專利名稱：壓載水排放浮游動(dòng)物活體的鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水樣中浮游動(dòng)物活體的鑒別方法，具體地，本發(fā)明涉及壓載水排放的浮游動(dòng)物活體的鑒別方法。
背景技術(shù)：
壓載水是指為控制船舶縱傾、橫傾、吃水、穩(wěn)性或應(yīng)力而在船上加裝的水及其懸浮物。船舶到岸時(shí)為空出噸位，必須將壓載水排入到岸國的海域中。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，全球船舶每年攜帶的壓載水約有120億噸，壓載水和壓載艙的沉積物中含有大量的生物和微生 物，包括了細(xì)菌、藻類、原生動(dòng)物、浮游生物及其他生物。平均每立方米壓載水含有的浮游動(dòng)物超過I億個(gè)，全世界每天存在于船舶壓載水中隨船舶被擴(kuò)散到世界各地海域的海洋生物約有7000種，許多細(xì)菌、動(dòng)物和植物經(jīng)過數(shù)月的航程仍存活于壓載水及其沉積物中，當(dāng)船舶到港口裝貨時(shí)，這些生物隨著壓載水被排放到港口國水域。船舶壓載水排放的生物可能會(huì)捕食本地物種，改變生活環(huán)境或改變環(huán)境條件(如降低水的透明度)，取代本地物種，減少本地生物多樣性，甚至造成本地物種的滅絕、整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的破壞等；船舶壓載水排放的物種也可能造成降低海產(chǎn)品產(chǎn)量等直接經(jīng)濟(jì)損失，造成與人類健康生態(tài)影響有關(guān)的間接經(jīng)濟(jì)損失；船舶壓載水排放的微生物轉(zhuǎn)移可能會(huì)形成可怕的威脅，壓載水除了攜帶細(xì)菌和病毒外，還會(huì)傳輸一些微藻類，包括可能形成有害的藻花或赤潮的有毒種類，這些病原體和微生物可能弓I起人類嚴(yán)重的疾病甚至死亡。因此隨著國際貿(mào)易和航海運(yùn)輸業(yè)的快速發(fā)展，壓載水在國際間的裝載和排放不斷增多，船舶壓載水?dāng)y帶外來生物和病原體造成的衛(wèi)生、環(huán)保、海洋生態(tài)等問題越來越受到國際組織和世界各國的關(guān)注。根據(jù)《船舶壓載水和沉積物控制和管理國際公約(草案)》，第D-2條壓載水執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)本條進(jìn)行壓載水管理的船舶壓載水中活體生物的排放量被設(shè)定為限值。其中第一條規(guī)定活體生物最小尺寸>50 μ m的個(gè)體濃度< 10個(gè)/m3，活體生物最小尺寸為10 50 μ m的個(gè)體濃度< 10個(gè)/ml。標(biāo)準(zhǔn)中要求的是活體生物濃度，這就要求在短時(shí)間內(nèi)，將壓載水中種類繁多的生物種類區(qū)分死活，并將生物的個(gè)數(shù)進(jìn)行加和，在現(xiàn)有的檢測技術(shù)條件下，這是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。然而現(xiàn)階段對(duì)于壓載水浮游動(dòng)物是否活體的鑒定則是對(duì)管理船舶壓載水的關(guān)鍵一環(huán)?；铙w浮游動(dòng)物的鑒別方法上，國內(nèi)更是缺乏規(guī)范快捷的操作方法。為此方面的科研工作造成了一定的難度?，F(xiàn)有技術(shù)在檢測海洋浮游生物活性時(shí)，一般使用鏡檢目測的方法，該方法通常耗時(shí)長、繁瑣且主觀性強(qiáng)、準(zhǔn)確度低，對(duì)于檢測結(jié)果較難正確檢驗(yàn)核實(shí)。而起還有較高的成本和對(duì)使用者可能造成有毒危害的弊端，其檢測效果也較差，檢測后結(jié)果也不穩(wěn)定。因此需要一種簡便、快捷和結(jié)果可靠的檢測壓載水中排放浮游動(dòng)物的鑒別方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)在檢測海洋浮游生物活性時(shí)，所使用方法通常耗時(shí)長且繁瑣，還有較高的成本和對(duì)使用者可能造成有毒危害的弊端，其檢測效果也較差，檢測后結(jié)果也不穩(wěn)定的缺陷，提供一種簡便、快捷和結(jié)果可靠的檢測方法本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)壓載水排放的浮游動(dòng)物活體的鑒別方法，包括以下步驟(I)在采集的每60ml浮游動(dòng)物水樣中滴加I 2%浮游動(dòng)物染色溶液I. 0-2. Oml,進(jìn)行染色；(2)再向水樣中滴加福爾馬林溶液進(jìn)行樣品固定；(3)將樣品混勻后，取樣品進(jìn)行鏡檢，并計(jì)數(shù)。