專利名稱：一種檢測大米脂肪中脂肪酸含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂肪酸的分析檢測方法，具體涉及一種大米脂肪中脂肪酸的檢測方法。
背景技術(shù)：
脂肪是大米的重要成分，而大米脂肪的主要成分是不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸對人體有諸多益處，具有緩解血液中過量的膽固醇、增強(qiáng)細(xì)胞膜透性、阻止心肌組織和動脈硬化等功能。由于脂肪的劣變速度很快，容易發(fā)生水解使游離脂肪酸增多，而不飽和脂肪酸容易發(fā)生氧化而造成不飽和脂肪酸的減少，從而導(dǎo)致陳化的大米往往酸度增高、香味散失。因此，大米脂肪的脂肪酸的含量和組成可作為大米品質(zhì)的評價手段。作為啤酒生產(chǎn)中常用的輔料，大米具有降低啤酒生產(chǎn)成本、調(diào)整麥汁組分等意義。脂肪酸尤其不飽和脂肪酸對酵母的發(fā)酵性能和啤酒品質(zhì)的影響非常大；因此，測定大米脂肪酸對生產(chǎn)高品質(zhì)的啤酒有一定的指導(dǎo)意義。

現(xiàn)有技術(shù)中有多種手段可用于檢測大米脂肪中的脂肪酸，脂肪酸甲酯化可降低汽化溫度，提高分離效果，有利于氣相色譜法分離并逐一測定其組成和含量。目前，在油脂的甲酯化分析中經(jīng)常采用的有兩種手段(1)將油脂分解成脂肪酸再進(jìn)行甲酯化；(2)直接把油脂和甲醇進(jìn)行醇解反應(yīng)得到甲酯化產(chǎn)物。第一種方法一般是在乙醇液中皂化后，再用無機(jī)酸酸化分解，最后用乙醚提取分解出的游離脂肪酸，然后對脂肪酸進(jìn)行甲酯化。第二種方法常用的有三氟化硼甲酯化法、堿法甲酯化法和酸法甲酯化法，其中三氟化硼催化甲酯化率高，但其毒性強(qiáng)，不易保存，不利操作者使用；酸催化甲酯化油脂則具有反應(yīng)慢、甲酯化率低以及要求溫度高等特點(diǎn)，不適合用于固相微萃取技術(shù)。因此，多數(shù)方法都或多或少采用了有機(jī)溶劑，并且步驟繁瑣?；厝鹑A等利用索氏抽提或有機(jī)溶劑提取脂肪后，再進(jìn)行甲酯化進(jìn)樣，采用GC-MS或GC-FID分析大米油脂的脂肪酸(不同產(chǎn)地稻米油脂中脂肪酸的氣相色譜-質(zhì)譜分析，質(zhì)譜學(xué)報，2008，29 ￠) :349 352)。該方法不但采用了有機(jī)溶劑，還必須先將脂肪從待測大米中提取出來，步驟過于繁瑣。此外，有研究者向大米直接加入酯化試劑甲酯化，然后添加過量NaCl、水和石油醚分層，將上層液體除水后在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下濃縮得到脂肪酸甲酯，最后進(jìn)樣 GC-FID 分析檢測(Chemical Composition and Fatty Acid Analysisof Saudi HassawiRice Oryza sativa L ， Pakistan Journal of Biological Sciences，2002，5 (2) :212 214)。該方法避免了脂肪酸的提取步驟，但仍然采用了大量的有機(jī)溶劑，而且還要在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下濃縮，步驟仍然繁瑣，測樣時間長，滿足不了實(shí)際生產(chǎn)中大量檢測的需要。專利201110462886. 8公開了 “瓶內(nèi)甲酯化-頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定啤酒中游離脂肪酸的檢測方法”，該方法采用了酸催化甲酯化法對樣品進(jìn)行瓶內(nèi)甲酯化。然而，大米中脂肪含量高，游離脂肪酸少，因此該法采用的酸催化甲酯化法不適用于大米中脂肪酸的分析。由于作為甲酯化試劑的甲醇具有易揮發(fā)的特點(diǎn)，因此甲酯化反應(yīng)在頂空瓶內(nèi)發(fā)生時，甲醇進(jìn)入頂空部分，導(dǎo)致脂肪酸甲酯化率降低，并影響萃取效果，甚至?xí)l(fā)生萃取頭對揮發(fā)性物質(zhì)和甲醇的競爭性吸附，不利于脂肪酸甲酯的富集。另外，現(xiàn)有技術(shù)中很少有定量檢測脂肪酸的報道，其中有文章報道采用內(nèi)標(biāo)法定量測定油脂脂肪酸的檢出限僅為4. Omg/L (毛細(xì)管氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測定沙棘油中的脂肪酸，中國糧油學(xué)報，2008，23(1):198 202)。