專利名稱：一種膠乳免疫比濁法進行幽門螺桿菌抗體檢測的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及應(yīng)用基因重組抗原制備膠乳免疫試劑以及含有該試劑的膠乳免疫比濁法進行幽門螺桿菌抗體檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
幽門螺桿菌，Helicobacter pylori,簡稱Hp,由巴里·馬歇爾(BarryJ. Marshall)和羅賓·沃倫(J. Robin Warren) 二人首次發(fā)現(xiàn)，此二人因此獲得2005年的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。幽門螺桿菌是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋形彎曲的細菌，長2. 5 4. O μ m，寬O. 5 I. O μ m。在胃粘膜上皮細胞表面常呈典型的螺旋狀或弧形。幽門螺桿菌感染是慢性活動性胃炎、消化性胃潰瘍以及胃黏膜相關(guān)淋巴組織 (MALT)淋巴瘤的主要致病因素，并且與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)，1994年世界衛(wèi)生組織/國際癌癥研究機構(gòu)(WH0/IARC)將幽門螺桿菌定為I類致癌原。在亞洲地區(qū)，中國內(nèi)地、中國香港、越南、印度等少年幽門螺桿菌的感染率分別60%、50%、40%、70%，慢性胃炎患者的胃粘膜活檢標本中幽門螺桿菌檢出率可達80% 90%，而消化性胃潰瘍患者更高，可達95%以上，甚至接近100%。胃癌由于局部上皮細胞已發(fā)生異化，因此其檢出率高低報道不一。幽門螺桿菌的感染已是個世界性問題，對其進行準確診斷有利于控制HP傳播與流行及根除HP感染治療的監(jiān)測。1983年通過胃鏡取活檢標本分離培養(yǎng)成功以來，對幽門螺桿菌感染的診斷已發(fā)展出了許多方法，包括有細菌學、病理學、血清學、同位素示蹤、分子生物學等。但總的講來，從標本采集角度看，可以分為侵襲性和非侵襲性兩大類。侵入性方法主要指必需通過胃鏡取活檢標本檢查的方法，是目前消化病學科的常規(guī)方法。它包括細菌的分離培養(yǎng)和直接涂片、快速尿素酶試驗，藥敏試驗。非侵入性方法主要指不通過胃鏡取活檢標本診斷幽門螺桿菌標本感染的方法。這類方法包括抗體檢測、抗原檢測、尿素13C/14C呼氣試驗等。抗體檢測目前已有的方法包括酶聯(lián)免疫法、免疫印跡法、膠體金法和膠乳增強免疫比濁法等，為HP的流行病學調(diào)查提供了有利便捷手段。膠乳增強免疫比濁法，是將一定量的抗原或者抗體標記到一定粒徑大小的膠乳顆粒上制備成膠乳溶液，與相應(yīng)的抗體或者抗原溶液混合后會引起抗原抗體反應(yīng)，而形成一定的濁度，檢測濁度的變化從而用以判定抗體或抗原濃度的方法。幽門螺桿菌抗體檢測方法則是應(yīng)用幽門螺桿菌特異性抗原標記膠乳顆粒，從而檢測人血清樣本中相應(yīng)抗體含量的一種方法。膠乳增強免疫比濁法使用自動生化分析儀，能夠簡便、快速、大批量且定量的進行樣本檢測，對于疾病的防治意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服目前使用天然抗原制備膠乳試劑的缺點，天然抗原之間批次間差異大，且制備過程繁瑣、周期長，提供一種使用基因重組抗原制備膠乳免疫試劑盒，以測定幽門螺桿菌抗體以及使用該試劑進行臨床樣本檢測的方法。
