)程中若發(fā)生出血，則需采用硫酸魚(yú)精蛋白進(jìn)行中和。隨著肝素分子量減小，魚(yú)精蛋白的中和能力也隨之下降。綜上所述，肝素的分子量和分子量分布是其重要的質(zhì)控指標(biāo)，有必要進(jìn)行常規(guī)的監(jiān)控?，F(xiàn)行的美國(guó)藥典、英國(guó)藥典、歐洲藥典及中國(guó)藥典主要對(duì)肝素的鑒別、效價(jià)、相關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、重金屬含量等項(xiàng)目做出了規(guī)定，而對(duì)于肝素的分子量及分子量分布未作出規(guī)定，亦未給出檢測(cè)方法。因此，制定肝素的分子量和分子量分布質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，探索肝素分子量及分子量分布的測(cè)定方法對(duì)于提高肝素的質(zhì)量水平具有重要意義。目前用于測(cè)定肝素類(lèi)分子相對(duì)分子量及分子量分布的方法主要有以下幾種高效分子排阻色譜法(HPSEC )、多角度激光光散射儀法(SEC-MALLS )、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、質(zhì)譜法及核磁共振法。其中，聚丙烯酰胺凝膠電泳法耗時(shí)較長(zhǎng)，操作繁瑣，且小分子量的組分往往因難以著色而被忽略，因此測(cè)定結(jié)果偏大；質(zhì)譜法由于離子化過(guò)程中容易導(dǎo)致硫酸根的中性化，因此難以得到準(zhǔn)確的分子量信息；核磁共振法同樣存在準(zhǔn)確度差的問(wèn)題；多角度激光光散射儀法無(wú)需分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)快速準(zhǔn)確，但是儀器較為昂貴；高效分子排阻色譜法經(jīng)濟(jì)快速，重現(xiàn)性也較好，且能同時(shí)測(cè)出分子量分布信息，但是需要肝素相對(duì)分子量校正標(biāo)準(zhǔn)品，且該標(biāo)準(zhǔn)品的分子量范圍必須涵蓋供試品中各組分的分子量。目前已上市的可用于肝素分子量測(cè)定的是heparin polysaccharide1-VI,其分子量分別為5000Da、7000Da、9000Da、12000Da、15000Da和20000Da。但其分子量范圍無(wú)法覆蓋所有的肝素分子，因此測(cè)定結(jié)果并不準(zhǔn)確。也有文獻(xiàn)報(bào)道以普魯蘭作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定肝素的相對(duì)分子量，但是由于普露蘭的結(jié)構(gòu)與肝素存在本質(zhì)的區(qū)別，因此測(cè)定的相對(duì)分子量并不準(zhǔn)確。綜上所述，制備可用于肝素相對(duì)分子量及分子量分布測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提出了一種寬分布的肝素相對(duì)分子量校正對(duì)照品，包括其制備、相對(duì)分子量和分子量分布測(cè)定方法。本發(fā)明具有較高的實(shí)用價(jià)值，相關(guān)方法嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)，具有良好的推廣應(yīng)用前景。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種用于測(cè)定肝素及其鹽相對(duì)分子量及分子量分布的對(duì)照品，由肝素鈉及其分子量寬分布標(biāo)樣表構(gòu)成，肝素鈉為固體形式，其經(jīng)HPSEC-MALLS測(cè)定的分子量范圍是3000 40000。所述對(duì)照品的平均分子量在15000 20000。 上述對(duì)照品的制備方法如下(I)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肝素的分子量范圍一般在3000 30000，據(jù)此，選擇若干批注射級(jí)肝素鈉原料藥，利用HPSEC-MALLS分別測(cè)定其分子量及分子量分布，從中選擇分子量在3000 40000的肝素樣品作為對(duì)照品。(2)分子量寬分布標(biāo)樣表的制作根據(jù)上述HPSEC-MALLS獲得的肝素分子量累計(jì)分布圖，制作肝素對(duì)照品寬分布標(biāo)樣表，即肝素分子量與其色譜峰累積面積百分比的對(duì)應(yīng)表。