本發(fā)明中甲酯化反應(yīng)以水為基體，甲醇水溶液大大降低甲醇對萃取頭的不利影響，堿催化脂肪生成脂肪酸甲酯，之后進(jìn)入頂空部分，固相微萃取通過涂布在石英纖維表面的高分子涂層完成對脂肪酸甲酯的萃取和預(yù)富集，解吸之后利用GC-MS-MS進(jìn)行分離檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，提供了一種檢測大米脂肪的脂肪酸方法，該方法使用溶劑少，步驟簡單，檢測準(zhǔn)確度高，能快速有效測定大米脂肪酸。本發(fā)明的技術(shù)方案一種檢測大米脂肪中脂肪酸含量的方法，大米樣品借助于多功能進(jìn)樣器在頂空瓶內(nèi)堿催化甲酯化和固相微萃取同時進(jìn)行，之后進(jìn)入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS-MS )檢測并定量分析大米脂肪中脂肪酸含量。本發(fā)明包括以下步驟①儀器參數(shù)的設(shè)置a.多功能進(jìn)樣器溫度60°C，時間60min，采用85 μ m PA萃取頭；b.氣相色譜儀DB-225MS毛細(xì)管柱，30mX0. 25mmX0. 25μπι;載氣為高純氦氣，恒流模式，進(jìn)樣口流量為1. Oml/min，不分流進(jìn)樣；柱溫箱在50°C保持2min，然后以5°C /min升溫至230°C ；
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c.串聯(lián)質(zhì)譜傳輸線溫度250°C，電子轟擊離子源(EI)，電子能量為70Ev，離子源溫度為200°C，碰撞氣(氬氣)壓力為1. 5mTorr，檢測方式采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；表I串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下各脂肪酸甲酯的檢測條件
權(quán)利要求
1.一種檢測大米脂肪中脂肪酸含量的方法，其特征在于大米樣品借助于多功能進(jìn)樣器在頂空瓶內(nèi)堿催化甲酯化和固相微萃取同時進(jìn)行，之后進(jìn)入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，并定量分析大米脂肪中脂肪酸含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測大米脂肪中脂肪酸含量的方法，其特征在于所述在頂空瓶內(nèi)同時進(jìn)行的堿催化甲酯化和固相微萃取步驟包括以下步驟①大米經(jīng)過旋風(fēng)磨粉碎三次后，將25mg大米粉溶解在200mL水中，充分?jǐn)嚢?；②?mL樣品稀釋液到頂空瓶內(nèi)，加入IgNaCl和O.75mL llmmol/L的氫氧化鉀/甲醇甲酯化試劑，旋緊頂空瓶蓋；③自動進(jìn)樣器將樣品瓶移動到保溫箱內(nèi)，插入85μ m PA萃取頭，使其在60°C、250r/min震蕩條件下邊甲酯化邊萃取lh。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測大米脂肪中脂肪酸含量的方法，其特征在于所述堿催化甲酯化反應(yīng)以水為基體，所述水是經(jīng)過超純水系統(tǒng)處理得到的，所述超純水系統(tǒng)為Mill1-Q超純水系統(tǒng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測大米脂肪中脂肪酸含量的方法，其特征在于所述大米經(jīng)過旋風(fēng)磨粉碎三次，顆粒細(xì)度能夠通過120目篩，所述旋風(fēng)磨為Cyclotec 1093旋風(fēng)磨。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測大米脂肪中脂肪酸含量的方法，其特征在于所述氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀的檢測步驟為①進(jìn)樣條件PA萃取頭移入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀的進(jìn)樣口，在250°C下解吸2min,不分流進(jìn)樣；②色譜條件DB-225MS毛細(xì)管柱，30mX0.25mmX0. 25 μ m ;載氣為高純氦氣，恒流模式，進(jìn)樣口流量為1. Oml/min ;柱溫箱在50°C保持2min，然后以5°C /min升溫至230°C ；③串聯(lián)質(zhì)譜條件傳輸線溫度250°C，電子轟擊離子源，電子能量為70Ev，離子源溫度為200°C,碰撞氣壓力為1. 5mTorr,所述碰撞氣為気氣；測定方式米用多反應(yīng)監(jiān)測。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測大米脂肪中脂肪酸含量的方法，其特征在于所述多反應(yīng)監(jiān)測的條件為①肉豆蘧酸甲酯、棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯，均選擇質(zhì)荷比為74(母離子)和43 (子離子)的離子對作為定量離子對，質(zhì)荷比為87 (母離子)和55 (子離子)的離子對為定性離子對，所述質(zhì)荷比為43的子離子是采用5Ev的碰撞能量轟擊所述質(zhì)荷比為74的母離子得到，所述質(zhì)荷比為55的子離子是采用IOEv的碰撞能量轟擊所述質(zhì)荷比為87的母離子得到；②油酸甲酯選擇質(zhì)荷比為74(母離子)和43 (子離子)的離子對作為定量離子對，質(zhì)荷比為69 (母離子)和41 (子離子)的離子對為定性離子對，所述質(zhì)荷比為43的子離子是采用5Ev的碰撞能量轟擊所述質(zhì)荷比為74的母離子得到，所述質(zhì)荷比為41的子離子是采用IOEv的碰撞能量轟擊所述質(zhì)荷比為69的母離子得到；③亞油酸甲酯選擇質(zhì)荷比為81(母離子)和79 (子離子)的離子對作為定量離子對，質(zhì)荷比為67 (母離子)和41 (子離子)的離子對為定性離子對，所述質(zhì)荷比為79的子離子是采用IOEv的碰撞能量轟擊所述質(zhì)荷比為81的母離子得到，所述質(zhì)荷比為41的子離子是采用IOEv的碰撞能量轟擊所述質(zhì)荷比為67的母離子得到；④亞麻酸甲酯選擇質(zhì)荷比為67(母離子)和41 (子離子)的離子對作為定量離子對，質(zhì)荷比為67 (母離子)和39 (子離子)的離子對為定性離子對，所述質(zhì)荷比為41的子離子是采用IOEv的碰撞能量轟擊所述質(zhì)荷比為67的母離子得到，所述質(zhì)荷比為39的子離子是采用15Ev的碰撞能量轟擊所述質(zhì)荷比為67的母離子得到。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測大米脂肪中脂肪酸含量的方法，其特征在于所述定量分析大米脂肪中脂肪酸含量的步驟包括 ①繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 a.稱取適量的三肉豆蘧酸甘油酯、三棕櫚酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、三油酸甘油酯、三亞油酸甘油酯和三亞麻酸甘油酯，用甲苯配制成不同濃度的混標(biāo)溶液； b.取2mL樣品溶液到頂空瓶內(nèi)，加入IgNaCl和O.75mL llmmol/L的氫氧化鉀/甲醇甲酯化試劑，添加10 μ L混標(biāo)溶液到頂空瓶內(nèi)，使其濃度梯度為O. 5 μ g/L、2. 5 μ g/L、12.5 μ g/L、50 μ g/L 和 100 μ g/L ； c.頂空瓶旋緊瓶蓋后移送至60°C的保溫箱內(nèi)，插入85μ m PA萃取頭，完成吸附后，將萃取頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，并在250°C下解吸2min保證完全解吸； d.采用儀器檢測后，以不加混標(biāo)的樣品為空白，分別測定加標(biāo)后各脂肪酸甲酯的峰面積，扣除空白后，以加標(biāo)后各組分的峰面積增加值為y，加標(biāo)量為X，繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線強(qiáng)制過原點(diǎn)； ②通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的檢測結(jié)果計算大米中各種甘油三酯的含量； ③采用公式(I)換算得到大米脂肪中脂肪酸的含量
全文摘要
一種檢測大米脂肪中脂肪酸含量的方法，大米樣品借助于多功能進(jìn)樣器在頂空瓶內(nèi)堿催化甲酯化和固相微萃取同時進(jìn)行，之后進(jìn)入氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS-MS)檢測并定量分析大米脂肪中脂肪酸含量。本發(fā)明采用在線甲酯化固相微萃取與氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，在一個過程中同時完成了甲酯化、萃取、富集、進(jìn)樣和檢測五個步驟，操作簡單，耗時短；而且在甲酯化反應(yīng)中以水為基體，降低了萃取頭對甲醇與揮發(fā)性物質(zhì)的競爭性吸附，有效提高了固相微萃取對脂肪酸甲酯的萃取和預(yù)富集；脂肪酸最低檢測限為0.001~0.049μg/L，明顯低于采用內(nèi)標(biāo)法定量測定油脂脂肪酸的最低檢出限4.0mg/L。
文檔編號G01N30/88GK103048414SQ201210525239
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月8日
發(fā)明者樊偉, 董建軍, 郝俊光, 陸健, 陳華磊, 楊理章, 閆鵬, 田玉紅, 張宇昕, 楊朝霞 申請人:青島啤酒股份有限公司