專利名稱：基于無修飾抗體介導納米金組裝檢測組蛋白修飾酶活性及篩選其抑制劑的生物傳感方法
技術領域：
發(fā)明屬于一種檢測組蛋白修飾酶活性及篩選其抑制劑的生物傳感技術，其具體是指，組蛋白修飾酶底物的設計，組蛋白修飾酶底物肽與控制肽混合自組裝比例，和基于無修飾抗體介導納米金自組裝的比色定量檢測方法。
背景技術：
組蛋白修飾酶及其抑制劑的檢測與快速篩查對于生物學研究、醫(yī)學研究、藥物篩選等領域具有極其重要的意義。目前常用的組蛋白修飾酶活性的檢測技術是基于酶催化反應中輔酶副產(chǎn)物的檢測以及直接檢測修飾產(chǎn)物，檢測方法主要有比色法、熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光各向異性分析，免疫吸附分析以及質(zhì)譜法等。這些檢測技術靈敏度不高、可靠性差， 且需要精密的儀器，不能滿足準確快速檢測的需求。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是，針對現(xiàn)有技術存在的不足，提出了一種基于修飾有組蛋白修飾酶底物肽的納米金在組蛋白修飾酶的作用下，通過無標記抗體介導納米金自組裝，從而檢測組蛋白修飾酶活性及篩選其抑制劑的生物傳感方法，此方法設計簡單，僅需設計一條組蛋白修飾酶識別的底物肽即可，在與待測的組蛋白修飾酶作用后，通過無標記抗體介導的納米金組裝即可實現(xiàn)檢測，此方法操作簡便、快速、靈敏。本發(fā)明的技術方案是，所述基于無修飾抗體介導納米金組裝檢測組蛋白修飾酶活性及篩選抑制劑的生物傳感方法為利用修飾有組蛋白修飾酶識別的底物肽的納米金與組蛋白修飾酶相互作用，通過無修飾抗體介導納米金組裝后紫外吸收光譜的變化，定量分析檢測組蛋白修飾酶的活性以及篩選其抑制劑。以下對本發(fā)明作進一步說明所述基于無修飾抗體介導納米金組裝檢測組蛋白修飾酶活性及篩選其抑制劑的生物傳感方法包括(I)組蛋白修飾酶底物肽的設計；(2)組蛋白修飾酶底物肽與控制肽混合自組裝的比例；(3)采用基于無標記抗體介導修飾組蛋白修飾酶底物肽的納米金組裝的比色定量方法進行組蛋白修飾酶活性的定量檢測以及相應抑制劑的篩選。以下對本發(fā)明做出進一步說明。 組蛋白修飾酶底物的設計是由組蛋白修飾酶的識別底物肽加上由半胱氨酸組成的間隔肽組成。組蛋白修飾酶底物肽與控制肽混合自組裝的比例可由反應最大信噪比時對應的比例得到，組蛋白修飾酶底物肽與控制肽混合自組裝比例選擇在I : 9到9 : I之間。所述用無標記抗體介導修飾有組蛋白修飾酶底物肽的納米金組裝的比色定量方法進行組蛋白修飾酶活性的定量檢測以及相應抑制劑的篩選采用以下步驟實現(xiàn)對于組蛋白修飾酶活性的定量檢測，檢測步驟是取所述組蛋白修飾酶底物肽與控制肽以前述比例混合自組裝的納米金置于微量管中；再于微量管中加入相應的組蛋白修飾酶與輔酶的混合溶液；然后加入所對應修飾位點的抗體反應，得不同顏色的反應產(chǎn)物；對于組蛋白修飾酶抑制劑的檢測，檢測步驟是取所述組蛋白修飾酶底物肽與控制肽以前述比例混合自組裝的納米金置于微量管中；再加入相應的組蛋白修飾酶與抑制劑的混合溶液，混合均勻后加入輔酶溶液；再加入所對應修飾位點的抗體反應，得不同顏色的反應產(chǎn)物。進一步地，本發(fā)明中，所述無標記抗體介導修飾有組蛋白修飾酶底物肽的納米金組裝的比色定量方法進行組蛋白修飾酶活性的定量檢測以及相應抑制劑的篩選采用以下步驟實現(xiàn)a.對于組蛋白修飾酶活性的定量檢測，檢測的步驟是取30 μ L上述組蛋白修飾酶底物肽與控制肽以前述比例混合自組裝的納米金置于微量管中，加入20μ L 3Χ組蛋白修飾酶反應緩沖溶液，然后加入9 μ L包含組蛋白修飾酶與輔酶的混合溶液，在組蛋白修飾酶最適的反應溫度下反應I小時，再加入I μ L—定濃度的所對應修飾位點的抗體室溫震蕩反應10分鐘。b.對于組蛋白修飾酶抑制劑的檢測，檢測的步驟是取30 μ L上述組蛋白修飾酶底物肽與控制肽以前述比例混合自組裝的納米金置于微量管中，加入20μ L 3Χ組蛋白修飾酶反應緩沖溶液，然后加入5μ L包含組蛋白修飾酶與抑制劑的混合溶液(事先混合反應好)，混合均勻后加入一定濃度的輔酶溶液4 μ L，在組蛋白修飾酶最適的反應溫度下反應I 小時，再加入I μ L 一定濃度的所對應修飾位點的抗體室溫震蕩反應10分鐘。注意，以上反應條件為最優(yōu)條件，所述溶液體積均可成倍變化不改變最優(yōu)結(jié)果。改變比例或試劑加入順序可使被無標記抗體介導修飾組蛋白修飾酶底物肽的納米金組裝效率在1% 100%內(nèi)變化。本發(fā)明中，所述組蛋白修飾酶活性的定量檢測以及相應抑制劑的篩選可采用比色方法，以下是用比色方法對組蛋白修飾酶活性的定量檢測及相應抑制劑篩選的步驟 將60 μ L反應最終產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到微量石英比色皿中，放入紫外光譜儀，監(jiān)測400nm到 800nm波長范圍內(nèi)其紫外吸收強度。本發(fā)明提出了一種基于無標記抗體介導納米金組裝的定量檢測組蛋白修飾酶活性以及篩選相應抑制劑的比色方法，此方法設計簡單，僅需設計一條能組裝到納米金表面的組蛋白修飾酶的底物肽即可，以最優(yōu)的比例將底物肽與控制肽混合自組裝與納米金表面，即可實現(xiàn)檢測；其操作快速簡便、靈敏特異，可望為生物學研究、藥物研發(fā)、藥毒物分析等提供一個通用技術平臺。
具體實施例方式實施例I :基于無標記抗體介導納米金組裝可視化分析檢測組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶I)組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶底物修飾的納米金的制備分別取濃度為50 μ M甲基化轉(zhuǎn)移酶底物肽與控制肽的溶液，以最優(yōu)比例(I I) 混合成500 μ L，將此500 μ L溶液加入到500 μ L的檸檬酸保護的納米金溶液中，室溫下攪拌24小時。然后將上述溶液在12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心15分鐘去除過量的肽，下層沉淀物重新分散在500 μ L，濃度為IOmM磷酸緩沖液(O. OlM NaH2PO4, pH 7.2)中。此離心洗滌過程重復3次，最終下層沉淀物分散在500 μ L，濃度為IOmM磷酸緩沖液(O. OlM NaH2PO4, pH 7.2)中，保存于4°C的冰箱中備用。以上所有的反應均在遮光的條件下進行。2)組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶活性的檢測取30 μ L，濃度為3. 2ηΜ組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶底物修飾的納米金加入到30 μ L反應混合物中(50mM Tris-HCl (pH 8. 5), IOOmM NaCl, ImM EDTA, O. 01 % Tween-20,80 μ M SAM 和5 μ L不同濃度的待檢測的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SET 7/9)，混合均勻，37°C反應lh，再加入IuL濃度為6. 7μ M的組蛋白H3 (Lys 4)甲基化單克隆抗體于反應體系中，室溫震蕩反應IOmin.反應后,將反應混合液轉(zhuǎn)移到微量石英比色皿中，放入紫外光譜儀,在400nm到 SOOnm的波長范圍內(nèi)測其紫外吸收強度。3)組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑的篩選取2yL，濃度為12μΜ的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SET 7/9與3 μ L不同濃度的待測組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑充分混合，在室溫下反應10分鐘。然后將上述溶液加入到 55 μ L 反應混合物中(50mM Tris-HCl (pH 8. 5), IOOmM NaCl, ImM EDTA, O. 01% Tween-20, 80 μ MSAM)，混合均勻，37°C反應I小時，再加入I μ L濃度為6. 7 μ M的組蛋白Η3 (Lys 4)甲基化單克隆抗體于反應體系中，室溫震蕩反應IOmin.反應后,將反應混合液轉(zhuǎn)移到微量石英比色皿中，放入紫外光譜儀，在400nm到800nm的波長范圍內(nèi)測其紫外吸收強度。實施例2 :基于無標記抗體介導納米金組裝可視化分析檢測組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶I)組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶底物修飾的納米金的制備分別取濃度為50 μ M乙?；D(zhuǎn)移酶底物肽與控制肽的溶液，以最優(yōu)比例(I I) 混合成500 μ L。將此500 μ L溶液加入到500 μ L的檸檬酸保護的納米金溶液中，室溫下攪拌 24小時。然后將上述反應后溶液在12000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下，離心15分鐘去除過量的肽，下層沉淀物重新分散在500 μ L，濃度為IOmM磷酸緩沖液(O. OlM NaH2PO4,pH 7. 2)中。此離心洗滌過程重復3次，最終下層沉淀物分散在500 μ L，濃度為IOmM磷酸緩沖液(O. OlMNaH2PO4, PH 7.2)中，保存于4°C的冰箱中備用。以上所有的反應均在遮光的條件下進行。2)組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶活性的檢測取30 μ L，濃度為3. 2ηΜ組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶底物修飾的納米金加入到30 μ L反應混合物中(IOOmM HEPES (pH 7. 5), O. 01 % Tween-20, 200 μ MAcetyl CoA，和 5yL 不同濃度的待檢測的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶PCAF)，混合均勻，25°C反應lh，再加入I μ L濃度為6. 7 μ M 的組蛋白H3(Lys 14)乙?；瘑慰寺】贵w于反應體系中，室溫震蕩反應lOmin.反應后，將反應混合液轉(zhuǎn)移到微量石英比色皿中，放入紫外光譜儀，在400nm到800nm的波長范圍內(nèi)測其紫外吸收強度。3)組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑的篩選取2 μ L，濃度為9 μ M的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶PCAF與3 μ L不同濃度的待測組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑充分混合，在室溫下反應10分鐘。然后將上述溶液加入到55 μ L反應混合物中(IOOmM HEPES (pH 7. 5), O. 01 % Tween-20, 200 μ M Acetyl CoA)，混合均勻，25°C 反應lh，再加入1111^農(nóng)度為6.7111的組蛋白！13(1^8 14)乙?；瘑慰寺】贵w于反應體系中，室溫震蕩反應IOmin.反應后，將反應混合液轉(zhuǎn)移到微量石英比色皿中，放入紫外光譜儀，在400mn到SOOrnn的波長范圍內(nèi)測其紫外吸收強度。
權(quán)利要求
1.基于無修飾抗體介導納米金組裝檢測組蛋白修飾酶活性及篩選其抑制劑的生物傳感方法，包括如下步驟(1)組蛋白修飾酶底物肽的設計；(2)組蛋白修飾酶底物肽與控制肽混合自組裝的比例；(3)采用基于無標記抗體介導修飾組蛋白修飾酶底物肽的納米金組裝的比色定量方法進行組蛋白修飾酶活性的定量檢測以及相應抑制劑的篩選。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物傳感方法，其特征在于，組蛋白修飾酶底物的設計是由組蛋白修飾酶的識別底物肽加上由半胱氨酸組成的間隔肽組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生物傳感方法，其特征在于，組蛋白修飾酶底物肽與控制肽混合自組裝比例選擇在I:9到9I之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的生物傳感方法，其特征在于，所述組蛋白修飾酶的活性的檢測及其抑制劑的篩選分析為對于組蛋白修飾酶活性的定量檢測，檢測步驟是取所述組蛋白修飾酶底物肽與控制肽以權(quán)利要求3所述的比例混合自組裝的納米金置于微量管中；再于微量管中加入對應的組蛋白修飾酶與輔酶的混合溶液；然后加入所對應修飾位點的抗體反應，得不同顏色的反應產(chǎn)物；對于組蛋白修飾酶抑制劑的檢測，檢測步驟是取所述組蛋白修飾酶底物肽與控制肽以權(quán)利要求3所述的比例混合自組裝的納米金置于微量管中；再加入相應的組蛋白修飾酶與抑制劑的混合溶液，混合均勻后加入輔酶溶液；再加入所對應修飾位點的抗體反應，得不同顏色的反應產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明為一種基于無修飾抗體介導納米金分析檢測組蛋白修飾酶的活性以及篩選其抑制劑的比色生物傳感方法，包括組蛋白修飾酶底物肽的設計；組蛋白修飾酶底物肽與控制肽混合自組裝的比例；基于無標記抗體介導修飾組蛋白修飾酶底物肽的納米金組裝的比色定量方法進行組蛋白修飾酶活性的定量檢測以及相應抑制劑的篩選。它利用檢測組蛋白修飾酶和其底物肽特異性相互作用，基于納米金上修飾的底物肽被組蛋白修飾酶修飾后能與相應的單克隆抗體特異性結(jié)合，使納米金組裝，通過對修飾組蛋白修飾酶底物肽的納米金進行紫外定量分析來檢測組蛋白修飾酶的活性以及篩選其抑制劑。該方法靈敏度高、操作簡便、特異性強，可用于生物學研究、醫(yī)學研究、藥物篩選等。
文檔編號G01N33/573GK102590509SQ201210073840
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月20日
發(fā)明者俞汝勤, 唐麗娟, 楚霞, 甄珍, 蔣健暉 申請人:湖南大學