為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種采用膠乳免疫比濁法檢測幽門螺桿菌抗體含量的試劑盒，包含試劑R1、試劑R2、幽門螺桿菌抗體校準品；所述試劑Rl為pH值6. 5-8. 5的緩沖液，所述試劑R2為幽門螺桿菌基因重組抗原膠乳試劑。作為優(yōu)選 ，所述R2試劑中幽門螺桿菌基因重組抗原膠乳試劑與幽門螺桿菌的尿素酶B亞單位UreB、幽門螺桿菌黏附素HpaA、空泡毒素VacA、細胞毒素相關(guān)蛋白CagA、熱休克蛋白HspB、鞭毛蛋白A亞單位FlaA和B亞單位FlaB中的一種特異性結(jié)合。幽門螺桿菌特異性蛋白抗原包括是尿素酶B亞單位(UreB)、幽門螺桿菌黏附素(HpaA)、空泡毒素(VacA)、細胞毒素相關(guān)蛋白(CagA)、熱休克蛋白(HspB)、鞭毛蛋白A亞單位(FlaA)和B亞單位(FlaB)等。其中尿素酶B亞單位(UreB)、幽門螺桿菌黏附素(HpaA)、熱休克蛋白(HspB)、鞭毛蛋白A亞單位(FlaA)和B亞單位(FlaB)幾乎在所有的幽門螺桿菌中都有表達。尿素酶蛋白對細菌在體內(nèi)的定植及致病發(fā)揮著重要作用。尿素酶B亞單位(ureB)是尿素酶的兩個亞單位之一，已證實是幽門螺桿菌的一個重要保護性抗原。本發(fā)明所述膠乳為聚苯乙烯膠乳，是一種核殼形式的膠乳顆粒，其膠乳核是甲苯乙烯聚合物，膠乳殼是甲基丙烯酸甲酯聚合物，是一種親水性膠乳。在殼的表面具有高密度的羧基基團，經(jīng)活化后在水溶液中可以與預(yù)標記蛋白分子，如抗體的氨基基團反應(yīng)，產(chǎn)生一種穩(wěn)定的共價化合物。通過加入適當?shù)谋砻婊钚詣?，膠乳顆粒的表面形成機械性或電性的保護膜，可以抑制膠乳顆粒的絮凝；根據(jù)膠乳顆粒的比重，通過適當助懸劑調(diào)節(jié)緩沖液比重和粘度，能夠使膠乳顆粒穩(wěn)定懸浮而不會沉降。作為優(yōu)選，所述緩沖液選自Tris/HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、甘氨酸緩沖液、巴比妥緩沖液、MOPSO緩沖液、DIPSO緩沖液、HEPPS緩沖液中的一種，并含有O. 7%-0. 9% 的 NaCl、l%-6% 的 PEG 6000,0. 01%-0. 1% 的 Tween80。所述緩沖液中含有促凝劑PEG6000，質(zhì)量體積百分比濃度為1%_6%，可以加快抗原抗體的免疫反應(yīng)速度，縮短檢測時間。并含有無機鹽NaCl，可以調(diào)節(jié)離子強度，質(zhì)量體積百分比濃度為O. 7%-0. 9%。作為優(yōu)選，所述R2試劑中所述基因重組抗原的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。在本發(fā)明的具體實施方式
中，公開了所述的幽門螺桿菌基因重組抗原膠乳試劑的制備包括如下步驟步驟I :聚苯乙烯膠乳溶液的準備以pH為5的MES溶液分散膠乳，用EDC活化12-15分鐘形成粒徑為90nm-300nm，具有羧基官能團的膠乳；步驟2 =14000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘收集膠乳沉淀，分散膠乳，調(diào)整膠乳濃度；步驟3 :加入基因重組抗原，室溫攪拌后加入封閉液，混合均勻，室溫攪拌以10，OOOrpm的速度離心10-20分鐘，去除上清液；步驟4 以緩沖液洗滌分散步驟3所得沉淀，加入含O. I % BSA的PB S緩沖液洗滌分散即得。作為優(yōu)選，步驟2所述分散為以PBS震蕩分散或超聲分散。步驟3所述基因工程抗原加入膠乳溶液中后，在2小時之內(nèi)通過活化的羧基與膠乳顆粒溶液化學交聯(lián)致敏，形成共價抗原-膠乳復(fù)合物。步驟3所述封閉劑為O. 1% B SA的磷酸鹽緩沖液，封閉膠乳顆粒表面未結(jié)合抗原的表面活性基團。更優(yōu)選地，步驟3所述基因重組抗原的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
本發(fā)明所述的試劑盒，還包含穩(wěn)定劑和防腐劑所述穩(wěn)定劑選自蛋白質(zhì)、氨基酸、無機鹽、表面活性劑、助懸劑或抗氧劑中的一種或多種；所述防腐劑選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當防腐劑，包括O. 1% (g/ml)的疊氮鈉、Proclin-300、慶大霉素。在具體實施例中，公開了一種制備幽門螺桿菌基因重組抗原的方法，其制備步驟包括I)步驟I :特異性抗原的基因序列合成、基因工程表達載體的構(gòu)建、蛋白表達；2)步驟2 :蛋白純化及蛋白濃度測定。
步驟I中，基因序列來源于公開的Genbank數(shù)據(jù)庫；構(gòu)建的基因工程載體帶有選擇性蛋白標簽，如His、GST等。本發(fā)明所述校準品是一種用來與樣本比較，進行結(jié)果計算和質(zhì)量控制的幽門螺桿菌抗體溶液，包括PBS緩沖液、適量穩(wěn)定劑、適量防腐劑以及一定濃度的幽門螺桿菌特異性抗體。在使用時用水稀釋成多個不同濃度的參考校準品。校準品的濃度可以是高濃度單點參考校準品，使用時用水稀釋成多個不同濃度的參考校準品。在具體實施例中，公開了一種制備校準品的方法。本發(fā)明測定樣本的原理是膠乳增強免疫比濁法，所選樣本為人體血清，樣本與試劑Rl (pH值為6. 5-8. 5的緩沖液)預(yù)孵育3-5分鐘后(使樣本中的抗體結(jié)合位點充分暴露)，加入試劑R2 (幽門螺桿菌特異性抗原膠乳試劑)，繼續(xù)孵育3-5分鐘，人體血清中的幽門螺桿菌特異性抗體的兩個Fab片段分別與不同膠乳顆粒的幽門螺桿菌特異性抗原結(jié)合，形成不溶性的膠乳抗原-抗體-膠乳抗原復(fù)合物，產(chǎn)生一定的濁度，其濁度高低與檢測樣本中的特異性抗體濃度成正比。在規(guī)定波長下測定該不溶性抗原-抗體復(fù)合物的吸光度值，與已知濃度的幽門螺桿菌特異性抗體校準品進行比較，則可計算出樣本中幽門螺桿菌抗體的濃度。本發(fā)明所述試劑盒采用膠乳免疫比濁法檢測幽門螺桿菌抗體含量，靈敏度高,可達到分析靈敏度為3AU/mL ;穩(wěn)定性好，操作簡單、快速；特異性強，不易受干擾；定量準確，具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖I為本發(fā)明所述試劑盒線性范圍相關(guān)性示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明公開了幽門螺桿菌抗體檢測試劑盒及應(yīng)用膠乳試劑檢測幽門螺桿菌抗體含量的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，通過適當改進工藝參數(shù)而實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案之內(nèi)。本發(fā)明的產(chǎn)品及方法已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例I :幽門螺桿菌基因重組抗原的制備(以尿素酶B抗原為例)
(a)蛋白表達以GeneBank數(shù)據(jù)庫中幽門螺桿菌尿素酶B公開的核酸序列(AAU21200. IGI: 51989332)為|旲板,借鑒蛋白序列分析軟件保留C端富含抗原決定族的喊基序列，而將N端截去450個堿基后送Invitrogen公司進行基因序列合成，將合成后的基因序列(序列如SEQ ID No. I所示)插入帶6X His Tag的表達載體pET30a中，以此表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。當培養(yǎng)物達到0D600值為80時，將誘導劑IPTG加到培養(yǎng)物中以誘導蛋白質(zhì)表達。將培養(yǎng)物進一步培養(yǎng)40-45小時，直至600nm的OD值增加到100至120。(b)步驟2 :蛋白純化及蛋白濃度測定。超聲破碎自發(fā)酵液收集的大腸桿菌細胞，澄清過濾后，采用Ni-NTA親和層析柱(BioColor)純化此重組蛋白。純化的幽門螺桿菌尿素酶B抗原重組蛋白氨基酸序列如SEQID No. 2 所示。