在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，所述I 2%浮游動(dòng)物染色溶液的制備方法為稱取Ig 2g碘化鉀、O. 25g O. 50g碘溶于IOOml I. 5%詹納斯綠B溶液，其中所述詹納斯綠B溶液是通過將詹納斯綠B溶于由氯化鈉、氯化鉀和蒸餾水制備而成的IOOml緩沖液，稍加熱使之溶解，過濾，其中所述緩沖液。優(yōu)選地，所述浮游動(dòng)物染色溶液的濃度為I. 5%。在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，所述加熱的溫度范圍是40°C -45°C。在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，所述緩沖液的組分含量為氯化鈉l_2g氯化鉀O. 25-0. 50g蒸餾水100ml。在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，所述步驟(I)中的染色的時(shí)間為20_30min。在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，所述步驟(2)中的福爾馬林溶液的體積百分比濃度為5%。本發(fā)明所述的詹納斯綠B(即詹納斯綠B，又稱健那綠)為市售產(chǎn)品。本發(fā)明所采用的試劑、溶劑等均可從市售途徑購買得到。本發(fā)明所述的詹納斯綠B染色溶液的“ ％ ”是指質(zhì)量百分比。本發(fā)明的有益效果是，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法的整個(gè)染色過程更加快速、簡化，對(duì)使用者安全，且成本較低、效果明顯，極易區(qū)分出浮游動(dòng)物是否活體。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例I對(duì)壓載水中浮游動(dòng)物樣品(樣品由上海嘉洲環(huán)保機(jī)電設(shè)備有限責(zé)任公司提供的模擬船舶壓載水樣品)的浮游動(dòng)物活體進(jìn)行的檢測。I 試劑I. I (I)制備詹納斯綠B染色溶液氯化鈉I. OOg氯化鉀O. 25g蒸餾水IOOml
先將氯化鈉、氯化鉀分別溶于少量蒸餾水中，混合后用蒸餾水稀釋到100ml。(2) I. 5 %詹納斯綠B溶液稱取I. 5g詹納斯綠B溶于IOOml緩沖液，在40°C _45°C稍加熱，使之很快溶解，用濾紙(定性濾紙)過濾，即為I. 5%詹納斯綠B溶液(一般配置后避光保存，以保持其充分氧化能力，有效期為20天)。
I. 31. 5%浮游動(dòng)物染色液稱取碘化鉀I. 5g，碘O. 375g加入IOOml I. 5 %詹納斯綠B溶液中，待完全溶解后即為配置完畢的浮游動(dòng)物染色液(配置后避光保存，有效期為7天。)2染色步驟2. I從壓載水中采集浮游動(dòng)物水樣(3組平行水樣)，每升水樣中滴加I. 5 %浮游動(dòng)物染色溶液I. 5ml，染色30min ；2. 2再向水樣中滴加5%福爾馬林溶液進(jìn)行樣品固定；2. 3將樣品搖動(dòng)5min，確保樣品混勻后，取樣品Iml于IOX鏡下觀察到固定前活體浮游動(dòng)物具線粒體部位呈較淺的藍(lán)色，其余部位保持原有體色，而固定前死體浮游動(dòng)物周身幾乎均呈墨藍(lán)色。對(duì)于壓載水中浮游動(dòng)物樣品(樣品由上海嘉洲環(huán)保機(jī)電設(shè)備有限責(zé)任公司提供的模擬船舶壓載水樣品)的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活體浮游動(dòng)物染色固定后身體局部呈淺藍(lán)色，死體浮游動(dòng)物染色固定后周身呈墨藍(lán)色。實(shí)施例2本實(shí)施例的試劑和方法與實(shí)施例I的大體相同，不同之處在于在染色步驟2. I中向每組每升水樣中滴加I. O %浮游動(dòng)物染色溶液為I. Oml (Ig碘化鉀，O. 25g碘加入IOOml
I.5%詹納斯綠B溶液)。對(duì)于壓載水中浮游動(dòng)物樣品(樣品由上海嘉洲環(huán)保機(jī)電設(shè)備有限責(zé)任公司提供的模擬船舶壓載水樣品)的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活體浮游動(dòng)物染色固定后身體局部呈較淺藍(lán)色，死體浮游動(dòng)物染色固定后周身呈深藍(lán)色。實(shí)施例3本實(shí)施例的試劑和方法與實(shí)施例I的大體相同，不同之處在于在染色步驟2. I中向每組每升水樣中滴加的2. O %浮游動(dòng)物染色溶液為2. Oml (2g碘化鉀，O. 5g碘加入IOOml