本發(fā)明的對(duì)照品，可以用于測(cè)定肝素供試品的相對(duì)分子量及分子量分布，以對(duì)肝素及其鹽進(jìn)行質(zhì)量控制。一種測(cè)定肝素供試品的相對(duì)分子量及分子量分布的方法，步驟如下(I)選擇若干批注射級(jí)肝素鈉原料藥，利用HPSEC-MALLS分別測(cè)定其分子量及分子量分布，從中選擇分子量在3000 40000、平均分子量在15000 20000的肝素樣品作為對(duì)照品；(2)分子量寬分布標(biāo)樣表的制作根據(jù)上述HPSEC-MALLS獲得的肝素分子量累計(jì)分布圖，制作肝素對(duì)照品寬分布標(biāo)樣表，即肝素分子量與其色譜峰累積面積百分比的對(duì)應(yīng)表;(3)對(duì)肝素供試品進(jìn)行HPSEC測(cè)定，并計(jì)算相對(duì)分子量及分子量分布，以進(jìn)行質(zhì)量控制①HPSEC分析分別對(duì)上述對(duì)照品及肝素供試品進(jìn)行HPSEC分析，得色譜圖；②分子量校正曲線(xiàn)的制備根據(jù)步驟(2)制作的對(duì)照品的寬分布標(biāo)樣表，從HPSEC測(cè)定的肝素對(duì)照品的色譜圖依次讀出相應(yīng)特征色譜峰累積峰面積百分比所對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間，并以這一系列保留時(shí)間對(duì)其在寬分布標(biāo)樣表中對(duì)應(yīng)分子量的對(duì)數(shù)值進(jìn)行常規(guī)3次曲線(xiàn)方程擬合(EmpOWer2.0自動(dòng)擬合)，得到校正曲線(xiàn)；
③利用上述得到的校正曲線(xiàn)，將供試品的保留時(shí)間代入該校正曲線(xiàn)，對(duì)供試品的色譜圖中的肝素色譜峰進(jìn)行積分，即可獲得供試品的相對(duì)分子量和分子量分布；質(zhì)量是否合格的判斷根據(jù)測(cè)定的結(jié)果，判斷肝素供試品的質(zhì)量是否符合要求。所述步驟(I)中，HPSEC-MALLS的色譜條件如表I所示表I
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)定肝素及其鹽相對(duì)分子量及分子量分布的對(duì)照品，其特征在于由肝素鈉及其分子量寬分布標(biāo)樣表構(gòu)成，肝素鈉為固體形式，其經(jīng)HPSEC-MALLS測(cè)定的分子量范圍是 3000 40000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于測(cè)定肝素及其鹽相對(duì)分子量及分子量分布的對(duì)照品，其特征在于所述對(duì)照品的平均分子量在15000 20000。
3.權(quán)利要求1或2所述的用于測(cè)定肝素及其鹽相對(duì)分子量及分子量分布的對(duì)照品的制備方法，其特征在于步驟如下 (1)選擇若干批注射級(jí)肝素鈉原料藥，利用HPSEC-MALLS分別測(cè)定其分子量及分子量分布，從中選擇分子量在3000 40000的肝素樣品作為對(duì)照品； (2)分子量寬分布標(biāo)樣表的制作根據(jù)上述HPSEC-MALLS獲得的肝素分子量累計(jì)分布圖，制作肝素對(duì)照品寬分布標(biāo)樣表。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中，HPSEC-MALLS的色譜條件如表I所示 表I
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，肝素對(duì)照品寬分布標(biāo)樣表的具體制作方法為根據(jù)步驟(I)選定的肝素對(duì)照品的分子量范圍，從MALLS測(cè)定的最小分子量開(kāi)始，到分子量累積百分比為99%的分子量為止，根據(jù)分子量分布累積百分比取5 20個(gè)點(diǎn)，分別讀出其對(duì)應(yīng)的分子量，建立起肝素分子量-累積面積百分比的對(duì)應(yīng)表，即肝素對(duì)照品寬分布標(biāo)樣表。
6.權(quán)利要求1或2所述的用于測(cè)定肝素及其鹽相對(duì)分子量及分子量分布的對(duì)照品在測(cè)定肝素供試品的相對(duì)分子量及分子量分布中的應(yīng)用。
7.一種測(cè)定肝素供試品的相對(duì)分子量及分子量分布的方法，其特征在于步驟如下 (1)選擇若干批注射級(jí)肝素鈉原料藥，利用HPSEC-MALLS分別測(cè)定其分子量及分子量分布，從中選擇分子量在3000 40000、平均分子量在15000 20000的肝素樣品作為對(duì)照品； (2)分子量寬分布標(biāo)樣表的制作根據(jù)上述HPSEC-MALLS獲得的肝素分子量累計(jì)分布圖，制作肝素對(duì)照品寬分布標(biāo)樣表，即肝素分子量與其色譜峰累積面積百分比的對(duì)應(yīng)表；(3)對(duì)肝素供試品進(jìn)行HPSEC測(cè)定，并計(jì)算相對(duì)分子量及分子量分布，以進(jìn)行質(zhì)量控制 ①HPSEC分析分別對(duì)上述對(duì)照品及肝素供試品進(jìn)行HPSEC分析，得色譜圖； ②分子量校正曲線(xiàn)的制備根據(jù)步驟(2)制作的對(duì)照品的寬分布標(biāo)樣表，從HPSEC測(cè)定的肝素對(duì)照品的色譜圖依次讀出相應(yīng)特征色譜峰累積峰面積百分比所對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間，并以這一系列保留時(shí)間對(duì)其在寬分布標(biāo)樣表中對(duì)應(yīng)分子量的對(duì)數(shù)值進(jìn)行3次曲線(xiàn)方程擬合，得到校正曲線(xiàn)； ③利用上述得到的校正曲線(xiàn)，將供試品的保留時(shí)間代入該校正曲線(xiàn)，對(duì)供試品的色譜圖中的肝素色譜峰進(jìn)行積分，即可獲得供試品的相對(duì)分子量和分子量分布。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的測(cè)定方法，其特征在于所述步驟(I)中，HPSEC-MALLS的色譜條件如表I所示 表I
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的測(cè)定方法，其特征在于所述步驟(2)中，肝素對(duì)照品寬分布標(biāo)樣表的具體制作方法為根據(jù)步驟(I)選定的肝素對(duì)照品的分子量范圍，從MALLS測(cè)定的最小分子量開(kāi)始，到分子量累積百分比為99%的分子量為止，根據(jù)分子量分布累積百分比取5 20個(gè)點(diǎn)，分別讀出其對(duì)應(yīng)的分子量，建立起肝素分子量-累積面積百分比的對(duì)應(yīng)表，即肝素對(duì)照品寬分布標(biāo)樣表。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的測(cè)定方法，其特征在于所述步驟(3)①中，HPSEC分析的色譜條件如表2所示 表全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于測(cè)定肝素及其鹽相對(duì)分子量及分子量分布的對(duì)照品，由肝素鈉及其分子量寬分布標(biāo)樣表構(gòu)成，肝素鈉為固體形式，其經(jīng)HPSEC-MALLS測(cè)定的分子量范圍是3000～40000。本發(fā)明還公開(kāi)了一種測(cè)定肝素供試品的相對(duì)分子量及分子量分布的方法，步驟如下(1)選擇分子量在3000～40000的肝素樣品作為對(duì)照品；(2)分子量寬分布標(biāo)樣表的制作；(3)對(duì)肝素供試品進(jìn)行HPSEC測(cè)定，并計(jì)算相對(duì)分子量及分子量分布，以進(jìn)行質(zhì)量控制。本發(fā)明提供的對(duì)照品及利用該對(duì)照品測(cè)定肝素供試品的相對(duì)分子量及分子量分布的方法，為國(guó)內(nèi)外首次，其具有較高的實(shí)用價(jià)值，方法嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)，測(cè)定方法簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、精確，具有良好的推廣應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N30/02GK103018364SQ20121052527
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者崔慧斐, 趙娜, 曹吉超 申請(qǐng)人:山東大學(xué)