以Bio-Rad蛋白測定試劑盒定量幽門螺桿菌抗原蛋白濃度，首先將胎牛血清蛋白(BSA)溶于PBS中制備下列各濃度之標準品:0mg/ml、0. lmg/ml、0. 2mg/ml、0. 3mg/ml、0. 4mg/ml、0. 5mg/ml，然后以二次水5倍稀釋分析緩沖液(含考馬斯亮蘭R-250)，接著在96微孔盤中加入100 μ I稀釋后的分析緩沖液，最后分別加入10 μ I各濃度標準品及(2)中所獲幽門螺桿菌抗原蛋白質(zhì)溶液，于室溫反應(yīng)5分鐘，以可見分光光度計或酶標儀在595nm波長下讀取OD值，繪制標準曲線，并計算幽門螺桿菌抗原蛋白質(zhì)濃度。實施例2 :幽門螺桿菌抗體膠乳免疫試劑盒的制備I、試劑Rl的制備先以雙蒸水溶解NaCl (7. O 9. Og)，再加入Tris-HCl緩沖液，最后加雙蒸水至1000ml，使Tris終濃度為O. 05mol/L,充分搖勻，再加入少量PEG 6000和Tween80，混合均勻即可。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可選擇其他的常規(guī)緩沖液，如磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、甘氨酸緩沖液、巴比妥緩沖液中的一種或多種。2、試劑R2的制備以PH=5的MES溶液分散膠乳，使之濃度為1%，加入EDC混合均勻后震蕩12_15分鐘，活化為粒徑為90nm-300nm，具有羧基官能團的膠乳。14000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘收集膠乳沉淀，以IXPBS震蕩或超聲分散膠乳，調(diào)整膠乳濃度至2%。在活化的膠乳溶液中加入基因重組抗原，室溫攪拌2小時后，加入封閉劑(10%BSA IXPBS溶液)少許，混合均勻，室溫攪拌O. 5小時以10，OOOrpm的速度離心10-20分鐘，去除上清液。所得沉淀中加入含O. 1%BSA的IXPB S緩沖液洗滌分散膠乳使之濃度為O. 1%。3、校準品的制備(也可選用市售的已知濃度的幽門螺桿菌抗體)用幽門螺桿菌基因重組抗原多次免疫紐西蘭兔，免疫完畢后取頸動脈血，于室溫靜置4小時，待血液凝結(jié)完全，析出血清，以3，OOOrpm離心10分鐘，取上清以PBS稀釋后，經(jīng)Protein A(Zymed)管柱層析純化,獲得抗體蛋白溶液。用實施例一中(b)所述方法測定幽門螺桿菌抗體濃度，再以IXPBS加入幽門螺桿菌抗體溶液，使其最終濃度為lmg/ml (轉(zhuǎn)換成活性單位為80AU/ml)，置于4°C備用。實施例3 :幽門螺桿菌抗體檢測試劑的測定方法本試劑盒適用于貝克曼、日立、奧林巴斯、東芝、羅氏、雅培、西門子、邁瑞等品牌的全自動或半自動生化分析儀，測定方法如下
I、測定條件本發(fā)明所述試劑盒的測定條件溫度37°C主波長548nm副波長800nm樣本量5yLRl 用量200 μ LR2 用量50 μ L分析類型兩點終點法2、測定方法如下測定空白吸光度，在200ul Rl試劑中加入5μ L樣本，預(yù)孵育5分鐘，測定空白吸光度后，加入50 μ LR2試劑，孵育5分鐘，測定反應(yīng)吸光度。樣本量、Rl用量及R2用量可按不同型號生化分析儀的要求，按“測定條件”中規(guī)定的樣本與試劑用量的比例進行調(diào)整。如儀器內(nèi)無指定波長，可選擇與指定波長最接近的數(shù)值輸入。(3)定標、質(zhì)量控制及樣本測定使用試劑盒中的校準品按所使用分析儀器說明書中的校準程序要求定標，模式為多點定標，以去離子水將80AU/mL校準品按倍比稀釋1:3、I: I、2:1，以水為零點，校準品為
高值點建立工作曲線。定標后，測定血清樣本，依據(jù)工作曲線可算出樣本中的抗體濃度。實施例4:幽門螺桿菌抗體膠乳免疫試劑的分析性能評估I、分析靈敏度或最低檢出限以零標準品為樣本，按實施例三所述方法進行測定，重復(fù)測定20次，計算結(jié)果平均值為O. 7AU/mL,標準偏差SD為O. 53，平均值與3倍標準偏差之和為2. 29AU/mL,因此本發(fā)明試劑盒的分析靈敏度為3AU/mL。2、準確度和重復(fù)性以80. lAU/ml的校準品和標示值為36AU/ml的人血清作為樣本，按實施例三所述方法分別重復(fù)測定20次，分別計算測定平均值X、標準偏差SD及變異系數(shù)CV。結(jié)果顯示變異系數(shù)分別為I. 71%和I. 93%。表I本發(fā)明所述試劑盒的準確度和重復(fù)性
權(quán)利要求
1.一種采用膠乳免疫比濁法檢測幽門螺桿菌抗體含量的試劑盒，其特征在于，包含試劑R1、試劑R2、幽門螺桿菌抗體校準品；所述試劑Rl為pH值6. 5-8. 5的緩沖液，所述試劑R2為幽門螺桿菌基因重組抗原膠乳試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述R2試劑中幽門螺桿菌基因重組抗原膠乳試劑與幽門螺桿菌的尿素酶B亞單位UreB、幽門螺桿菌黏附素HpaA、空泡毒素VacA、細胞毒素相關(guān)蛋白CagA、熱休克蛋白HspB、鞭毛蛋白A亞單位FlaA和B亞單位FlaB中的一種特異性結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述緩沖液選自Tris/HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖液、HEPES緩沖液、甘氨酸緩沖液、巴比妥緩沖液、MOPSO緩沖液、DIPSO緩沖液、HEPPS 緩沖液中的一種，并含有 O. 7%-0. 9% 的 NaCl、l%-6% 的 PEG 6000,0. 01%-0. 1% 的Tween80o
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述R2試劑中所述基因重組抗原的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，其特征在于所述的幽門螺桿菌基因重組抗原膠乳試劑的制備包括如下步驟 步驟I :聚苯乙烯膠乳溶液的準備以pH為5的MES溶液分散膠乳，用EDC活化12-15分鐘形成粒徑為90nm-300nm，具有羧基官能團的膠乳； 步驟2 14000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘收集膠乳沉淀，分散膠乳，調(diào)整膠乳濃度； 步驟3 :加入基因重組抗原，室溫攪拌后加入封閉液，混合均勻，室溫攪拌以10，000rpm的速度離心10-20分鐘，去除上清液； 步驟4 以緩沖液洗滌分散步驟3所得沉淀，加入含O. I % BSA的PBS緩沖液洗滌分散即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于步驟2所述分散為以PBS震蕩分散或超聲分散。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于步驟3所述基因重組抗原的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于步驟3中所述封閉液為用O.1% BSA的PBS緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于還包含穩(wěn)定劑和防腐劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑選自蛋白質(zhì)、氨基酸、無機鹽、表面活性劑、助懸劑或抗氧劑中的一種或多種；所述的防腐劑選自O(shè). 1%的疊氮鈉、Proclin-300或慶大霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體公開一種采用膠乳免疫比濁法檢測幽門螺桿菌抗體含量的試劑盒。本發(fā)明所述試劑盒包含幽門螺桿菌抗體校準品、pH值6.5-8.5的緩沖液以及幽門螺桿菌基因重組抗原膠乳試劑。本發(fā)明所述試劑盒采用膠乳免疫比濁法檢測樣品中幽門螺桿菌抗體含量，靈敏度高，可達到0.10μg/ml；穩(wěn)定性好，操作簡單、快速；特異性強，不易受干擾；定量準確，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/569GK102854314SQ20121038212
公開日2013年1月2日 申請日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者張英偉 申請人:深圳康美生物科技股份有限公司