I.5%詹納斯綠B溶液)。對(duì)于壓載水中浮游動(dòng)物樣品(樣品由上海嘉洲環(huán)保機(jī)電設(shè)備有限責(zé)任公司提供的模擬船舶壓載水樣品)的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活體浮游動(dòng)物染色固定后身體局部呈較深藍(lán)色，死體浮游動(dòng)物染色固定后周身呈深墨藍(lán)色。對(duì)照實(shí)施例對(duì)于壓載水中浮游動(dòng)物樣品(樣品由上海嘉洲環(huán)保機(jī)電設(shè)備有限責(zé)任公司提供的模擬船舶壓載水樣品)的直接鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于死亡不久的浮游動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)葉綠素等細(xì)胞器仍相對(duì)完整，易將其判定為活體；但隨著固定時(shí)間的延長，葉綠體等細(xì)胞器會(huì)隨浮游動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的變化而破裂消失。從而出現(xiàn)同一組樣品不同時(shí)間鏡檢存在一定的誤差，第一次鏡檢時(shí)發(fā)現(xiàn)活體浮游動(dòng)物為168個(gè)，死亡的浮游動(dòng)物個(gè)體數(shù)為72個(gè)，8小時(shí)后鏡檢發(fā)現(xiàn)活體浮游動(dòng)物為88個(gè)，死亡的浮游動(dòng)物個(gè)體數(shù)為152個(gè)。且鏡檢耗時(shí)長。由實(shí)施例1-3與對(duì)照實(shí)施例對(duì)同一組樣品浮游動(dòng)物活體的個(gè)體濃度檢測結(jié)果比較，可以得出本發(fā)明的方法具有“快速、簡化、效果明顯、極易區(qū)分出浮游動(dòng)物是否活體且穩(wěn)定性好、誤差值小”等優(yōu)點(diǎn)。且本發(fā)明采用的試劑均為市售的較廉價(jià)的試劑，從而使得本發(fā)明的方法所消耗的成本大大降低。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。權(quán)利要求
1.壓載水排放浮游動(dòng)物活體的鑒別方法，包括以下步驟 (1)在采集的每60ml浮游動(dòng)物水樣中滴加I 2%浮游動(dòng)物染色溶液I.0-2. 0ml，進(jìn)行染色； (2)再向水樣中滴加福爾馬林溶液進(jìn)行樣品固定； (3)將樣品混勻后，取樣品進(jìn)行鏡檢，并計(jì)數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述I 2%浮游動(dòng)物染色溶液的制備方法為稱取Ig 2g碘化鉀、O. 25g O. 50g碘溶于IOOml I. 5%詹納斯綠B溶液，其中所述詹納斯綠B溶液是通過將詹納斯綠B溶于由氯化鈉、氯化鉀和蒸餾水制備而成的IOOml緩沖液，稍加熱使之溶解，過濾，其中所述緩沖液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述浮游動(dòng)物染色溶液的濃度為1.5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述加熱的溫度范圍是40°C_45°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述緩沖液的組分含量為 氯化鈉l-2g氯化鉀 O. 25-0. 50g 蒸懼水100ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的染色的時(shí)間為20_30mino
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的福爾馬林溶液的體積百分比濃度為5%。
全文摘要
本發(fā)明提供壓載水排放的浮游動(dòng)物活體的鑒別方法，包括以下步驟(1)在采集的每60ml浮游動(dòng)物水樣中滴加1～2％浮游動(dòng)物染色溶液1.0-2.0ml，進(jìn)行染色；(2)再向水樣中滴加福爾馬林溶液進(jìn)行樣品固定；(3)將樣品混勻后，取樣品進(jìn)行鏡檢，并計(jì)數(shù)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法的整個(gè)染色過程更加快速、簡化，且成本較低、效果明顯，極易區(qū)分出浮游動(dòng)物是否活體。
文檔編號(hào)G01N1/30GK102636487SQ20121008146
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者劉艷, 吳惠仙, 薛俊增 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué)