專利名稱：用于含雜合同種型抗體部分的蛋白質(zhì)的表達(dá)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及這樣的方法和組合物，其用于帶有源自兩種或多種同種型的部分的抗體及來(lái)自此抗體的融合蛋白質(zhì)，包括含有具有改變的效應(yīng)子功能、增強(qiáng)的蛋白質(zhì)表達(dá)和/或降低的寡聚化的抗體部分的蛋白質(zhì)。本發(fā)明特別涉及這樣的抗體和融合蛋白質(zhì)，其中鉸鏈區(qū)源自一種同種型而CH2結(jié)構(gòu)域源自不同的同種型。
背景技術(shù)：
從遺傳改造細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)的效率是一重要的商業(yè)問題。一些商業(yè)上重要的蛋白質(zhì)最好從真核細(xì)胞中產(chǎn)生以保證正確的折疊和糖基化，所述真核細(xì)胞如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞或酵母細(xì)胞。但是，維持大規(guī)模真核細(xì)胞培養(yǎng)的費(fèi)用意味著用此方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)是昂貴的。因此，在本領(lǐng)域內(nèi)需要對(duì)真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)最大化。
一相關(guān)的問題是產(chǎn)生于真核細(xì)胞的治療性蛋白質(zhì)必須以正確的構(gòu)象形態(tài)進(jìn)行表達(dá)。通常，轉(zhuǎn)錄和翻譯的機(jī)制確保了遺傳改造細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的序列由編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸決定。但是，轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)后，蛋白質(zhì)可能沒有正確折疊且可能被降解。備選地，蛋白質(zhì)可以以聚集狀態(tài)產(chǎn)生，結(jié)果降低了活性。即使聚集的蛋白質(zhì)具有活性，由于與非聚集蛋白質(zhì)相比其免疫原性增加而不能被藥理學(xué)接受。這樣，藥理學(xué)可接受的蛋白質(zhì)制品一般應(yīng)基本不含有聚集的蛋白質(zhì)。
從遺傳改造的真核細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的數(shù)量取決于編碼基因的轉(zhuǎn)錄速率、mRNA剪切及移出細(xì)胞核的效率及翻譯效率。這些事件在蛋白質(zhì)表達(dá)中起到的作用已被充分理解，遺傳工程和蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員通?？蓪⒑线m的核酸序列加入到表達(dá)構(gòu)建體的設(shè)計(jì)中，以實(shí)現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)錄、剪切、mRNA移出和翻譯。
但是，產(chǎn)生于真核細(xì)胞的正確折疊的非聚集蛋白質(zhì)的數(shù)量也取決于蛋白質(zhì)的氨基酸序列以及決定轉(zhuǎn)錄、剪切、mRNA移出、翻譯和翻譯后修飾的核酸序列。例如，細(xì)胞內(nèi)合成的相當(dāng)大一部分蛋白質(zhì)被認(rèn)為會(huì)發(fā)生降解。蛋白質(zhì)中決定是否應(yīng)被降解的特征目前正是一個(gè)深入研究的主題，但當(dāng)前還不可能僅通過(guò)檢查蛋白質(zhì)的序列來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)折疊、降解或聚集的效率。一些天然存在的蛋白質(zhì)以高效率折疊、抵抗蛋白質(zhì)水解且不發(fā)生聚集。相反，其他的蛋白質(zhì)折疊效率低、迅速被降解且發(fā)生聚集。
抗體和含抗體一部分的人工蛋白質(zhì)，此處命名為抗體融合蛋白質(zhì)或Ig融合蛋白質(zhì)，對(duì)于許多涉及抗體可變區(qū)的靶向能力以及恒定區(qū)結(jié)合多種其他蛋白質(zhì)的能力的目的是有用的。抗體和抗體融合蛋白質(zhì)制備物當(dāng)它們正確折疊且非聚集時(shí)是非常有用的。因此，本領(lǐng)域內(nèi)需要能用于生產(chǎn)聚集減少的抗體和抗體融合蛋白質(zhì)制備物的方法和組合物。
此外，由于抗體和抗體融合蛋白質(zhì)能結(jié)合多種其他蛋白質(zhì)而導(dǎo)致，例如，引起特異的效應(yīng)子功能，故所述抗體和抗體融合蛋白質(zhì)是有用的。在一些情況中可能需要特異效應(yīng)子功能，但經(jīng)常的情況是優(yōu)選使效應(yīng)子功能喪失。通過(guò)利用修飾抗體，融合蛋白質(zhì)的抗體成分可經(jīng)過(guò)改變而減小或消除效應(yīng)子功能。當(dāng)抗體和抗體融合蛋白質(zhì)制備物經(jīng)過(guò)修飾而改變了功能性時(shí)也是有用的。因此，本領(lǐng)域內(nèi)存在對(duì)如下方法和組合物的需要，所述方法和組合物可用于生產(chǎn)具有改變的效應(yīng)子功能的修飾抗體和抗體融合蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)藥物可被蛋白酶降解，因此它們的遞送和藥物動(dòng)力學(xué)特性并非最佳。本領(lǐng)域內(nèi)存在對(duì)改進(jìn)的蛋白質(zhì)藥物的需要，所述改進(jìn)的蛋白質(zhì)藥物具有某些蛋白質(zhì)的有用特性，但具有更大的蛋白酶抵抗力。
發(fā)明概述本發(fā)明著重描述用于生產(chǎn)完整抗體、免疫細(xì)胞因子、免疫融合體、免疫配體和其他抗體和Fc融合蛋白質(zhì)的方法和組合物，其可以促進(jìn)所需融合蛋白質(zhì)的表達(dá)、正確寡聚化、純化和蛋白酶抗性，其中所述所需融合蛋白質(zhì)任選地具有修飾的、組合的或減弱的Fc效應(yīng)子功能。特別是，本發(fā)明提供具有雜合同種型的抗體部分，及任選地突變Ig成分在完整的抗體中以及在含抗體部分的融合蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
IgG/IgG雜合同種型在一組優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有減弱的效應(yīng)子功能和增強(qiáng)的組裝功能的融合蛋白質(zhì)。在使用Ig部分增強(qiáng)表達(dá)和提高血清半衰期，而又不需要此Ig部分的免疫學(xué)功能時(shí)，此類融合蛋白質(zhì)特別有用。
在這些實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)優(yōu)選地包含IgG2或IgG4的CH1、CH2和/或CH3結(jié)構(gòu)域，以及來(lái)自IgG1的鉸鏈區(qū)或來(lái)自IgG4的鉸鏈區(qū)，后一鉸鏈區(qū)優(yōu)選包含可在重鏈來(lái)源的部分間促進(jìn)二硫鍵正確形成的突變(Angal S，等.分子免疫學(xué)(Mol Immunol)1993年，一月；30(1)105-8)。該實(shí)施方案的融合蛋白質(zhì)將有利于完整抗體和含F(xiàn)c區(qū)域的Ig融合蛋白質(zhì)的高水平表達(dá)及提高其正確組裝。
在一更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)在Ig部分內(nèi)還含有一個(gè)或多個(gè)突變。例如，Ig部分可以經(jīng)過(guò)突變而進(jìn)一步減少不需要的任何殘留的效應(yīng)子功能。例如，可以對(duì)IgG2的CH2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的C1q結(jié)合位點(diǎn)實(shí)施突變。例如正常的IgG4由于在相應(yīng)IgG1的331位的脯氨酸處含有絲氨酸而不能夠結(jié)合補(bǔ)體(Eu命名法)(Tao，MA等(1993)J.Exp.Med.178661-667；Brekke，OH等(1994)Eur.J.Immunol.242542-2547)；在IgG2中的一個(gè)類似突變減弱了C1q結(jié)合。也可以對(duì)其他已知參與C1q結(jié)合的殘基進(jìn)行修飾，例如對(duì)318、320、322和297位的殘基進(jìn)行修飾(Duncan AR(1988)自然(Nature)332738-740)，導(dǎo)致C1q結(jié)合的減弱。
在另外一組優(yōu)選的實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)也存在突變。例如，在抗體輕鏈也存在的情況下，優(yōu)選的IgG1鉸鏈區(qū)的形式為在其正常位置存在有正常數(shù)目的半胱氨酸殘基。但是，在抗體輕鏈不作為一條獨(dú)立多肽鏈存在時(shí)，優(yōu)選IgG1鉸鏈的第一個(gè)半胱氨酸被突變?yōu)榱硪粋€(gè)殘基。例如，在Fc-X蛋白質(zhì)、X-Fc蛋白質(zhì)和單鏈抗體中應(yīng)用此突變的鉸鏈區(qū)是有利的，其中所述單鏈抗體中輕鏈可變區(qū)通過(guò)多肽接頭連接重鏈。在此情形下，IgG1鉸鏈中的第一半胱氨酸優(yōu)選地突變?yōu)榻z氨酸。
在涉及突變鉸鏈區(qū)的第二類實(shí)施方案中，應(yīng)用突變形式的IgG4鉸鏈以允許在兩重鏈間有效形成二硫鍵。
在涉及突變鉸鏈區(qū)的第三類實(shí)施方案中，在雜合同種型抗體或Ig融合蛋白質(zhì)中使用突變形式的IgG2鉸鏈(其中頭兩個(gè)半胱氨酸每一個(gè)均突變?yōu)榱硪话被?。也可方便地將此突變鉸鏈用于完全來(lái)自IgG2的抗體或Ig融合蛋白質(zhì)中。例如，可將具有ERKSSVECPPCP(SEQ ID NO1)序列的修飾IgG2鉸鏈用于抗體或Ig融合蛋白質(zhì)中。另一有用的鉸鏈類型為IgG2鉸鏈和IgG4鉸鏈的雜合體，例如序列ESKYG-VECPPCP(SEQ IDNO2)，其中破折號(hào)前的5個(gè)氨基酸來(lái)自IgG4而剩余的氨基酸來(lái)自IgG2。這些實(shí)施方案在抗體和Ig融合蛋白質(zhì)從真核細(xì)胞表達(dá)和分泌的情形下特別有用，因?yàn)檫@些鉸鏈實(shí)施方案可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊。這些實(shí)施方案可用作IgG1鉸鏈的備選。這些抗體鉸鏈實(shí)施方案的一個(gè)關(guān)鍵特征是它們僅含有兩個(gè)半胱氨酸殘基。
再一類實(shí)施方案涉及雜合同種型Ig融合蛋白質(zhì)的Ig部分內(nèi)的突變，突變位于Ig和非Ig部分的連接處。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)氨基酸序列內(nèi)的改變優(yōu)選地位于Ig部分和非Ig部分的連接處，且優(yōu)選地位于連接點(diǎn)的10個(gè)氨基酸內(nèi)。更優(yōu)選地，氨基酸的改變涉及抗體部分C末端的賴氨酸變?yōu)槭杷被?，如丙氨酸或亮氨酸?br> 一備選實(shí)施方案用于需要縮短融合蛋白質(zhì)的半衰期的情形中。IgG3由于位于CH3結(jié)構(gòu)域內(nèi)的FcRn/FcRp結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)發(fā)生修飾(H435變?yōu)镽)而與其他IgG同種型相比半衰期較短(參見Ward，ES.和Gheti，V治療免疫學(xué)(Therapeutic Immunology)277-94)。具有IgG3的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)可用于需要短期暴露的情況。根據(jù)該實(shí)施方案，應(yīng)用IgG3 CH3結(jié)構(gòu)域聯(lián)合IgG1鉸鏈?zhǔn)怯杏玫模焕鏘gG1(鉸鏈)-IgG3(CH3)融合蛋白質(zhì)與含IgG3鉸鏈和IgG3 CH3結(jié)構(gòu)域的Ig融合蛋白質(zhì)相比具有更佳的表達(dá)和組裝特性。
在一更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)Ig融合蛋白質(zhì)被設(shè)計(jì)為具有短的血清半衰期、減弱的效應(yīng)子功能和有效的組裝性能時(shí)，可以應(yīng)用雜合Ig區(qū)域，其中鉸鏈區(qū)來(lái)自IgG1、CH2結(jié)構(gòu)域來(lái)自IgG2且CH3結(jié)構(gòu)域來(lái)自IgG3。
IgG/IgA雜合同種型本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)特的實(shí)施方案提供了雜合同種型Ig融合蛋白質(zhì)，其具有增強(qiáng)的蛋白酶抵抗力及延長(zhǎng)的血清半衰期。當(dāng)Ig融合蛋白質(zhì)將暴露于富含蛋白酶的環(huán)境時(shí)，該實(shí)施方案特別有用，所述富含蛋白酶的環(huán)境如消化道或其他的粘膜組織，例如口服Ig融合蛋白質(zhì)藥物的過(guò)程中。根據(jù)此實(shí)施方案，提供了含IgG和IgA恒定區(qū)元件的Ig融合蛋白質(zhì)。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，應(yīng)用了IgA1的鉸鏈和IgG的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在一獨(dú)特的優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼IgA Fc區(qū)域內(nèi)的O-連接糖基化位點(diǎn)的氨基酸片段被移植到IgG的Fc區(qū)域中。
IgG/IgM雜合同種型本發(fā)明的再一實(shí)施方案提供了具有IgA或IgM的寡聚化特性但具有IgG的特征效應(yīng)子功能的雜合同種型抗體和Ig融合蛋白質(zhì)。例如，提供的蛋白質(zhì)含IgG1或IgG3的鉸鏈區(qū)以及CH2結(jié)構(gòu)域和與之相融合的IgM的CH3和CH4結(jié)構(gòu)域。在一更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供的抗體包含重鏈和輕鏈可變區(qū)，且還包含融合在一起的IgG鉸鏈及CH2區(qū)域和IgM的CH3及CH4結(jié)構(gòu)域。在一備選更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了X-Fc形式的Ig融合蛋白質(zhì)，其中X優(yōu)選地為細(xì)胞表面受體的配體，且Fc部分包含IgM的CH3和CH4結(jié)構(gòu)域。此分子將IgG的ADCC效應(yīng)子功能和IgM的高效價(jià)聯(lián)合在一起。
在應(yīng)用IgM或IgA的CH4結(jié)構(gòu)域的雜合同種型的優(yōu)選實(shí)施方案中，CH4結(jié)構(gòu)域的C末端半胱氨酸被突變以阻斷與J鏈的二硫鍵連接。這減少了Ig融合蛋白質(zhì)向消化道的分泌。
優(yōu)選的非-Ig部分本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)內(nèi)非Ig部分的優(yōu)選類型為這樣的蛋白質(zhì)或部分，當(dāng)其不是Ig融合蛋白質(zhì)的一部分時(shí)通常位于細(xì)胞外。例如，激素、細(xì)胞因子、趨化因子、分泌酶或跨膜受體的胞外部分。
在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，非免疫球蛋白成分為一種蛋白質(zhì)，如抗肥胖蛋白質(zhì)。例如，非免疫球蛋白成分為leptin、CNTF、CLC/CLF-1或Acrp30的一部分。
而在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，非免疫球蛋白成分為一種蛋白質(zhì)，如紅細(xì)胞生成素或EPO。
在一備選實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)的非免疫球蛋白成分為激素。例如，非免疫球蛋白成分可為胰島素、生長(zhǎng)激素或胰高血糖素樣肽1(GLP-1)。
在另一實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)的非免疫球蛋白成分為細(xì)胞因子。此處應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)″細(xì)胞因子″用以描述可在具有該細(xì)胞因子受體的細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)特異反應(yīng)的天然或重組蛋白質(zhì)、其類似物和其片段。優(yōu)選的細(xì)胞因子為可由細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，細(xì)胞因子包括白介素，如白介素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16和IL-18，造血因子如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、G-CSF和紅細(xì)胞生成素，腫瘤壞死因子(TNF)如TNFα、淋巴因子如淋巴毒素，代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)物如leptin，干擾素如α干擾素、β干擾素和γ干擾素，以及趨化因子。優(yōu)選地，本發(fā)明Ig細(xì)胞因子融合蛋白質(zhì)顯示出細(xì)胞因子生物活性。
在一備選的優(yōu)選實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)的非免疫球蛋白成分為具有生物活性的配體結(jié)合蛋白質(zhì)。此配體結(jié)合蛋白質(zhì)可以，例如，(1)阻斷細(xì)胞表面的受體配體相互作用；或(2)中和血液的液相中的分子(如細(xì)胞因子)的生物活性，從而阻止其到達(dá)細(xì)胞靶位。優(yōu)選的配體結(jié)合蛋白質(zhì)包括CD4、CTLA-4、TNF受體，或白介素受體如IL-1和IL-4受體。優(yōu)選地，本發(fā)明抗體-受體融合蛋白質(zhì)顯示出配體結(jié)合蛋白質(zhì)的生物活性。一高度優(yōu)選的實(shí)施方案包括用于蛋白質(zhì)藥物Enbrel中的胞外TNF受體結(jié)構(gòu)域片段，其形式為TNFR-鉸鏈-CH2-CH3或鉸鏈-CH2-CH3-TNFR，其中CH2和CH3結(jié)構(gòu)域源自IgG2或IgG4，且在二聚化Fc中這兩鉸鏈區(qū)域中的每一個(gè)具有三個(gè)或更少的半胱氨酸，且甚至更優(yōu)選地，具有兩個(gè)或更少的半胱氨酸。
另一類型的優(yōu)選配體結(jié)合蛋白質(zhì)具有結(jié)合小分子而不是蛋白質(zhì)的能力。例如，可方便地將抗生物素蛋白融合到雜合同種型Ig部分，如抗體上。然后將雜合同種型抗體-抗生物素蛋白融合體施用給哺乳動(dòng)物，如鼠或人，由抗體V區(qū)的特異性所決定的，此融合體將集中在機(jī)體的靶組織中。在抗體-抗生物素蛋白融合蛋白質(zhì)被充分地從體內(nèi)清除后，可施用生物素和治療分子的綴合物。生物素綴合物由于與抗生物素蛋白的結(jié)合將集中在靶組織中，這導(dǎo)致減輕了由于非靶組織中治療分子的集中而引起的副作用。該策略可用于其他配體/配體結(jié)合蛋白質(zhì)對(duì)。
另一類型的優(yōu)選非免疫球蛋白部分為酶。例如，可將具有獨(dú)特特異性的酶融合到雜合同種型Ig部分，如抗體上。然后將雜合同種型抗體-酶融合體施用給哺乳動(dòng)物，如鼠或人，該融合體將集中于機(jī)體的靶組織內(nèi)(這是由抗體V區(qū)的特異性所決定的)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的治療方法中，在抗體-酶融合蛋白質(zhì)被充分地從體內(nèi)清除后，施用可通過(guò)該酶裂解成活性形式的前體藥物。此活化的藥物將集中在靶組織內(nèi)，這就導(dǎo)致減輕了由于在非靶組織中活化藥物分子的集中而引起的副作用。在該實(shí)施方案的一高度優(yōu)選的形式中，活化藥物為抗癌藥物，例如細(xì)胞毒性劑。在一備選的高度優(yōu)選實(shí)施方案中，酶本身具有治療活性。例如，可以將RNAse，如Onconase與雜合同種型抗體融合蛋白質(zhì)偶聯(lián)，且通過(guò)抗體V區(qū)域靶向腫瘤。
核酸本發(fā)明也包括新的核酸序列，所述核酸序列將有利于具有雜合同種型的Ig融合蛋白質(zhì)和完整抗體的表達(dá)和分泌；以及包括用于構(gòu)建此核酸的方法。
編碼抗體蛋白質(zhì)的基因組序列的一個(gè)特別有用的特征是可變區(qū)、CH1、鉸鏈、CH2、CH3和CH4區(qū)域由分別的外顯子編碼。該特征使得可通過(guò)′外顯子改組′實(shí)現(xiàn)雜合同種型融合蛋白質(zhì)的工程化(Zuckier等，癌癥研究(Cancer Research) 583905-8；Poon等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2708571-7；Jefferis R，等，分子免疫學(xué)(Mol Immunol.)271237-40；Chappel MS，Proc Natl Acad Sci U S A. 889036-40；Senior BW，等，感染免疫(Infect Immun.)68463-9.)。
對(duì)于Fc融合蛋白質(zhì)，核酸分子可編碼多種構(gòu)型的蛋白質(zhì)。在一組優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子以5′到 3′方向連續(xù)編碼，(i)信號(hào)序列、免疫球蛋白Fc區(qū)域和靶蛋白質(zhì)序列，或(ii)信號(hào)序列、靶蛋白質(zhì)序列和免疫球蛋白Fc區(qū)域，或(iii)信號(hào)序列、第一靶蛋白質(zhì)、免疫球蛋白Fc區(qū)域和第二靶蛋白質(zhì)。導(dǎo)致產(chǎn)生的核酸分子由此編碼Fc-X、X-Fc或X-Fc-Y結(jié)構(gòu)，其中X和Y為一種或多種靶蛋白質(zhì)。例如，X和Y可各自為融合蛋白質(zhì)。任選地在這些部分間編碼接頭。
類似地，根據(jù)本發(fā)明，編碼完整抗體Ig融合蛋白質(zhì)的核酸也可設(shè)計(jì)為在每一重鏈部分和每一輕鏈部分的N末端編碼一段信號(hào)序列。
本發(fā)明的核酸可以以功能性連接方式加入到復(fù)制表達(dá)載體中，然后可以將所述載體導(dǎo)入能夠產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)的真核宿主細(xì)胞。最終的Ig融合蛋白質(zhì)得以從真核宿主細(xì)胞中有效地產(chǎn)生和分泌。分泌的Ig融合蛋白質(zhì)可從培養(yǎng)基中收集，而無(wú)需裂解真核宿主細(xì)胞?？梢詫?duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行活性測(cè)試，和/或按需要應(yīng)用普通試劑進(jìn)行純化和/或從融合配偶體中切離，前述全部可以應(yīng)用常規(guī)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。備選地，本發(fā)明的核酸可導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞，且產(chǎn)生的Ig融合蛋白質(zhì)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行純化。
本發(fā)明也提供了提高細(xì)胞內(nèi)抗體和Ig融合蛋白質(zhì)生產(chǎn)水平的方法。方法優(yōu)選地應(yīng)用于在真核細(xì)胞，優(yōu)選地哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的生產(chǎn)。例如，根據(jù)本方法，起始抗體或Ig融合蛋白質(zhì)產(chǎn)量的提高可以通過(guò)將編碼Ig部分的結(jié)構(gòu)域的核酸序列與編碼其他抗體同種型的結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)序列或與突變序列進(jìn)行交換、通過(guò)測(cè)試如此處描述的改變的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量來(lái)比較表達(dá)水平，以及選擇可給出最高水平的特定表達(dá)構(gòu)建體而實(shí)現(xiàn)。該方法可重復(fù)使用。交換鉸鏈區(qū)是特別有用的。
治療本發(fā)明也提供了應(yīng)用修飾抗體和Ig融合蛋白質(zhì)進(jìn)行治療的方法。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了有效且價(jià)廉的方法，以及提供了低免疫原性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明前述的及其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將在以下的詳細(xì)描述、圖表和實(shí)施例中更為彰顯。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A-D為用于制備本發(fā)明某些方面的融合蛋白質(zhì)的IgG雜合同種型的示意性圖解；黑線代表連接半胱氨酸殘基的二硫鍵；抗體結(jié)構(gòu)域在圖A中標(biāo)示；IgG1結(jié)構(gòu)域以黑色顯示，IgG2結(jié)構(gòu)域以白色顯示，且可變區(qū)和輕鏈結(jié)構(gòu)域以條紋顯示。
圖1A顯示IgG1同種型。
圖1B顯示IgG2同種型。
圖1C顯示帶有IgG2和IgG1鉸鏈的同種型雜合體，所述鉸鏈的第一個(gè)半胱氨酸發(fā)生了突變。
圖1D顯示IgG雜合體γ1(CH1-H)γ2(CH2-CH3)。
圖2A-C為Ig融合蛋白質(zhì)的示意性圖解，所述Ig融合蛋白質(zhì)包含的Fc區(qū)域含有雜合同種型；″X″和″Y″可為任何的非Ig部分。
圖2A顯示Fc-C構(gòu)象的Ig融合蛋白質(zhì)，其包含來(lái)自一種抗體同種型的鉸鏈和由來(lái)自另一種同種型的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域組成的Fc部分；在Fc部分的C末端為蛋白質(zhì)部分″X″。
圖2B顯示X-Fc構(gòu)象的Ig融合蛋白質(zhì)，其包含來(lái)自一種抗體同種型的鉸鏈和由來(lái)自另一種同種型的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域組成的Fc部分；在Fc部分的N末端為蛋白質(zhì)部分″X″。
圖2C顯示X-Fc-Y構(gòu)象的Ig融合蛋白質(zhì)，其包含來(lái)自一種抗體同種型的鉸鏈和由來(lái)自另一種同種型的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域組成的Fc部分；在Fc部分的N末端為蛋白質(zhì)部分″X″，其可為任何的蛋白質(zhì)，而在Fc部分的C末端為蛋白質(zhì)部分″Y″圖3A-D為包含可變區(qū)且含有雜合同種型的Ig融合蛋白質(zhì)的示意性圖解；″X″和″Y″可為任何的非Ig部分。
圖3A顯示Ig融合蛋白質(zhì)，其包含的鉸鏈來(lái)自一種抗體同種型(黑色)而包含的CH1、CH2和CH3區(qū)域來(lái)自一不同的同種型；非Ig蛋白質(zhì)″X″在重鏈的C末端進(jìn)行融合。
圖3B顯示Ig融合蛋白質(zhì)，其包含的鉸鏈來(lái)自一種抗體同種型(黑色)而包含的CH1、CH2和CH3區(qū)域來(lái)自一不同的同種型；非Ig蛋白質(zhì)″X″在重鏈的C末端進(jìn)行融合；箭頭顯示了抗體部分內(nèi)的一部分可能突變位點(diǎn)，見本文描述。
圖3C顯示Ig融合蛋白質(zhì)，其包含的鉸鏈和CH1區(qū)域來(lái)自一種抗體同種型(黑色)而包含的CH2和CH3區(qū)域來(lái)自一不同的同種型；非Ig蛋白質(zhì)″X ″在重鏈的C末端進(jìn)行融合；從鉸鏈發(fā)出的分枝結(jié)構(gòu)代表糖基化部分。
圖3D顯示Ig融合蛋白質(zhì)，其包含的鉸鏈來(lái)自一種抗體同種型(黑色)而包含的CH1、CH2和CH3區(qū)域來(lái)自一不同的同種型；非Ig蛋白質(zhì)″X″在重鏈的C末端進(jìn)行融合；第二非Ig蛋白質(zhì) ″Y ″在輕鏈的N末端進(jìn)行融合。
圖3E顯示Ig融合蛋白質(zhì)，其包含的鉸鏈來(lái)自一種抗體同種型(黑色)而包含的CH1、CH2和CH3區(qū)域來(lái)自一不同的同種型；非Ig蛋白質(zhì)″X″在重鏈的C末端進(jìn)行融合；第二非Ig蛋白質(zhì)″Y″在重鏈的N末端進(jìn)行融合。
圖4示意性圖解了這樣的Ig融合蛋白質(zhì)，其包含可變區(qū)及多種同種型且與IgG相比具有增強(qiáng)的效價(jià)；黑色的橢圓代表來(lái)自IgM的CH3和CH4結(jié)構(gòu)域；白色的橢圓代表來(lái)自IgG的CH1、鉸鏈和CH2結(jié)構(gòu)域；帶條紋的橢圓代表可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)；粗線代表正常存在于IgG1內(nèi)的二硫鍵；用′s′標(biāo)記的細(xì)線代表正常存在于IgM內(nèi)的二硫鍵。
定義根據(jù)本發(fā)明，同種型意指免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(C)的種類，所述恒定區(qū)決定了抗體的功能活性。存在五種主要的同種型，包括IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA意指以α重鏈為特征的免疫球蛋白種類。IgD意指以δ重鏈為特征的免疫球蛋白種類。IgE意指以ε重鏈為特征的免疫球蛋白種類。IgM意指以μ重鏈為特征的免疫球蛋白種類。IgG意指以γ重鏈為特征的免疫球蛋白種類?！遒ゑRa1″或″γ1″是指源自IgG1的重鏈或其部分。同樣，″伽馬2″或″γ2″是指源自IgG2的重鏈或其部分，依此類推。
根據(jù)本發(fā)明，同種異型免疫球蛋白意指相同免疫球蛋白重鏈C基因的等位基因多態(tài)性。這些決定因子存在于物種的一些而非全部成員中。
根據(jù)本發(fā)明，獨(dú)特型意指存在于抗體可變區(qū)(V)上的抗原決定族，其由VH和VL基因的特定重排形成。
根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)cRn，也稱作FcRp，意指含β-2微球蛋白的新生兒腸內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)受體，所述受體調(diào)節(jié)IgG的清除，且對(duì)于抗體的體內(nèi)循環(huán)半衰期非常重要。
根據(jù)本發(fā)明，F(xiàn)cγR意指可結(jié)合IgG分子的Fc部分并能誘發(fā)效應(yīng)細(xì)胞功能的細(xì)胞表面受體，包括FcγRI、RII和RIII。FcγR在吞噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹突細(xì)胞上表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明，″IgG1″或″IgG2″或其他Ig分子意指包括重鏈或輕鏈的完整抗體，或其部分。
根據(jù)本發(fā)明，″二價(jià)單體″意指抗體、Fc融合體或抗體融合體，其通?？赏ㄟ^(guò)在正常抗體中形成的二硫鍵而進(jìn)行二聚化。通?？梢愿鶕?jù)含F(xiàn)c的蛋白質(zhì)在變性的非還原SDS膠上作為單一的條帶移動(dòng)的能力，及其表觀分子量為在還原狀態(tài)下觀察到的表觀分子量的約兩倍，以推斷此二硫鍵的形成。二價(jià)單體的存在也可通過(guò)在大小排阻層析中存在與正確分子量對(duì)應(yīng)的峰而進(jìn)行推斷。其他確定蛋白質(zhì)大小的方法也可用于鑒定二價(jià)單體的存在。
根據(jù)本發(fā)明，″Ig融合蛋白質(zhì)″意指這樣的融合蛋白質(zhì)，其包含與第二部分連接的部分或全部抗體，所述第二部分優(yōu)選地全部或部分為非抗體或非免疫球蛋白(非-Ig)蛋白質(zhì)。免疫細(xì)胞因子、Fc-X蛋白質(zhì)、X-Fc蛋白質(zhì)和X-Fc-Y蛋白質(zhì)均為Ig融合蛋白質(zhì)的示例。同樣，其中非Ig部分置于兩個(gè)Ig部分或結(jié)構(gòu)域之間的融合蛋白質(zhì)亦構(gòu)成了Ig融合蛋白質(zhì)的一種類型。
根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)的″組裝″意指蛋白質(zhì)正確折疊及寡聚化為正確的多聚體狀態(tài)。組裝可用本領(lǐng)域內(nèi)建立的多種方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。實(shí)際上，就二硫鍵而言，蛋白質(zhì)的正確組裝可方便地通過(guò)比較蛋白質(zhì)在非還原和還原SDS膠上的遷移進(jìn)行監(jiān)測(cè)如果給定的蛋白質(zhì)種類在非還原膠上形成多條帶，而在還原SDS膠上形成單一條帶，則可推測(cè)出在非還原SDS膠上至多僅有一條帶為正確組裝的蛋白質(zhì)。備選地，大小排阻層析法也可用于區(qū)別單元蛋白和可由不正確的二硫鍵或非共價(jià)鍵相互作用形成的更高級(jí)寡聚體和聚合體。
根據(jù)本發(fā)明，抗體部分的″結(jié)構(gòu)域″意指結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域，其對(duì)應(yīng)于人類抗體基因中的單個(gè)外顯子所編碼的氨基酸片段。例如，IgG的恒定結(jié)構(gòu)域?yàn)镃H1、鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在一些例子中，位于鉸鏈和CH2結(jié)構(gòu)域由同一外顯子編碼。在這樣的例子中，鉸鏈和CH2結(jié)構(gòu)域間的連接處通過(guò)與其他鉸鏈/CH2連接處進(jìn)行比對(duì)而定義(參見Paul，前面引用的文獻(xiàn).，46-49頁(yè))。
根據(jù)本發(fā)明，結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)、區(qū)域或分子意指完整的結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)、區(qū)域或分子，或其部分、突變體或改造形式，或主要由其來(lái)源的形式。所述部分、突變體或改造形式優(yōu)選地具有完整結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)、區(qū)域或分子特有的功能特性。根據(jù)本發(fā)明，″主要由其來(lái)源″意指衍生物具有的氨基酸序列中至少95％源自天然存在的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的特定序列。例如，主要由人IgG2 CH2結(jié)構(gòu)域來(lái)源的序列在氨基酸比對(duì)中至少有95％與人IgG2CH2結(jié)構(gòu)域的序列相同。
根據(jù)本發(fā)明，″修飾的IgG1鉸鏈″意指來(lái)自IgG1的鉸鏈區(qū)，在該鉸鏈中半胱氨酸，優(yōu)選地第一個(gè)半胱氨酸突變?yōu)榱硪环N氨基酸。該半胱氨酸通常與抗體輕鏈形成二硫鍵。此修飾的IgG1鉸鏈在缺乏輕鏈或具有可結(jié)合輕鏈的其它半胱氨酸的蛋白質(zhì)中特別有用。
根據(jù)本發(fā)明，″紅細(xì)胞生成素分子″意指這樣的分子，其一般具有與脊椎動(dòng)物紅細(xì)胞生成素相同的結(jié)構(gòu)和類似的氨基酸序列，任選地包括突變。例如實(shí)施例18描述了無(wú)突變的人紅細(xì)胞生成素以及具有四個(gè)突變的人紅細(xì)胞生成素的應(yīng)用。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于提高免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的體內(nèi)和體外產(chǎn)量的方法和組合物。特別是，本發(fā)明提供了用于提高免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的表達(dá)、聚合和/或折疊特性的有用方法。本發(fā)明部分基于如下令人驚異的發(fā)現(xiàn)，即當(dāng)應(yīng)用雜合免疫球蛋白而不是野生型免疫球蛋白作為融合配偶體時(shí)，免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的表達(dá)水平提高、聚集減少和/或折疊問題減少。與雜合免疫球蛋白相關(guān)的融合蛋白質(zhì)生產(chǎn)特性的提高是出乎預(yù)料的，因?yàn)槿鏘gG1和IgG2等野生型免疫球蛋白被認(rèn)為是可良好折疊的蛋白質(zhì)且能在體內(nèi)和體外有效表達(dá)。
相應(yīng)地，本發(fā)明的一個(gè)方面包括可用于表達(dá)包含雜合免疫球蛋白(或雜合Ig)部分的免疫球蛋白融合蛋白質(zhì)的方法和組合物。優(yōu)選的雜合免疫球蛋白包含IgG1鉸鏈和IgG2的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。其他優(yōu)選的雜合體包含IgG1和IgG4結(jié)構(gòu)域。
抗體結(jié)構(gòu)抗體為Y字形的分子且由兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(L)組成。每一條重鏈通過(guò)二硫鍵連接輕鏈，且兩條重鏈依賴共價(jià)和非共價(jià)相互作用彼此相對(duì)正確定向。這兩條鏈在氨基末端的可變結(jié)構(gòu)域含有抗原結(jié)合位點(diǎn)，且與CH1結(jié)構(gòu)域一起，限定了分子的Fab端。
四條鏈應(yīng)用重鏈間的疏水鍵以及一個(gè)或多個(gè)鏈間的二硫鍵來(lái)穩(wěn)定復(fù)合體。這樣，完整的免疫球蛋白為二價(jià)，具有兩個(gè)相同的抗原結(jié)合位點(diǎn)。某些免疫球蛋白通常還要進(jìn)行多聚化，例如IgM和IgA。
每一多肽鏈具有兩個(gè)到五個(gè)結(jié)構(gòu)域；輕鏈含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域而重鏈含四或五個(gè)。每條鏈的各氨基末端結(jié)構(gòu)域由于存在大量的序列變異而被命名為可變區(qū)，而幾個(gè)羧基端結(jié)構(gòu)域被稱為恒定區(qū)。重鏈區(qū)編號(hào)為CH1、鉸鏈、CH2、CH3、CH4，且負(fù)責(zé)多種重要的抗體功能，包括Fc受體(FcR)結(jié)合和補(bǔ)體固定。
重鏈C區(qū)存在五種主要的同種型，分類為IgA、IgG、IgD、IgE、IgM，每一種均具有特征性的效應(yīng)子功能(IgG分為四種γ同種型亞類γ1、γ2、γ3、γ4)。輕鏈的恒定區(qū)僅含有一個(gè)C結(jié)構(gòu)域，其可為Ck和Cλ兩類中的一個(gè)，所述結(jié)構(gòu)域不具有已知的明確的功能特性(參見W.E.Paul，ed.，1993，基礎(chǔ)免疫學(xué)(Fundamental Immunology)，Raven Press，New York，N.Y)。
所有的免疫球蛋白在它們的重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的C末端均存在一鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)將分子分成Fab和Fc區(qū)域。多數(shù)情況下，鉸鏈區(qū)使得在分子的抗原結(jié)合(Fab端)組分和效應(yīng)物-相互作用(Fc)組分間存在很大程度的柔性，由此連接起抗體的兩個(gè)主要功能元件。在IgG同種型中，鏈間二硫鍵一般在該鉸鏈區(qū)內(nèi)形成，從而生成最終的四聚體分子。
除IgM外，鉸鏈區(qū)主要由脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸組成，這些氨基酸趨向于阻止二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成且被認(rèn)為可賦予鉸鏈柔性。IgG1同種型常被用于融合蛋白質(zhì)，在其鉸鏈區(qū)含有的兩個(gè)二硫鍵將兩條重鏈彼此連接起來(lái)。相反，IgG2同種型具有四個(gè)二硫鍵(圖1)。根據(jù)本發(fā)明，這些二硫鍵傾向于促使抗體和Ig融合蛋白質(zhì)的不正確組裝，如在實(shí)施例的意外發(fā)現(xiàn)中所證實(shí)的。
Ig融合蛋白質(zhì)的有用構(gòu)型免疫細(xì)胞因子為利用本發(fā)明的方法和組合物靶向腫瘤的融合蛋白質(zhì)治療劑的唯一一個(gè)示例。其他腫瘤毒性分子也可通過(guò)融合到本發(fā)明的腫瘤特異抗體上而靶向腫瘤。此外，根據(jù)本發(fā)明的抗體融合蛋白質(zhì)也可攻擊其他類型的病變細(xì)胞，例如病毒感染的細(xì)胞。
本發(fā)明的方法和組合物也可與Fc-X和X-Fc技術(shù)聯(lián)用。根據(jù)本發(fā)明，在融合蛋白質(zhì)中使用雜合抗體同種型還進(jìn)一步提高了連接到免疫球蛋白Fc部分上的靶蛋白或目的多肽的產(chǎn)生和積集。對(duì)于Fc-X融合蛋白質(zhì)，信號(hào)肽及隨后的免疫球蛋白基因Fc片段構(gòu)成了靶蛋白質(zhì)的N末端融合配偶體。然后融合蛋白質(zhì)可在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如天然表達(dá)免疫球蛋白的細(xì)胞。N末端融合配偶體內(nèi)的信號(hào)肽-Fc片段將指導(dǎo)靶蛋白通過(guò)分泌路徑，以使融合蛋白質(zhì)易于分泌。此外，F(xiàn)c片段通常為糖基化的且在中性pH下高度帶電，這樣Fc片段的應(yīng)用可提高硫水性較高的蛋白質(zhì)的溶解性。使Fc-X融合蛋白質(zhì)定向通過(guò)分泌路徑也減輕了與胞內(nèi)蛋白質(zhì)毒性相關(guān)的問題，且促進(jìn)了穩(wěn)定細(xì)胞系的分離。融合蛋白質(zhì)產(chǎn)物可容易地進(jìn)行分析和純化，因?yàn)槠淇扇菀椎匾蕴烊粯?gòu)象形式從培養(yǎng)基中得以收集并保留生物活性和酶活性。該技術(shù)的功效已經(jīng)用Fc-leptin和Fc-紅細(xì)胞生成素進(jìn)行了證明。這些優(yōu)點(diǎn)中的一部分也是X-Fc蛋白質(zhì)所固有的。
根據(jù)本發(fā)明，抗體部分的有用融合的示例包括Fc-X、X-Fc和X-Fc-Y蛋白質(zhì)。此類蛋白質(zhì)含有Fc區(qū)域，而非抗體蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段在N末端、C末端或N末端和C末端同時(shí)進(jìn)行融合。與Fc區(qū)域融合的一個(gè)有利的效果是融合配偶體的血清半衰期可顯著延長(zhǎng)。第二個(gè)有利的效果是′X′可通過(guò)附著Fc而有效進(jìn)行二聚化。例如，Enbrel為由TNF受體的一部分和人IgG1 Fc區(qū)域組成的融合蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，沿X-Fc方向設(shè)計(jì)具雜合同種型的融合蛋白質(zhì)是特別有利的。這些構(gòu)建體中靶蛋白質(zhì)為N末端融合蛋白質(zhì)且隨后為Fc片段。該方法對(duì)一些蛋白質(zhì)可能是有用的，例如對(duì)于淋巴細(xì)胞表面的糖蛋白(LHR)(參見美國(guó)專利5,428,130)。
根據(jù)本發(fā)明，盡管應(yīng)用基于重組抗體的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行治療優(yōu)于單獨(dú)的蛋白質(zhì)或細(xì)胞因子治療，但這種應(yīng)用可因融合蛋白質(zhì)的快速體內(nèi)循環(huán)清除而受到限制，這是因?yàn)榭贵w融合蛋白質(zhì)的體內(nèi)循環(huán)半衰期顯著低于自由抗體的體內(nèi)循環(huán)半衰期。循環(huán)半衰期的減小可能是通過(guò)Fc受體(FcR)的清除增加的結(jié)果。已證明同種型的轉(zhuǎn)換是對(duì)半衰期實(shí)行改變的一個(gè)機(jī)制。通過(guò)將人重鏈C區(qū)域從IgGγ1或IgGγ3同種型變?yōu)镮gGγ4同種型已經(jīng)證明可提高兩種免疫細(xì)胞因子的半衰期(癌癥研究(Cancer Research)59(9)2159-66，1999)，其中所述IgGγ4為具有降低的FcR結(jié)合能力的同種型?；贗gG4的免疫細(xì)胞因子和融合蛋白質(zhì)與起始的基于IgGγ1的融合蛋白質(zhì)相比，其FcR結(jié)合力降低10倍且Fc受體效應(yīng)子功能如ADCC也降低，但在鼠腫瘤模型中其仍顯示出類似或更好的功效。但是，本發(fā)明提供了基于雜合抗體的融合蛋白質(zhì)，所述融合蛋白質(zhì)在一個(gè)單一分子內(nèi)結(jié)合了不同抗體類型的功能和結(jié)構(gòu)特性。
相應(yīng)地，對(duì)于某些申請(qǐng)，由于IgG2同種型的Fc受體結(jié)合力低得多，IgG2同種型為抗體融合蛋白質(zhì)賦予了更好的特性(Hulett等.免疫學(xué)進(jìn)展(Adv.Immunol.)571127)。對(duì)于整個(gè)的抗體融合蛋白質(zhì)，在僅含F(xiàn)c區(qū)域的融合蛋白質(zhì)中應(yīng)用γ2同種型有時(shí)是有利的。原理與用于完整抗體的相同即，通常需要避免由源自其他同種型的Fc區(qū)域介導(dǎo)的與Fc受體的結(jié)合。
但是，融合蛋白質(zhì)中IgG2同種型的應(yīng)用一般會(huì)導(dǎo)致某種程度的不適當(dāng)組裝，見本文的描述。本發(fā)明的方法和組合物提供了這樣的抗體融合蛋白質(zhì)，其具有最小化的IgG2同種型的效應(yīng)子功能，但又不具有該同種型的聚集特性。
根據(jù)本發(fā)明，新雜合同種型抗體和融合蛋白質(zhì)較之基于IgG2的融合蛋白質(zhì)顯示出增強(qiáng)的表達(dá)和改進(jìn)的組裝。此外，雜合同種型抗體和融合蛋白質(zhì)可在不需要Fc受體效應(yīng)子功能的治療中具有提高的功效。
鉸鏈的類型本發(fā)明的雜合同種型抗體也包括其鉸鏈區(qū)為突變鉸鏈區(qū)的抗體，優(yōu)選半胱氨酸殘基數(shù)目減少的鉸鏈區(qū)，例如，第一個(gè)半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸的修飾IgG1鉸鏈區(qū)。IgG1鉸鏈區(qū)的第一個(gè)半胱氨酸通常結(jié)合到輕鏈上。在Fc-X蛋白質(zhì)或X-Fc蛋白質(zhì)或其他任何缺乏輕鏈的抗體融合蛋白質(zhì)中，該半胱氨酸不能行使其天然功能，并因此可進(jìn)行突變。但是，根據(jù)本發(fā)明，具有缺失第一個(gè)半胱氨酸的IgG1鉸鏈和IgG2的CH1結(jié)構(gòu)域的雜合同種型抗體可與輕鏈連結(jié)，因?yàn)檩p鏈通常會(huì)與IgG2的CH1結(jié)構(gòu)域內(nèi)的半胱氨酸形成二硫鍵。IgG2鉸鏈內(nèi)的四個(gè)半胱氨酸被認(rèn)為彼此形成二硫鍵。
根據(jù)本發(fā)明，抗體或Ig融合蛋白鉸鏈區(qū)中參與重鏈-重鏈同二聚化的半胱氨酸可對(duì)抗體或Ig融合蛋白質(zhì)的表達(dá)和組裝產(chǎn)生顯著的影響。特別是，較高數(shù)目的半胱氨酸可由于二硫鍵的錯(cuò)誤形成而導(dǎo)致抗體或Ig融合蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤組裝。這樣，本發(fā)明公開了對(duì)參與重鏈同二聚化的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸的突變可導(dǎo)致抗體或Ig融合蛋白質(zhì)表達(dá)或組裝的提高。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重鏈同二聚化半胱氨酸可突變?yōu)?，以通常?yōu)選的順序，絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天門冬酰胺、天門冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或硒代半胱氨酸。
應(yīng)用在最N末端的第一個(gè)半胱氨酸發(fā)生突變的IgG1鉸鏈?zhǔn)翘貏e適宜的。該鉸鏈區(qū)的優(yōu)勢(shì)在于其僅含有兩個(gè)半胱氨酸。IgG1鉸鏈的第一個(gè)半胱氨酸通常與輕鏈中的半胱氨酸形成二硫鍵。但是，在缺乏輕鏈的Ig融合蛋白質(zhì)中，如Fc-X、X-Fc和X-Fc-Y蛋白質(zhì)，IgG1鉸鏈中的此最N端半胱氨酸不起這樣的作用，因此可進(jìn)行突變(Lo等.蛋白質(zhì)工程(ProteinEngineering)11405-500)。如在實(shí)施例中所描述，具兩個(gè)半胱氨酸的IgG1鉸鏈也可用于其中CH1結(jié)構(gòu)域源自IgG2的完整抗體或完整抗體融合蛋白質(zhì)，因?yàn)镮gG2的CH1結(jié)構(gòu)域具有可與輕鏈形成二硫鍵的半胱氨酸。
Fc受體IgG分子可與多種細(xì)胞受體相互作用，包括三類對(duì)IgG類抗體具特異性的Fcγ受體(FcγR)，即FcγRI、FcγRII和FcyγIII。這些受體負(fù)責(zé)攝取抗原抗體復(fù)合物。Fc上的Fc受體結(jié)合位點(diǎn)位于鉸鏈附近的CH2結(jié)構(gòu)域中，且據(jù)認(rèn)為V區(qū)與抗原的結(jié)合可幫助輕鏈恒定區(qū)移位以不再在空間上封閉鉸鏈。由此，結(jié)合抗原的抗體將優(yōu)先地與Fc受體結(jié)合。
第四種受體，又可稱為′保護(hù)受體′(FcRp)或′新生兒受體′(FcRn)，負(fù)責(zé)在抗體抗原復(fù)合體被內(nèi)吞以及它們?cè)趦?nèi)體中解聚后從內(nèi)體中回收抗體。FcRp的結(jié)合位點(diǎn)存在于三維抗體結(jié)構(gòu)中CH2和CH3結(jié)構(gòu)域間的連接處。IgG抗體的血清半衰期取決于與功能性FcRp的生產(chǎn)性相互作用。其他的抗體類型，例如IgM、IgD、IgE和IgA，不與FcRp結(jié)合。
某些抗體的另一結(jié)合配偶體是C1q，其介導(dǎo)補(bǔ)體固定。
與Fc受體和FcRp的相互作用也影響到含F(xiàn)c部分的融合蛋白質(zhì)的生物活性和代謝。
例如，結(jié)合FcR的能力較弱的融合蛋白質(zhì)與具有較好FcR結(jié)合能力的相應(yīng)融合蛋白質(zhì)相比具有較長(zhǎng)的血清半衰期。結(jié)合FcRp的能力較弱的融合蛋白質(zhì)與具有較好FcRp結(jié)合能力的相應(yīng)融合蛋白質(zhì)相比具有較短的血清半衰期。
例如，含IgG2的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的Ig融合蛋白質(zhì)比含IgG1的融合蛋白質(zhì)具較長(zhǎng)的血清半衰期。同樣，含源自IgG3的Fc區(qū)域的融合蛋白質(zhì)比含IgG1或IgG2的相應(yīng)融合蛋白質(zhì)具有較短的血清半衰期。含源自IgM、IgD、IgE和IgA的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)比源自IgG的相應(yīng)融合蛋白質(zhì)具有甚至更短的血清半衰期。
為說(shuō)明本發(fā)明的應(yīng)用，可方便地將抗體和Ig融合蛋白質(zhì)分為兩個(gè)大類需要免疫球蛋白的效應(yīng)子功能的蛋白質(zhì)以及其中Ig部分用作免疫學(xué)惰性載體且缺乏效應(yīng)子功能的蛋白質(zhì)。在前一類蛋白質(zhì)中，可方便地構(gòu)建如下具有雜合同種型的蛋白質(zhì)，在該蛋白質(zhì)中產(chǎn)生多種效應(yīng)子功能的特定集合。在后一類別中，可方便地構(gòu)建如下具有雜合同種型的蛋白質(zhì)，所述雜合同型蛋白質(zhì)包括具有最小效應(yīng)子功能的某些同種型的區(qū)域和可促進(jìn)如蛋白質(zhì)的組裝的來(lái)自其他同種型的區(qū)域，見如下描述。
抗體和Ig融合蛋白的組裝本發(fā)明公開了如下發(fā)現(xiàn)，即抗體或Ig融合蛋白質(zhì)的鉸鏈在融合蛋白質(zhì)(例如從哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的Ig融合蛋白質(zhì))的正確組裝和減少聚集方面起到重要作用。例如，不希望被理論束縛，認(rèn)為抗體和Ig融合蛋白質(zhì)的組裝包括這樣的步驟，其中兩條重鏈?zhǔn)紫韧ㄟ^(guò)CH3內(nèi)的疏水斑進(jìn)行非共價(jià)連接。此連接之后，鉸鏈區(qū)進(jìn)行對(duì)齊且鏈間二硫鍵得以形成。鉸鏈區(qū)距CH3結(jié)構(gòu)域的疏水斑約50埃。
在設(shè)計(jì)抗體或Ig融合蛋白質(zhì)構(gòu)建體時(shí)，改變鉸鏈區(qū)是有益的。例如，將特定表達(dá)構(gòu)建體中的編碼鉸鏈區(qū)的DNA替換為編碼不同的鉸鏈區(qū)，例如來(lái)自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE或IgY的鉸鏈區(qū)的DNA是有益的。
根據(jù)本發(fā)明的理論，例如，含有帶較多半胱氨酸的鉸鏈區(qū)的抗體和Ig融合蛋白質(zhì)不能與帶有較少半胱氨酸的相應(yīng)蛋白質(zhì)一樣有效地組裝。不希望被理論束縛，具有較多半胱氨酸的鉸鏈區(qū)將表現(xiàn)出更多的錯(cuò)誤匹配半胱氨酸及錯(cuò)誤形成二硫鍵的機(jī)會(huì)。結(jié)果是，與具有含較少半胱氨酸的鉸鏈區(qū)的相應(yīng)抗體和Ig融合蛋白質(zhì)相比，可發(fā)現(xiàn)具有含較多半胱氨酸的鉸鏈區(qū)的抗體和融合蛋白質(zhì)更易于發(fā)生高度聚集并且其存在多種電泳類型。此現(xiàn)象的舉例說(shuō)明在實(shí)施例中給出。
例如，含具有四個(gè)半胱氨酸的鉸鏈區(qū)的抗體和Ig融合蛋白質(zhì)的組裝效率低于含三個(gè)或兩個(gè)半胱氨酸的抗體和Ig融合蛋白質(zhì)的組裝效率。例如，含源自IgG2的鉸鏈區(qū)的蛋白質(zhì)的組裝效率低于含源自IgG1的鉸鏈區(qū)的相應(yīng)蛋白質(zhì)。在一獨(dú)特的實(shí)例中，含源自IgG3的鉸鏈區(qū)的蛋白質(zhì)組裝效率低下；IgG3鉸鏈區(qū)含有11個(gè)半胱氨酸。
本發(fā)明的用途尤其可在需要最小限度結(jié)合Fc受體I的情形下得以闡明。例如，在融合蛋白質(zhì)的情形中，可方便地應(yīng)用來(lái)自IgG2的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，由于與FcR的結(jié)合顯著減少，故可以減少ADCC和延長(zhǎng)血清半衰期。但是，IgG2鉸鏈區(qū)的應(yīng)用導(dǎo)致產(chǎn)生的抗體或Ig融合蛋白質(zhì)組裝效率低下。而應(yīng)用IgG2的CH2和CH3區(qū)與IgG1鉸鏈聯(lián)合是特別適宜的，見在以下的多個(gè)實(shí)施例中的闡述。
在一些實(shí)施例中還舉例闡明了一個(gè)類似發(fā)現(xiàn)，即，特定鉸鏈或其他結(jié)構(gòu)域的選擇可影響抗體或Ig融合體的生產(chǎn)水平。該發(fā)現(xiàn)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因?yàn)橹T如完整抗體等蛋白質(zhì)藥物經(jīng)常需要大劑量給藥，例如每個(gè)病人的每次給藥為幾百毫克。通常發(fā)現(xiàn)，選擇具有最少數(shù)目半胱氨酸的鉸鏈，例如具有三個(gè)或兩個(gè)半胱氨酸的鉸鏈能提高真核表達(dá)系統(tǒng)中抗體或Ig融合蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。降低半胱氨酸的數(shù)目可通過(guò)突變或通過(guò)用一種同種型的鉸鏈替換另一同種型的鉸鏈或同時(shí)采用二者而實(shí)現(xiàn)。
提高蛋白酶抵抗力鉸鏈區(qū)對(duì)蛋白酶特別敏感。在經(jīng)典實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)在鉸鏈區(qū)進(jìn)行蛋白酶切割將抗體分成Fab區(qū)和Fc區(qū)。
可方便地構(gòu)建其鉸鏈區(qū)來(lái)自IgA且其他組分來(lái)自其他抗體同種型的抗體和Ig融合蛋白質(zhì)。例如，如果抗體或Ig融合蛋白質(zhì)需經(jīng)口或經(jīng)過(guò)另外的粘膜表面，如鼻、肺、子宮或直腸粘膜遞送時(shí)，應(yīng)用具有強(qiáng)蛋白酶抗性的蛋白質(zhì)可以保護(hù)抗體或Ig融合蛋白質(zhì)免受存在的蛋白酶的作用。例如，構(gòu)建含IgA鉸鏈和來(lái)自IgG的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的抗體或Ig融合蛋白質(zhì)是有利的，這樣該雜合同種型蛋白質(zhì)將具有蛋白酶抵抗特性及，在蛋白質(zhì)進(jìn)入循環(huán)后，延長(zhǎng)的血清半衰期。IgA1鉸鏈為優(yōu)選的鉸鏈，因?yàn)镮gA1鉸鏈內(nèi)的糖基化位點(diǎn)具有廣譜的蛋白酶抗性。相反，IgA2的鉸鏈較短且能抵抗特異切割I(lǐng)gA1鉸鏈的細(xì)菌蛋白酶。
其他同種型重鏈也含有對(duì)抵抗蛋白酶起作用的糖基化位點(diǎn)。例如，IgA、IgD、IgE和IgM在恒定區(qū)含有對(duì)抵抗蛋白酶起作用的糖基化位點(diǎn)。例如，IgE的CH1結(jié)構(gòu)域含有三個(gè)N連接的糖基化位點(diǎn)。將IgE的CH1結(jié)構(gòu)域與，例如，來(lái)自IgA的鉸鏈以及與來(lái)自IgG的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合是有利的。
將來(lái)自一種同種型的糖基化位點(diǎn)摻入到另一同種型的CH2或CH3區(qū)中也是有利的。在此情況下，以完整結(jié)構(gòu)域，即由單一外顯子編碼的區(qū)域所限定的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建抗體或Ig融合蛋白質(zhì)一般是不夠的，因此構(gòu)建雜合結(jié)構(gòu)域是有利的。例如，將IgG同種型特有的FcRp結(jié)合特性與其他同種型的蛋白酶抵抗特性進(jìn)行結(jié)合是有利的。為獲得此類特性結(jié)合，需要構(gòu)建具有來(lái)自兩個(gè)不同同種型的氨基酸序列的單一結(jié)構(gòu)域。然后生成的雜合結(jié)構(gòu)域可用于構(gòu)建Ig與非Ig部分的融合體。
例如，可方便地用來(lái)自IgE CH2結(jié)構(gòu)域且包含序列VNLTW(SEQ IDNO3)的一段氨基酸替換IgG CH2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的相應(yīng)氨基酸。例如，在IgG1中這些氨基酸為VKFNW(SEQ ID NO4)且在IgG3中這些氨基酸為VQFKW(SEQ ID NO5)。根據(jù)本發(fā)明，在其他CH2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的相應(yīng)氨基酸可通過(guò)與其他同種型的CH2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行計(jì)算機(jī)比對(duì)或結(jié)構(gòu)比對(duì)來(lái)確定，或由已發(fā)表文獻(xiàn)確定(Paul，WE基礎(chǔ)免疫學(xué)(Fundamental Immunology)，第四版，第3章，46-47頁(yè))。
類似地，將其他糖基化位點(diǎn)摻入到IgG中也是有利的。例如，可以使用來(lái)自IgD的含NTSGF(SEQ ID NO6)或LNASR(SEQ ID NO7)序列的序列片段替換抗體或Ig融合蛋白質(zhì)中源自IgG的Fc區(qū)域內(nèi)的相應(yīng)序列。根據(jù)本發(fā)明，抗體恒定區(qū)內(nèi)的其他有用糖基化位點(diǎn)在Paul(基礎(chǔ)免疫學(xué)(Fundamental Immunology)，第四版，第3章)及其中的參考文獻(xiàn)中公開。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，非IgG糖基化位點(diǎn)的摻入減弱了與FcRp的相互作用。在此情況下，需要在提高蛋白酶抗性和降低血清半衰期間作出權(quán)衡，且此雜合同種型蛋白質(zhì)的有用性必須在特定的應(yīng)用環(huán)境下進(jìn)行評(píng)估。
根據(jù)本發(fā)明，特定雜合同種型抗體或Ig融合蛋白質(zhì)的蛋白酶抗性可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)試。蛋白酶可購(gòu)自供應(yīng)商且根據(jù)生產(chǎn)者的說(shuō)明書在特定雜合同種型抗體或Ig融合蛋白質(zhì)存在條件下進(jìn)行孵育。蛋白水解的檢測(cè)，例如，可以通過(guò)SDS膠電泳和對(duì)起始材料和切割產(chǎn)物進(jìn)行定量而實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明，雜合同種型抗體或Ig融合蛋白質(zhì)與FcRp相互作用的能力也可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測(cè)定。例如，抗體或Ig融合蛋白質(zhì)的藥物動(dòng)力學(xué)特性可在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行檢測(cè)，所述哺乳動(dòng)物如小鼠、大鼠、兔、狗、非人靈長(zhǎng)類或人?？贵w或Ig融合蛋白質(zhì)的藥物動(dòng)力學(xué)特性為FcRp結(jié)合的一個(gè)實(shí)際指征，且通常，將FcRp結(jié)合特性摻入到抗體或Ig融合蛋白質(zhì)中是意在提高抗體的藥物動(dòng)力學(xué)特性。也可方便地檢查FcRp-Fc復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)以確定特定的雜合同種型抗體或Ig融合蛋白質(zhì)是否可能與FcRp互相作用(Martin，W.L.，等以2.8A檢測(cè)的FcRn/異源二聚體Fc復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)pH-依賴性結(jié)合的機(jī)制Mol.Cell 7 pp.867；structure ID 1 I1A于http//www.rcsb.org/pdb/)。
根據(jù)本發(fā)明的此方面，構(gòu)建Fc-X形式的蛋白質(zhì)是特別有用的，其中Fc區(qū)含來(lái)自IgA1的鉸鏈區(qū)，且其所含CH2和CH3區(qū)包含IgG2中介導(dǎo)FcRp結(jié)合的那些元件以及與其他IgG相比具有減少的效應(yīng)子功能的那些CH2元件。
提高抗體或Ig融合蛋白質(zhì)的效價(jià)根據(jù)本發(fā)明，構(gòu)建高效價(jià)的、但又具有低效價(jià)抗體特有的效應(yīng)子功能或其他特性的雜合同種型抗體或Ig融合蛋白質(zhì)有時(shí)是有利的。IgA和IgM由于通過(guò)CH3區(qū)內(nèi)的鏈間二硫鍵寡聚化而具有高的效價(jià)。IgA和IgM在CH4的C末端附近的半胱氨酸到J鏈間也存在二硫鍵。IgA為二聚體而IgM為五聚體或六聚體，這樣IgA具有4個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)而IgM具有10或12個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
但是，IgM和IgA并不介導(dǎo)ADCC。為構(gòu)建介導(dǎo)ADCC的多價(jià)抗體或Ig融合蛋白質(zhì)，構(gòu)建具有IgG的CH2結(jié)構(gòu)域和IgM或IgA的CH3和CH4結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)是有利的。通常，優(yōu)選地應(yīng)用IgM的CH3和CH4結(jié)構(gòu)域，因?yàn)楫a(chǎn)生的雜合同種型蛋白質(zhì)的效價(jià)高于相應(yīng)的含IgA的雜合同種型蛋白質(zhì)的效價(jià)。
以下的申請(qǐng)闡明了具有增高效價(jià)的雜合同種型蛋白質(zhì)的應(yīng)用。許多腫瘤細(xì)胞在其細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)EGF受體。EGF也在許多正常細(xì)胞的表面表達(dá)，因此正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞間EGF受體的表達(dá)僅在數(shù)量上有區(qū)別。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，有用的IgG-IgM雜合同種型抗體包含與人EGF受體具有弱相互作用的V區(qū)域。對(duì)V區(qū)親合力的選擇使得融合蛋白質(zhì)不能有效的與正常細(xì)胞上的EGF-R作用，但由于親合力效應(yīng)卻可與腫瘤細(xì)胞上過(guò)表達(dá)的EGF受體相互作用。應(yīng)用IgG的CH2結(jié)構(gòu)域，例如IgG1的CH2結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞的ADCC。
為提高特異的殺腫瘤細(xì)胞效應(yīng)，將抗EGF-R的IgG-IgM雜合同種型蛋白質(zhì)與具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行融合是有利的，所述具有抗腫瘤活性的蛋白質(zhì)如細(xì)胞因子。例如，可應(yīng)用IL-2。備選地，將放射性原子綴合到雜合同種型蛋白質(zhì)上是有利的，這樣雜合同種型蛋白質(zhì)在腫瘤區(qū)的聚積將促成對(duì)腫瘤的優(yōu)先輻射。例如，可將釔90綴合到IgG-IgM雜合同種型蛋白質(zhì)上。將ADCC與IL-2活性或ADCC與放射性結(jié)合對(duì)殺腫瘤細(xì)胞是特別有利的。
在IgG-IgM融合蛋白質(zhì)，例如以上所描述的抗腫瘤蛋白質(zhì)中，應(yīng)用IgG(優(yōu)選的為IgG1)鉸鏈區(qū)一般也是有利的。對(duì)于許多應(yīng)用，來(lái)自IgG3的鉸鏈區(qū)為最次的IgG鉸鏈區(qū)，因?yàn)樵撱q鏈區(qū)趨向于造成可變組裝；此外，IgG3鉸鏈易于發(fā)生蛋白水解(Baici A，等，Scand J Immunol.1241-50)。
前述的實(shí)例闡明了本發(fā)明此方面的一般原則即在靶細(xì)胞類型上的表達(dá)高于正常細(xì)胞上的表達(dá)的抗原更可能被具有高效價(jià)但相對(duì)低的單價(jià)親合力的抗體或Ig融合蛋白質(zhì)有效靶向。
例如，在自體免疫性疾病中，某些免疫細(xì)胞如T細(xì)胞表達(dá)較高水平的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞因子受體。用高效價(jià)的針對(duì)此上調(diào)的表面蛋白質(zhì)的IgG1、IgG2或IgG4-IgM抗體或Ig融合蛋白質(zhì)攻擊此類免疫細(xì)胞是有利的。在此方法中，將最小限度地靶向細(xì)胞表面存在此蛋白質(zhì)但此蛋白的量未被上調(diào)的細(xì)胞。例如，在攻擊自體免疫性疾病的過(guò)程中，有用的是，用于治療患者的IgG-IgM融合蛋白質(zhì)中的V區(qū)指導(dǎo)對(duì)抗，例如IL-2受體、IL-12受體或任何的其他上調(diào)的受體。鉸鏈區(qū)和CH2結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地來(lái)自IgG1、IgG2或IgG4，且CH3和CH4區(qū)優(yōu)選地來(lái)自IgM。為治療自體免疫性疾病，V區(qū)優(yōu)選與IL-2或IL-12受體弱結(jié)合。該治療具有殺傷一個(gè)亞類的T細(xì)胞而不是整個(gè)的T細(xì)胞庫(kù)的效應(yīng)。
表達(dá)具有雜合同種型的抗體和Ig融合蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明的抗體和融合蛋白質(zhì)的核酸。當(dāng)編碼核酸也編碼分泌盒子時(shí)本發(fā)明可以得到最好的實(shí)施，所述盒子在轉(zhuǎn)錄和翻譯后產(chǎn)生信號(hào)肽。信號(hào)肽一般從成熟產(chǎn)物中切除。分泌的融合蛋白質(zhì)可由培養(yǎng)基中收集而不需裂解宿主細(xì)胞，然后可測(cè)試其活性或按需要應(yīng)用普通試劑進(jìn)行純化。在一些情況中，某些融合配偶體的存在，例如細(xì)胞因子CNTF，允許在不存在分泌盒子的條件下分泌Ig融合蛋白質(zhì)。
本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員可應(yīng)用帶有內(nèi)含子的DNA進(jìn)行重組DNA的構(gòu)建，因?yàn)樘烊淮嬖诘膬?nèi)含子將編碼鉸鏈的DNA與編碼CH1和CH2結(jié)構(gòu)域的DNA分隔開來(lái)?？蓱?yīng)用內(nèi)含子內(nèi)的限制性位點(diǎn)。備選地，由于鉸鏈區(qū)的長(zhǎng)度一般僅為約15-70個(gè)氨基酸，故可以構(gòu)建出編碼整個(gè)鉸鏈區(qū)的合成DNA，例如應(yīng)用寡核苷酸合成、PCR或它們的組合進(jìn)行。然后可以應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，將合成的編碼鉸鏈的區(qū)域放入編碼Ig融合蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒中。
本發(fā)明由以下非限定的實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。
實(shí)施例實(shí)施例1表達(dá)具有來(lái)自不同抗體同種型的鉸鏈區(qū)和CH2結(jié)構(gòu)域的Fc-X融合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒的構(gòu)建。
表達(dá)HuFcγl-Leptin的質(zhì)粒的構(gòu)建已在PCT出版物WO00/040615A2中描述。
如下所述構(gòu)建具有IgG2來(lái)源的Fc和C末端融合配偶體的融合體的表達(dá)質(zhì)粒。
首先，獲得人γ2Fc的基因組序列。編碼人Fcγ2的基因組DNA通過(guò)PCR從分離自人PBMC的細(xì)胞DNA中獲得。正向引物的序列為5′CCTTAAGC GAG CGC AAA TGT TGT GTC GAG(SEQ ID NO8)，其中AflII限制性位點(diǎn)C TTA AG被導(dǎo)入到γ2鉸鏈編碼區(qū)GAG CGC AAA TGTTGT GTC GAG(SEQ ID NO9)的緊上游。反向引物的序列為5′CCTCGAG TCA TTT ACC CGGGGA CAG GGA G(SEQ ID NO10)，其中XhoI限制性位點(diǎn)CTCGAG被導(dǎo)入到緊接翻譯終止密碼(反密碼子TCA)之后。此外，反向引物也通過(guò)沉默突變(劃線的A到G替換)導(dǎo)入了SmaI位點(diǎn)CC CGGG。910 bp的PCR片段克隆到TOPO TA克隆載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，用于確認(rèn)序列。
第二，將人γ2Fc放入表達(dá)載體。存在于編碼CH3上部區(qū)域的DNA序列CTG CCC CCA TCC CGG GAG GAG ATG ACC AAG(SEQ ID NO11)中的天然SmaI限制性位點(diǎn)通過(guò)沉默突變得以去除，此沉默突變通過(guò)重疊PCR技術(shù)導(dǎo)入(Daugherty，B.L.等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)192471-6，1991)。正向引物的序列為5′CTG CCC CCA TCACGG GAG GAGATG ACC AAG(SEQ ID NO12)，其中劃線處為C到A的替換；且反向引物的序列為5′GGT CAT CTC CTC CCGTGATGG GGG CAG GGTGTA C(SEQ ID NO13)，其中劃線處為G到T的替換。確認(rèn)了序列后，產(chǎn)生的編碼Fcγ2的AflII、XhoI限制性片段在翻譯終止密碼子上游含有唯一的SmaI位點(diǎn)，且在終止密碼子的下游含有一個(gè)XhoI位點(diǎn)。然后編碼Fcγ2的AflII-SmaI片段用于替換pdCs-huFcγl-Leptin(PCT出版物WO00/040615A2)中編碼Fcγ1的相應(yīng)限制性片段以產(chǎn)生pdCs-huFcγ2-Leptin。
第三，編碼Fcγ2鉸鏈的DNA由來(lái)自γ1的改變的鉸鏈替換。γ2鉸鏈區(qū)含有四個(gè)半胱氨酸二硫鍵。以下顯示的是含γ2鉸鏈外顯子的AflII-StuI片段。AflII位點(diǎn)(C TTA AG)位于編碼信號(hào)肽的DNA序列之后。谷氨酸(E)為γ2鉸鏈的第一個(gè)氨基酸殘基。小寫字母代表γ2鉸鏈外顯子之后的內(nèi)含子序列。由于C甲基化存在于序列ccagg和反向鏈cctgg中，StuI限制性位點(diǎn)(aggcct)在大多數(shù)的大腸桿菌菌株中由DCM甲基化酶進(jìn)行了C-甲基化；當(dāng)甲基化時(shí)，該位點(diǎn)不能被StuI切割。
E R K C C V E C P P C P(SEQ ID NO14)C TTA AGC GAG CGC AAA TGT TGT GTC GAG TGC CCA CCG TGC CCA Ggtaagccagcccaggcct(SEQ ID NO15)pdCs-huFcγ2-Leptin中含γ2鉸鏈外顯子的AflII-StuI片段被來(lái)自pdCs-huFcγ1-Leptin的含γ1鉸鏈外顯子的相應(yīng)AflII-StuI片段替換，此相應(yīng)片段的序列如下所示E P K SSD K T H T C P P C P(SEQ ID NO16)C TTA AGC GAG CCC AAA TCTTCTGAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GGtaagccagcccaggcct(SEQ ID NO17)pdCs-huFcγ1中的γ1鉸鏈序列含有Cys到Ser突變(劃線處)，這就消除了與IgG1輕鏈形成二硫鍵的Cys殘基(Lo等，(1998)蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering)11495-500)。由于在γ1和γ2外顯子內(nèi)的StuI位點(diǎn)均發(fā)生C-甲基化且StuI限制性內(nèi)切酶對(duì)甲基化敏感，故在用StuI酶消化之前，從DCM陰性的細(xì)菌菌株中分離這兩種質(zhì)粒。產(chǎn)生的具有來(lái)自pdCs-huFcγ1的鉸鏈區(qū)的pdCs-huFcγ2-Leptin命名為pdCs-huFcγ2h-Leptin(γ2h具有改變的鉸鏈的γ2)。
實(shí)施例2表征huFcγ2-leptin和huFcγ2h-leptin免疫融合體的寡聚化狀態(tài)。
我們對(duì)應(yīng)用具γ1、γ2和γ2h同種型的表達(dá)載體pdCs-huFc-huLeptin從NS/0細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行了評(píng)估。并評(píng)估了不同形式的huFc-hu-Leptin的物理狀態(tài)，其中HuFc部分源自γ1、γ2和γ2h同種型。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，用如上和如在Lo等的描述中所產(chǎn)生的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染NS/0細(xì)胞并產(chǎn)生穩(wěn)定的表達(dá)細(xì)胞系。
在此實(shí)施例和以下的實(shí)施例中，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子按以下的方法產(chǎn)生。質(zhì)粒DNA通過(guò)電穿孔導(dǎo)入鼠骨髓瘤NS/0細(xì)胞。NS/0細(xì)胞生長(zhǎng)在Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基補(bǔ)充了10％的胎牛血清、2mM谷氨酰胺和青霉素/鏈霉素。約5×106個(gè)細(xì)胞用PBS洗滌一次并重懸于0.5ml的PBS中。10μg的線性化質(zhì)粒DNA與細(xì)胞在Gene電擊杯(0.4cm的電極間隙，BioRad)中冰上孵育10min。應(yīng)用Gene電穿孔儀(BioRad，Hercules，CA)進(jìn)行電穿孔，設(shè)置條件為0.25V和500μF。細(xì)胞在冰上復(fù)蘇10min后重懸在生長(zhǎng)培養(yǎng)質(zhì)中并接種兩個(gè)96孔板。在100nM氨甲蝶呤(MTX)存在下通過(guò)生長(zhǎng)來(lái)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，所述氨甲喋呤在轉(zhuǎn)染后兩天加入。每3天飼喂細(xì)胞共兩到三次或更多次，且抗MTX的克隆在兩到三周內(nèi)形成。來(lái)自克隆的上清液用抗Fc ELISA試驗(yàn)測(cè)定以鑒定高產(chǎn)克隆。分離高產(chǎn)克隆并在含100nM MTX的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中繁殖。
應(yīng)用抗huFc抗體(辣根過(guò)氧化物酶連接的山羊抗-huIgG、Fcγ1或Fcγ2，來(lái)自Jackson ImmunoResearch)通過(guò)抗huFc ELISA測(cè)定上清中HuFc-hu-Leptin的濃度。γ1和γ2h構(gòu)建體在瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中都以高水平表達(dá)，而γ2構(gòu)建體上清中檢測(cè)到的表達(dá)水平相對(duì)較低。用編碼huFcγ2-huLeptin和huFcγ2h-huLeptin的等價(jià)表達(dá)載體進(jìn)行的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中，huFcγ2h-huLeptin的產(chǎn)量高8倍。
對(duì)于純化，使組織培養(yǎng)上清中的融合蛋白質(zhì)結(jié)合到蛋白質(zhì)ASepharose上，然后在磷酸鈉緩沖液(100mM NaH2PO4，pH3，和150mMNaCl)中洗脫。然后洗脫物用0.1體積的2M Tris-鹽酸pH8)中和，并用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和HPLC-大小排阻層析(SEC)評(píng)估。
融合蛋白質(zhì)在非還原條件下用SDS-PAGE檢測(cè)。通過(guò)考馬斯染色觀察到的蛋白質(zhì)條帶顯示HuFcγ1-huLeptin的表觀分子量為96kD，這表明其為二價(jià)單體。SDS-PAGE分析顯示多數(shù)huFcγ2-huLeptin融合蛋白質(zhì)為較高分子量形式，遷移時(shí)顯示為梯形條帶，表觀分子量比Fc-Leptin的分子量高得多。相反，huFcγ2h-huLeptin主要為單一種類，遷移到96kD處。
huFeγ2h構(gòu)建體的大小排阻層析(SEC)分析與SDS-PAGE的結(jié)果相關(guān)聯(lián)，且顯示出huFcγ2h-leptin和huFcγ1-leptin均有約83％為單體，而類似的huFcγ2-huLeptin融合蛋白質(zhì)有約55％為單體。
用固定的J774細(xì)胞(所述細(xì)胞富含F(xiàn)cγR類受體)進(jìn)行的研究表明，僅huFcγ1-huLeptin融合蛋白質(zhì)顯示有Fc結(jié)合。此外，還應(yīng)用了BAF-3細(xì)胞，該細(xì)胞經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染可表達(dá)leptin受體，這樣leptin可刺激這些細(xì)胞的增殖(Gainsford，T.，等.PNAS9314564-14568)。對(duì)BAF3/leptin受體細(xì)胞的研究表明huFcγ1-huLeptin、huFcγ2-huLeptin和huFcγ2h-huLeptin具有等價(jià)的leptin生物活性。
我們還鑒定了表達(dá)huFcγ2-huLeptin和huFcγ2h-huLeptin的穩(wěn)定哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆。在基本相同的條件下轉(zhuǎn)染細(xì)胞且克隆了相同數(shù)目的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并測(cè)試了huFcγ2-huLeptin和huFcγ2h-huLeptin的產(chǎn)生。對(duì)于huFcγ2h-huLeptin的最佳表達(dá)克隆，其huFc-huLeptin產(chǎn)量約比huFcγ2-huLeptin的最佳表達(dá)克隆的產(chǎn)量多5倍。
實(shí)施例3具有來(lái)自不同抗體同種型的鉸鏈區(qū)和CH2區(qū)的X-Fc融合蛋白質(zhì)的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
編碼胰高血糖素樣肽1(GLP-1)第7到37位氨基酸殘基(SEQ ID NO19)的合成DNA序列(SEQ ID NO18)如以下公開。
H A E G T F T S D V S S Y L E GC TTA AGC CAT GCT GAA GGG ACC TTT ACT AGT GAT GTA AGT TCT TAT TTG GAA GGCQ A A K E F I A W L V K G R GCAA GCT GCC AAG GAA TTC ATT GCT TGG CTG GTG AAA GGC CGA GGA GGA TCC TTAAGC編碼GLP-1肽的DNA之前為C TTA AGC，在此處應(yīng)用AflII限制性位點(diǎn)將此DNA片段與編碼信號(hào)肽序列的DNA片段(Lo等.蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering))進(jìn)行連接。在3′末端，編碼GLP-1的DNA之后為BamHI限制性位點(diǎn)(GGA TCC，其編碼氨基酸殘基G和S)和AflII限制性位點(diǎn)(所述位點(diǎn)用于連接具有翻譯終止密碼子的編碼Fcγ2(或Fcγ2h)的AflII-XhoI限制性片段(參見實(shí)施例1))。
實(shí)施例4GLP1-huFcγ2和GLP1-huFcγ2h免疫融合體的寡聚化狀態(tài)表征。
由實(shí)施例3產(chǎn)生的載體pdCs GLP-1 huFcγ1、pdCs GLP-1 huFcγ2和pdCs GLP-1 huFcγ2h用于瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以表達(dá)GLP-1(7-37)huFcγ1、GLP-1(7-37)huFcγ2和GLP-1(7-37)huFcγ2h。
在用蛋白質(zhì)A Sepharose純化后，對(duì)每一GLP-1 huFc融合蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài)和總蛋白質(zhì)表達(dá)通過(guò)SDS-PAGE和HPLC-SEC進(jìn)行評(píng)估，所述評(píng)估應(yīng)用在實(shí)施例2中描述的一般方法進(jìn)行。蛋白質(zhì)條帶用考馬斯染色顯示。GLP-1 huFcγ2和GLP-1 huFcγ2h的SDS-PAGE表觀分子量約為60kD。上清中的GLP-1 huFc變體的濃度由抗huFc ELISA測(cè)定。用編碼GLP1-huFcγ2和GLP1-huFcγ2h的等價(jià)表達(dá)載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中，GLP1-huFcγ2h的產(chǎn)量約提高1.5倍。
總細(xì)胞裂解物的SDS-PAGE分析表明，約一半的GLP1-huFcγ2融合蛋白質(zhì)具有不正確的二硫鍵，這由存在多條表觀分子量為100到200KD的高分子量遷移形式所證明。相反，基本上所有可檢測(cè)的GLP1-huFcγ2h融合蛋白質(zhì)都以約60kD的表觀分子量進(jìn)行移動(dòng)。當(dāng)樣本在進(jìn)行SDS-PAGE前被還原，GLP1-huFcγ2和GLP1-huFcγ2h蛋白質(zhì)以基本相同的約34KD的表觀分子量移動(dòng)。
γ1、γ2和γ2h融合蛋白質(zhì)的HPLC-SEC比較分析表明，修飾的γ2h融合蛋白質(zhì)的單體形式顯著多于其他融合蛋白質(zhì)。如由單峰所顯示，修飾的GLP1-huFcγ2h融合蛋白質(zhì)有84％為二價(jià)單體，而GLP1-huFcγ1和GLP1-huFcγ2融合蛋白質(zhì)具有分別對(duì)應(yīng)于約42％和33％的二價(jià)單體的多峰。
由此證實(shí)，具有IgG1的鉸鏈和IgG2的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的GLP-1-Fc融合蛋白質(zhì)的組裝特性令人驚奇地優(yōu)于具有來(lái)自IgG1或IgG2的完整Fc區(qū)域的GLP1-Fc融合蛋白質(zhì)。
實(shí)施例5含IgG2的CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域和IgG1鉸鏈的特異針對(duì)病變細(xì)胞的完整抗體的構(gòu)建。
應(yīng)用分離自人PBMC的細(xì)胞DNA通過(guò)PCR獲得編碼免疫球蛋白γ2恒定區(qū)(CH1、鉸鏈、CH2和CH3)的基因組DNA。正向引物的序列為5′CAAGCTTTCTGGGGCGAGC(SEQ ID NO20)，其中HindIII限制性位點(diǎn)AAGCTT導(dǎo)入到距CH1外顯子上游約220bp處的內(nèi)含子序列內(nèi)。反向引物序列為5′CCTCGAG TCA TTT ACC CGGGGA CAG GGA G(SEQ ID NO21)，其中XhoI限制性位點(diǎn)CTCGAG導(dǎo)入到緊接翻譯終止密碼子(反密碼TCA)之后，且通過(guò)沉默突變產(chǎn)生SmaI CCCGGG，如已在實(shí)施例1中描述的。編碼CH3上部區(qū)域的DNA序列中的天然SmaI限制性位點(diǎn)也通過(guò)沉默突變進(jìn)行消除，所述突變通過(guò)重疊PCR引入，如在實(shí)施例1中所描述的。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，通過(guò)利用實(shí)施例1中獲得的編碼Fcγ2的限制性片段，可容易地構(gòu)建出編碼CH1、鉸鏈、CH2和CH3區(qū)及含有單一SmaI限制性位點(diǎn)的約1810堿基對(duì)(bp)的HindIII-XhoI限制性片段。進(jìn)行序列確認(rèn)之后，用編碼γ2恒定區(qū)的HindIII-XhoI片段置換pdHL7-huKSγ1-IL2中編碼γ2恒定區(qū)的HindIII-XhoI片段，以產(chǎn)生pdHL7-huKSγ2抗體。
huKSγ2h抗體的表達(dá)載體的構(gòu)建如下所示。質(zhì)粒pdCs-huFcγ2h-Leptin用作PCR模板以產(chǎn)生～130bp的PstI-PvuII限制性片段，所述限制性片段僅編碼修飾的γ1鉸鏈區(qū)，該區(qū)中半胱氨酸改變?yōu)榻z氨酸。正向引物的序列為5′CTGCAGAGCCCAAATCTTC(SEQ ID NO22)，其中在γ1鉸鏈外顯子的起始處(具有如上所述的C到S的突變)恢復(fù)了天然的PstI(CTGCAG)限制性位點(diǎn)。反向引物的序列為5′CAGCTGGGGCCTGTCCCTG(SEQ ID NO23)，其與鉸鏈和CH2外顯子間的內(nèi)含子中的Pvu II位點(diǎn)(CAGCTG)對(duì)應(yīng)。確證了序列后，用該～130 bpPstI-PvuII限制性片段替換pdHL7-huKSγ2抗體中的相應(yīng)片段以產(chǎn)生pdHL7-huKSγ2h抗體。
實(shí)施例6非還原狀態(tài)下抗病變細(xì)胞的γ2抗體和相應(yīng)γ2h抗體的表征。
帶有IgGγ1、γ2和γ2h同種型的KS抗體的載體pdHL7用Lipofectamine Plus(Life Technologies，Gaithersburg，MD)通過(guò)脂轉(zhuǎn)染導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞以用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，所述操作根據(jù)供應(yīng)商的實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的產(chǎn)生如在實(shí)施例2中的描述。
條件培養(yǎng)基(10％血清)中的KS抗體用蛋白質(zhì)A Sepharose(Repligen，Cambridge，MA)捕獲，并在用SDS-PAGE表征前通過(guò)在含或不含2-巰基乙醇的蛋白質(zhì)上樣緩沖液中煮沸而得以洗脫?？捡R斯染色可見非還原的KSγ2抗體以幾種形式遷移，分子量約為150kD。相反，KSγ2h抗體以一條主要帶遷移，表觀分子量為150kD。當(dāng)KSγ2抗體和KSγ2h抗體在SDS-PAGE前用巰基乙醇還原時(shí)，對(duì)于KSγ2抗體和KSγ2h抗體可觀察到對(duì)應(yīng)于重鏈和輕鏈條帶的相同條帶圖形。
不被理論所束縛，這些觀察結(jié)果暗示KSγ2所表現(xiàn)的多個(gè)不同遷移種類是二硫鍵接合模式變化的結(jié)果。
表達(dá)KSγ2抗體和KSγ2h抗體的穩(wěn)定哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆也得以鑒定。在基本相同的條件下進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染且克隆了類似數(shù)目的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞并測(cè)試huFc KSγ2抗體和KSγ2h抗體的產(chǎn)量。四株最佳表達(dá)KSγ2h抗體的克隆在每ml組織培養(yǎng)上清中約產(chǎn)生114、98、85和49毫克的抗體，而在相同的條件下，四株最佳表達(dá)huFc KSγ2抗體的克隆在每ml組織培養(yǎng)上清中約產(chǎn)生36、34、15和13毫克的抗體。
實(shí)施例7包括完整抗體的融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建，所述完整抗體含IgG2的CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域和IgG1鉸鏈。
在此實(shí)施例中，測(cè)試了抗體融合蛋白質(zhì)的有用性，所述融合蛋白質(zhì)中的抗體部分具有雜合同種型。
用分離自pdHL7-huKS-IL2的SmaI-XhoI限制性片段替換pdHL7-huKSγ2抗體中的SmaI-XhoI限制性片段，以構(gòu)建出用于huKSγ2-IL2的表達(dá)載體pdHL7-huKSγ2-IL2，所述pdHL7-huKSγ2抗體中的SmaI-XhoI片段含序列GGGTAAATGA(SEQ ID NO24)，隨后為XhoI粘性末端。pdHL7-huKS-IL2中的SmaI-XhoI限制性片段含有序列GGGTAAA及其后緊隨的編碼成熟IL2的DNA序列，包括翻譯終止密碼子。產(chǎn)生的表達(dá)載體pdHL7-huKSγ2-IL2用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞以表達(dá)蛋白質(zhì)。
同樣，用前一自然段所描述的分離自pdHL7-huKS-IL2的SmaI-XhoI限制性片段替換pdHL7-huKSγ2h抗體中的SmaI-XhoI限制性片段，以構(gòu)建出用于huKSγ2h-IL2的表達(dá)載體pdHL7-huKSγ2h-IL2，所述pdHL7-huKSγ2h抗體中的SmaI-XhoI片段含序列GGGTAAATGA(SEQID NO24)，隨后為XhoI粘性末端。產(chǎn)生的表達(dá)載體pdHL7-huKSγ2h-IL2用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞以表達(dá)蛋白質(zhì)。
實(shí)施例8非還原狀態(tài)的γ2-抗體融合蛋白質(zhì)和相應(yīng)γ2h抗體融合蛋白質(zhì)的表征。
編碼KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2的質(zhì)粒用Lipofectamine Plus(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)通過(guò)脂轉(zhuǎn)染導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，所述操作根據(jù)供應(yīng)商的實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。
為獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，質(zhì)粒DNA通過(guò)電穿孔導(dǎo)入鼠骨髓瘤NS/0細(xì)胞，如在實(shí)施例2中所描述的。
具有γ2和γ2h同種型的KS-IL2融合蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行表征，如在實(shí)施例6中所描述的。條件培養(yǎng)基(10％血清)中的抗體融合蛋白質(zhì)被捕獲在蛋白質(zhì)A Sepharose(Repligen，Cambridge，MA)上，并在用SDS-PAGE表征前通過(guò)在含或不含2-巰基乙醇的蛋白質(zhì)上樣緩沖液中煮沸而得以洗脫?？捡R斯染色可見非還原的KSγ2-IL2以幾個(gè)種類遷移，分子量大小約為180kD。相反，KSγ2h-IL2以一條主要帶遷移，表觀分子量為約180kD。當(dāng)KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2在SDS-PAGE前用巰基乙醇還原時(shí)，對(duì)于KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2觀察到對(duì)應(yīng)于重鏈-IL2和輕鏈的相同條帶圖形。
不被理論所束縛，這些觀察結(jié)果暗示KSγ2-IL2所表現(xiàn)出的多個(gè)不同遷移種類是二硫鍵接合模式變化的結(jié)果。
對(duì)修飾的γ2h免疫細(xì)胞因子進(jìn)行了動(dòng)物試驗(yàn)，且在動(dòng)物腫瘤模型中與起始的基于IgGγ1的免疫細(xì)胞因子比較而言，修飾的γ2h免疫細(xì)胞因子具有延長(zhǎng)的半衰期和更好的功效。
我們還鑒定出表達(dá)KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2的穩(wěn)定哺乳動(dòng)物細(xì)胞克隆。在基本相同的條件下轉(zhuǎn)染細(xì)胞且克隆了類似數(shù)目的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并測(cè)試KSγ2-IL2和KSγ2h-IL2的產(chǎn)量。四株最佳表達(dá)KSγ2h-IL2的克隆在每ml組織培養(yǎng)上清中約產(chǎn)生52、37、31和30毫克的融合蛋白質(zhì)，而在相同的條件下四株最佳表達(dá)KSγ2-IL2的克隆在每ml組織培養(yǎng)上清中約產(chǎn)生31、27、27和17毫克的融合蛋白質(zhì)。
實(shí)施例9表達(dá)抗體融合蛋白質(zhì)的質(zhì)粒的構(gòu)建，所融合蛋白質(zhì)具有雜合同種型和影響融合蛋白質(zhì)活性的第二突變HuKSγ2-Ala-IL2對(duì)huKSγ2h-Ala-IL2用分離自pdHL7-huKSγ1-Ala-IL2的相應(yīng)SmaI-XhoI限制性片段分別替換pdHL7-huKSγ2抗體和pdHL7-huKSγ2h抗體中的SmaI-XhoI限制性片段，以構(gòu)建pdHL7-huKSγ2-Ala-IL2和pdHL7-huKSγ2h-Ala-IL2表達(dá)載體(如上所描述)，所述pdHL7-huKSγ2抗體和pdHL7-huKSγ2h抗體中的SmaI-XhoI片段含序列GGGTAAATGA(SEQID NO24)，隨后為XhoI粘性末端。pdHL7-huKSγl-Ala-IL2的SmaI-XhoI片段含有序列GGGTGCA，其后緊隨編碼成熟IL2的DNA序列，所述DNA序列包含翻譯終止密碼子。在融合蛋白質(zhì)的連接處，GCA編碼賴氨酸到丙氨酸的替換。產(chǎn)生的載體用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞以生產(chǎn)huKSγ2-Ala-IL2和huKSγ2h-Ala-IL2。
實(shí)施例10非還原狀態(tài)下攜帶影響融合蛋白質(zhì)功能的第二突變的γ2-抗體融合蛋白質(zhì)和相應(yīng)的γ2h抗體融合蛋白質(zhì)的表征。
編碼KSγ2-Ala-IL2和KSγ2h-Ala-IL2的質(zhì)粒用LipofectaminePlus(Life Technologies，Gaithersburg，MD)通過(guò)脂轉(zhuǎn)染導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，所述操作根據(jù)供應(yīng)商的實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。
我們還鑒定出表達(dá)KSγ2-Ala-IL2和KSγ2h-Ala-IL2的穩(wěn)定哺乳細(xì)胞克隆，如在實(shí)施例2中描述。在基本相同的條件下進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染且克隆了類似數(shù)目的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞并測(cè)試KSγ2-Ala-IL2和KSγ2h-Ala-IL2的產(chǎn)量。三株最佳表達(dá)KSγ2h-Ala-IL2的克隆在每ml組織培養(yǎng)上清中約產(chǎn)生39、38和29毫克的融合蛋白質(zhì)，而在相同條件下三株最佳表達(dá)KSγ2-Ala-IL2的克隆在每ml組織培養(yǎng)上清中約產(chǎn)生22、17和6毫克的融合蛋白質(zhì)。具有γ2和γ2h同種型的KS-Ala-IL2融合蛋白質(zhì)通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行表征，如在實(shí)施例6中的描述。條件培養(yǎng)基(10％血清)中的KS-Ala-IL2融合蛋白質(zhì)被捕獲在蛋白質(zhì)A Sepharose(Repligen，Cambridge，MA)上，并在SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)前通過(guò)在含或不含2-巰基乙醇的蛋白質(zhì)上樣緩沖液中煮沸而得以洗脫?？捡R斯染色可見非還原的KSγ2-Ala-IL2以幾個(gè)種類遷移。相反，KSγ2h-Ala-IL2以一條主要帶遷移。當(dāng)KSγ2-Ala-IL2和KSγ2h-Ala-IL2在SDS-PAGE前用巰基乙醇還原時(shí)，對(duì)于KSγ2Ala-IL2和KSγ2h-Ala-IL2觀察到對(duì)應(yīng)于重鏈-IL2和輕鏈的相同條帶圖形。
不被理論所束縛，這些觀察結(jié)果暗示KSγ2-Ala-IL2所出現(xiàn)的不同遷移種類是由于二硫鍵接合模式變化的結(jié)果。
實(shí)施例11具有源自不同同種型的恒定區(qū)的抗體融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。
在一些情況中，可能還需要構(gòu)建這樣的Ig融合蛋白質(zhì)，其中除了鉸鏈區(qū)，不同的恒定區(qū)也源自不同的重鏈同種型。為檢測(cè)此類分子的特性，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。
huKS(γ1CH1-H)(γ2CH2-CH3)-Ala-IL2蛋白質(zhì)為抗體-IL2融合蛋白質(zhì)，具有含KS VH、來(lái)自IgG1的CH1和鉸鏈區(qū)以及來(lái)自IgG2的CH2-CH3區(qū)的IgG重鏈(在融合連接處具有賴氨酸到丙氨酸的替換，如以上所描述)及隨后的IL-2，該蛋白質(zhì)按如下進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)用來(lái)自pdHL7-KS-IL2的含CH1和鉸鏈區(qū)的相應(yīng)HindIII-AflIII限制性片段替換pdHL7-KSγ2-Ala-IL中的HindIII-AflIII限制性片段構(gòu)建出表達(dá)載體pdHL7-huKS(γ1CH1-H)(γ2CH2-CH3)-Ala-IL2。將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如上所述，以產(chǎn)生具有雜合同種型的抗體融合蛋白質(zhì)。
HuKS(γ1CH1-H)(γ2CH2-CH3)(Ala)-IL2雜合體和HuKSγ2(Ala)-IL2抗體-細(xì)胞因子融合蛋白質(zhì)通過(guò)非還原SDS-PAGE進(jìn)行表征，如在實(shí)施例6中所描述的。HuKS(γ1CH1-H)(γ2CH2-CH3)(Ala)-IL2雜合同種型融合蛋白質(zhì)遷移為一主要條帶，分子量約為180kD。相反，HuKSγ2(Ala)-IL2抗體-細(xì)胞因子融合蛋白質(zhì)在180 kD大小范圍內(nèi)以多條帶遷移。
當(dāng)HuKS(γ1CH1-H)(γ2CH2-CH3)(Ala)-IL2雜合體和HuKS(γ2)(Ala)-IL2抗體-細(xì)胞因子融合蛋白質(zhì)通過(guò)還原SDS-PAGE進(jìn)行表征時(shí)，兩種蛋白質(zhì)給出相同的帶形，與輕鏈和重鏈-IL2融合多肽對(duì)應(yīng)。
不被理論所束縛，看起來(lái)HuKS(γ2)(Ala)-IL2抗體-細(xì)胞因子融合蛋白質(zhì)存在至少兩種不同的異構(gòu)體構(gòu)型，其中差異是由于二硫鍵結(jié)合模式的不同而引起。
實(shí)施例12具有非蛋白質(zhì)抗原特異性和多亞單位融合配偶體的雜合同種型抗體融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。
14.18抗體結(jié)合糖脂抗原GD2。白介素-12為異源二聚體細(xì)胞因子，包括p35和p40亞單位，它們通過(guò)二硫鍵共價(jià)結(jié)合。
如以上所描述，雜合同種型，例如IgGI/IgG2雜合體的應(yīng)用導(dǎo)致與天然同種型如IgG2相比組裝增強(qiáng)。組裝增強(qiáng)可由表達(dá)水平提高證實(shí)。
在一個(gè)例子中，構(gòu)建出14.18(γ2)-Ala-IL12和14.18(γ2h)-Ala-IL12表達(dá)質(zhì)粒并在相同的條件下平行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞，如在以上和Gillies等(W009929732)中所描述的。應(yīng)用了人IL-12。用14.18(γ2h)-Ala-IL12表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物比用14.18(γ2)-Ala-IL12轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物在組織培養(yǎng)上清中蛋白質(zhì)的水平約高40％。
14.18(γ2)-Ala-IL12和14.18(γ2h)-Ala-IL12表達(dá)質(zhì)粒也穩(wěn)定轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞，如以上所描述，且對(duì)每一轉(zhuǎn)染的四株最佳表達(dá)克隆進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。對(duì)于14.18(γ2h)-Ala-IL12，四株最佳表達(dá)克隆的平均值比源自14.18(γ2)-Ala-IL12表達(dá)質(zhì)粒的四株最佳表達(dá)克隆約高45％。
在第二個(gè)例子中，構(gòu)建了14.18(γ2)-IL12和14.18(γ2h)-IL12表達(dá)質(zhì)粒并在相同的條件下平行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞，如以上所描述的。應(yīng)用了鼠IL-12。用14.18(γ2h)-IL12表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物比用14.18(γ2)-IL12轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物在組織培養(yǎng)上清中蛋白質(zhì)的水平約高40％。
應(yīng)用鼠IL-12的14.18(γ2)-IL12和14.18(γ2h)-IL12表達(dá)質(zhì)粒也通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞，如以上所描述，且對(duì)每一轉(zhuǎn)染的四株最佳表達(dá)克隆進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。對(duì)于14.18(γ2h)-IL12，四株最佳表達(dá)克隆的平均值比源自14.18(γ2)-IL12表達(dá)質(zhì)粒的四株最佳表達(dá)克隆約高35％。
這些結(jié)果表明在融合蛋白質(zhì)中應(yīng)用雜合同種型導(dǎo)致表達(dá)增強(qiáng)，甚至應(yīng)用與先前實(shí)施例中不同的抗體和不同的非Ig部分也是如此。在此實(shí)施例中，將IL-12用作非Ig部分預(yù)期可使Ig融合蛋白質(zhì)的組裝明顯變得復(fù)雜，因?yàn)镮L-12為異源二聚體。然而，雜合同種型的應(yīng)用具有有利的效應(yīng)。
實(shí)施例13應(yīng)用來(lái)自IgA的鉸鏈區(qū)的雜合同種型抗體融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。
為構(gòu)建具有增強(qiáng)的蛋白酶抗性的Ig融合蛋白質(zhì)，生產(chǎn)了IgA/IgG融合蛋白質(zhì)。
例如，構(gòu)建Fc-X融合蛋白質(zhì)，其含人IgA1的鉸鏈區(qū)和IgG2的CH2和CH3區(qū)。
以下所示為構(gòu)建產(chǎn)生Fc-X融合蛋白質(zhì)的表達(dá)載體的一個(gè)例子，該蛋白質(zhì)包含來(lái)自人IgA1的鉸鏈區(qū)和IgG2的CH2和CH3區(qū)。實(shí)施例1中的質(zhì)粒pdCs-huFcγ2-Leptin用作載體。
pdCs-huFcγ2-Leptin的含γ2鉸鏈區(qū)外顯子的AflII-StuI片段被相應(yīng)的含IgA1鉸鏈區(qū)外顯子的AflII-StuI片段(SEQ ID NO25，顯示如下)替換(AflII) P S T P P T P S P S T PCTTAAG T CCC TCA ACT CCA CCT ACC CCA TCT CCC TCA ACT CCAP T P S P S C C H (SEQ ID NO26)(StuI)CCT ACC CCA TCT CCC TCA TGC TGC CAC Ggtaagccagcccaggcct具體地，合成了以下寡核苷酸上鏈5′-TTAAGTCCCTCAACTCCACCTACCCCATCTCCCTCAACTCCACCTACCCCATCTCCCTCATGCTGCCACGGTAAGCCAGCCCAGG-3′(SEQ ID NO27)下鏈5′-CCTGGGCTGGCTTACCGTGGCAGCATGAGGGAGATGGGGTAGGTGGAGTTGAGGGAGATGGGGTAGGTGGAGTTGAGGGAC-3′ (SEQ ID NO28)
將這些寡核苷酸退火，并用于替換pdCs-huFcγ2-Leptin中的相應(yīng)片段。
由于γ2外顯子中StuI位點(diǎn)存在C-甲基化且StuI限制性內(nèi)切酶對(duì)甲基化敏感，因此從DCM陰性細(xì)菌菌株分離質(zhì)粒后用StuI酶消化。產(chǎn)生的具有IgA1鉸鏈區(qū)的pdCs-huFcγ2-Leptin命名為pdCs-huFcα1/γ2-Leptin。
將質(zhì)粒pdCs-huFcα1/γ2-Leptin轉(zhuǎn)染導(dǎo)入真核細(xì)胞，且α1(鉸鏈)-γ2(CH2，CH3)-leptin形式的Fc-X蛋白質(zhì)將以分泌蛋白質(zhì)形式得以表達(dá)。例如，利用實(shí)施例2中的細(xì)胞和方法。對(duì)產(chǎn)生的α1-γ2-leptin蛋白質(zhì)進(jìn)行純化、表征，發(fā)現(xiàn)其具有l(wèi)eptin活性且在鉸鏈區(qū)對(duì)蛋白酶切割相對(duì)不敏感。
實(shí)施例14應(yīng)用IgG和多價(jià)免疫球蛋白的組分的雜合同種型抗體融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。
為構(gòu)建具有IgG(如IgG1或IgG3)效應(yīng)子功能且效價(jià)提高的抗體融合蛋白質(zhì)，可用IgG的CH1、鉸鏈和CH2區(qū)以及IgA或IgM的CH3和CH4區(qū)構(gòu)建雜合同種型Ig融合蛋白質(zhì)。圖4顯示了IgG-IgM雜合同種型融合抗體的結(jié)構(gòu)。可方便地將非Ig部分融合到IgA或IgM的CH4結(jié)構(gòu)域的C末端。
也可方便地在最C末端的半胱氨酸前截短IgA或IgM重鏈或突變?cè)摪腚装彼幔貏e是在IgG/IgA或IgG/IgM雜合同種型融合蛋白質(zhì)在缺乏J鏈的情況下進(jìn)行表達(dá)時(shí)。該C末端半胱氨酸的正常功能是與J鏈形成二硫鍵。通常需要在缺乏共表達(dá)J鏈的條件下表達(dá)IgG/IgA或IgG/IgM雜合同種型融合蛋白質(zhì)，特別是當(dāng)將非Ig部分融合到重鏈的C末端上時(shí)。
例如，IgG-IgM雜合同種型融合蛋白質(zhì)可按如下所示構(gòu)建。質(zhì)粒pdHL7-huKSγ1-IL2表達(dá)的抗體具有可結(jié)合上皮細(xì)胞粘附分子的可變區(qū)和人IgG1的恒定區(qū)。該質(zhì)粒在IgG1 CH2和CH3編碼序列間的內(nèi)含子內(nèi)含有單一的Ngo M IV位點(diǎn)，并在IgG1 CH3和IL-2部分的編碼序列間的連接處含有單一的XmaI位點(diǎn)。編碼人IgM CH3和CH4序列的DNA片段通過(guò)PCR擴(kuò)增從人類基因組DNA中產(chǎn)生，所述擴(kuò)增應(yīng)用以下的引物5’-GCA GCCGGC CCTGAGCCTTGGCTTCCCAGAGCG-3’(SEQ ID NO29)；和5’-GCT CCCGGGTCAGTAGCAGGTGCCAGCTGTGTCG-3’(SEQ ID NO30)備選地，可應(yīng)用以下的引物；這些引物的特征在于在IgM部分內(nèi)最靠C末端的半胱氨酸被突變?yōu)榻z氨酸。
5’-GCA GCCGGC CCTGAGCCTTGGCTTCCCAGAGCG-3’；(SEQ ID NO31)和5’-GCT CCCGGGTCAGTAGCTGGTGCCAGCTGTGTCG-3’(SEQ ID NO32)；產(chǎn)生的DNA片段用Ngo M IV和XmaI切割，然后直接或間接連入已經(jīng)用Ngo M IV和XmaI切割的pdHL7-huKSγ1-IL2中。例如，可以將編碼IgM CH3和CH4結(jié)構(gòu)域的PCR片段首先亞克隆到載體，如TA克隆載體(Invitrogen，Carlsbad CA)中，確認(rèn)插入的序列，然后用Ngo M IV和XmaI將插入物移出并連入pdHL7-huKSγ1-IL2。產(chǎn)生的雜合同種型重鏈的氨基酸序列融合到人IL-2上，見SEQ ID No33中顯示。劃線處為融合蛋白質(zhì)的IgM部分。由于人IgM重鏈中天然存在多態(tài)性，也可能產(chǎn)生功能類似的密切相關(guān)序列。
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY(SEQ ID NO33)
許多備選的DNA構(gòu)建策略也是可能的。例如，編碼IgM CH3和CH4結(jié)構(gòu)域的DNA序列可從表達(dá)IgM的細(xì)胞系或細(xì)胞群中通過(guò)RT-PCR產(chǎn)生。3′PCR引物可與如上所示的相同，但5′引物在Ngo M IV位點(diǎn)和IgM CH3編碼序列開頭之間摻入一個(gè)人工5′剪切位點(diǎn)。
然后用產(chǎn)生的質(zhì)粒pdHL7-huKSγ1/μ-IL2轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)從細(xì)胞中表達(dá)和分泌。例如，應(yīng)用在先前的實(shí)施例中描述的細(xì)胞和方法。測(cè)試純化的蛋白質(zhì)，例如通過(guò)電鏡或通過(guò)大小排阻層析，可發(fā)現(xiàn)其具有多聚體結(jié)構(gòu)。對(duì)純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的研究，例如通過(guò)肽作圖，可發(fā)現(xiàn)序列…ASICEDD…(SEQ ID NO34)中的半胱氨酸與其他IgG/IgM雜合同種型亞單位形成鏈間二硫鍵。此連接的一個(gè)實(shí)例在圖4中說(shuō)明。除了圖4中的五聚體結(jié)構(gòu)，IgG/IgM雜合同種型蛋白質(zhì)的最終形式可為六聚體或一些其他類型的多聚體結(jié)構(gòu)。
可發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的IgG/IgM雜合同種型融合蛋白質(zhì)結(jié)合Fcγ受體。例如，融合蛋白質(zhì)將以和人IgG競(jìng)爭(zhēng)的方式結(jié)合J774細(xì)胞。
實(shí)施例15應(yīng)用IgG1和IgG4的組分的雜合同種型抗體的表達(dá)。
實(shí)施例15-17中的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟糠质菫榱俗C明雜合同種型抗體在提高主要由IgG4組成的分子的組裝中的效用。通常，一般優(yōu)選形式的IgG分子為H2L2形式，具有兩條重鏈和兩條輕鏈。但是，相當(dāng)大部分的IgG4抗體合成為HL″半分子″，具有一條重鏈和一條輕鏈。Angal等(1993；Molec.Immunol.30105)描述了絲氨酸到脯氨酸的替換，此替換減少了存在于分泌的人IgG4中的″半分子″的數(shù)量。
此實(shí)施例比較了含相同V區(qū)的三種抗體的組裝特性，所述三種抗體為IgG4形式，具有IgG1鉸鏈和IgG4的CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的IgG形式，以及在鉸鏈區(qū)具有突變的IgG4形式(Angal等，出處同上)。
應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)，構(gòu)建出名為pdHL7-KS-γ4的質(zhì)粒。除了該質(zhì)粒編碼IgG4重鏈恒定區(qū)而不是IgG2重鏈恒定區(qū)之外，該質(zhì)粒與在實(shí)施例5中描述的質(zhì)粒pdHL7-huKSγ2相同。
為構(gòu)建pdHL7-KS-γ4h，將質(zhì)粒pdHL7-KS-γ2h生長(zhǎng)在dcm(-)大腸桿菌菌株中，分離質(zhì)粒DNA，且分離編碼修飾的IgG1鉸鏈區(qū)的60bpPstI-StuI片段用于替換pdHL7-KS-γ4中的相應(yīng)片段。
為實(shí)施比較，按如下構(gòu)建出鉸鏈區(qū)具有突變的IgG4形式(Angal等，出處同上)。設(shè)計(jì)編碼γ4鉸鏈的寡核苷酸雙鏈體，其具有絲氨酸到脯氨酸的替換、5′PstI粘性末端和3′StuI鈍性末端，所述寡核苷酸雙鏈體如下PstI E S K Y G P P C PPC P(SEQ ID NO35)GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCACCTTGC CCA GGTAAGACGT CTC AGG TTT ATA CCA GGGGGT ACG GGT GGA ACG GGT CCATTCStuICCAACCCAGG(SEQ ID NO36的互補(bǔ)鏈)GGTTGGGTCC(SEQ ID NO36)該寡核苷酸雙鏈體用于替換pdHL7-KS-γ4中相應(yīng)的DNA片段以產(chǎn)生pdHL7-KS-γ4(S到P)。
根據(jù)如在Lo等，(1998；蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering)11495-500)中所描述的常規(guī)方法，將質(zhì)粒pdHL7-KS-γ4、pdHL7-KS-γ4h和pdHL7-KS-γ4(S到P)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。從轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清中純化由pdHL7-KS-γ4、pdHL7-KS-γ4h和pdHL7-KS-γ4(S到P)編碼的抗體蛋白質(zhì)，并通過(guò)SDS凝膠電泳進(jìn)行表征，其中對(duì)還原和非還原樣本進(jìn)行比較。
通過(guò)檢測(cè)非還原分子，發(fā)現(xiàn)KS-γ4抗體群中存在約50％的HL″半分子″和50％的H2L2分子。相反，KS-γ4h抗體群和KS-γ4(S到P)抗體群幾乎全部以H2L2分子存在。HL半分子的比例在KS-γ4h抗體群和KS-γ4(S到P)抗體群中基本相同。當(dāng)檢測(cè)還原分子時(shí)，KS-γ4、KS-γ4h和KS-γ4(S到P)所顯示的重鏈和輕鏈圖形無(wú)可區(qū)分的差異。
實(shí)施例16應(yīng)用IgG1和IgG4的組分的雜合同種型抗體融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。
質(zhì)粒pdHL7-KS-γ4-IL2在Gillies等(癌癥研究(CancerResearch) 592159)中描述。該質(zhì)粒編碼的抗體融合蛋白質(zhì)具有識(shí)別EpCAM抗原的V區(qū)且包含在C末端融合有白介素-2的IgG4重鏈。
通過(guò)與實(shí)施例15中所用類似的重組DNA方法，構(gòu)建出質(zhì)粒pdHL7-KS-γ4h-IL2和pdHL7-KS-γ4(S到P)-IL2。將質(zhì)粒pdHL7-KS-γ4-IL2、pdHL7-KS-γ4h-IL2和pdHL7-KS-γ4(S到P)-IL2轉(zhuǎn)染導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法表達(dá)和純化相應(yīng)蛋白質(zhì)，所述方法例如在Lo等。(參考文獻(xiàn))中描述的方法。從轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清中純化由pdHL7-KS-γ4-IL-2、pdHL7-KS-γ4h-IL-2和pdHL7-KS-γ4(S到P)-IL-2編碼的融合蛋白質(zhì)，并通過(guò)SDS凝膠電泳進(jìn)行表征，其中對(duì)還原和非還原樣本進(jìn)行比較。
通過(guò)測(cè)試非還原分子，發(fā)現(xiàn)KS-γ4-IL-2融合蛋白質(zhì)群體中存在約50％的HL″半分子″和50％的H2L2分子。相反KS-γ4h-IL-2融合蛋白質(zhì)群體和KS-γ4(S到P)-IL-2融合蛋白質(zhì)群體幾乎全部以H2L2分子存在。HL半分子的比例在KS-γ4h-IL-2融合蛋白質(zhì)群體和KS-γ4(S到P)-IL-2融合蛋白質(zhì)群體中大約相同。當(dāng)檢測(cè)還原分子時(shí)，KS-γ4-IL-2、KS-γ4h-IL-2和KS-γ4(S到P)-IL-2所顯示的重鏈和輕鏈圖形無(wú)可區(qū)分的差異。
實(shí)施例17應(yīng)用IgG1和IgG4的組分的雜合同種型Fc融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。
進(jìn)行以下的步驟，以產(chǎn)生表達(dá)融合蛋白質(zhì)的一組質(zhì)粒，所述蛋白含鉸鏈區(qū)、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域和非Ig部分，其中的Ig部分源自IgG4和IgG1。
首先，應(yīng)用與實(shí)施例1中所述類似的方法，通過(guò)將pdCs-huFcγ1中IgG1來(lái)源的DNA序列(Lo等，蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering)11495-500)替換為編碼IgG4相應(yīng)部分的序列以產(chǎn)生編碼IgG4的Fc區(qū)域的表達(dá)載體。具體地，以下的寡核苷酸序列
E S K Y G P P C P S C(SEQ ID NO37)CTTA AGC GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCA TCA TGC(SEQ ID NO38)在其5′端編碼一AflII位點(diǎn)，用作擴(kuò)增編碼IgG4鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的DNA片段的5′引物。3′引物在其5′端含有一XhoI位點(diǎn)，與用于實(shí)施例1中擴(kuò)增IgG2 Fc區(qū)的引物類似。產(chǎn)生的AflII-XhoI片段插入到XhoI+AflII切割的pdCs-huFcγ1中以生成pdCs-huFcγ4。
為促進(jìn)編碼非IgG部分的核酸在Fcγ4的C末端插入，通過(guò)在pdCs-huFcγ4中于Fcγ4編碼區(qū)C末端附近導(dǎo)入以下的Leu到Pro的改變而產(chǎn)生一個(gè)SmaI位點(diǎn)，見如下S L G K STOP SPG K STOP(SEQ ID NO39) (SEQ ID NO40)TCT CTG GGT AAA TGA改變?yōu)? TCCCCG GGT AAA TGA.
(SEQ ID NO41) (SEQ ID NO42)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)定點(diǎn)誘變技術(shù)將SmaI位點(diǎn)導(dǎo)入pdCs-huFcγ4中。
名為pdCs-huFcγ4h的質(zhì)粒編碼修飾的IgG1鉸鏈及隨后IgG4的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，為生成pdCs-huFcγ4h質(zhì)粒，將編碼IgG2的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域的pdCs-huFcγ2h(實(shí)施例1)中的StuI-XhoI片段，替換為pdCs-huFcγ4中的相應(yīng)片段。在此構(gòu)建中，每一親本質(zhì)粒都來(lái)自dcm(-)大腸桿菌菌株。由于在編碼γ4的DNA中存在一額外的StuI位點(diǎn)，質(zhì)粒pdCs-huFcγ4用XhoI作徹底消化并用StuI作部分消化，產(chǎn)生約300、500和800堿基對(duì)的片段。約800堿基對(duì)的片段用于替換pdCs-huFcγ2h中的相應(yīng)片段。
應(yīng)用PCR克隆IFNβcDNA，應(yīng)用的有義引物為CCCGGGT ATGAGC TAC AAC TTG CTT GGA TTC(SEQ ID NO43)，其中的ATG為成熟蛋白質(zhì)的N末端殘基且CCCGGG為引入的SmaI限制性位點(diǎn)，反向引物為CTCGAG TCA GTT TCG GAG GTA ACC TGT AAG(SEQ ID NO44)，其中TCA為翻譯終止密碼子的反密碼子且CTCGAG為引入的XhoI限制性位點(diǎn)。模板DNA為pLG117R(Taniguchi等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 775230-5233)且購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC編號(hào)31903)。對(duì)序列進(jìn)行確認(rèn)之后，克隆的SmaI-XhoI片段連入pdCs-huFcγ4表達(dá)載體的SmaI和XhoI位點(diǎn)間以產(chǎn)生pdCs-huFcγ4-IFNβ。類似的pdCs-huFcγ4h-IFNβ表達(dá)質(zhì)粒也通過(guò)相似的方法構(gòu)建。
為構(gòu)建pdCs-huFcγ4(S到P)-IFNβ表達(dá)質(zhì)粒，合成了編碼γ4鉸鏈的寡核苷酸雙鏈體，所述雙鏈體具有絲氨酸到脯氨酸的替換和5′ AflII粘端和3′StuI鈍端，見如下AflIIE S K Y G P P C PPC P(SEQ ID NO45)TTA AGC GAG TCC AAA TAT GGT CCC CCA TGC CCACCTTGC CCA GGTG CTC AGG TTT ATA CCA GGG GGT ACG GGT GGA ACG GGT CCAStuIAAGCCAACCCAGG(SEQ ID NO46)TTC GGTTGGGTCC(SEQ ID NO46的互補(bǔ)鏈)該DNA用于替換pdCs-Fc-g4-IFN β中的相應(yīng)DNA片段以生成pdCs-huFcγ4(S到P)-IFNβ。
將質(zhì)粒pdCs-huFcγ4-IFNβ、pdCs-huFcγ4h-IFNβ和pdCs-huFcγ4(S到P)-IFNβ分別轉(zhuǎn)染導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。純化含F(xiàn)c的表達(dá)蛋白質(zhì)并用還原和非還原SDS凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的huFcγ4-IFNβ蛋白質(zhì)中有相當(dāng)大部分為單體半分子而不是二聚體的正?？贵w。但是，表達(dá)的huFcFγ4h-IFNβ和huFcγ4(S到P)-IFNβ融合蛋白質(zhì)幾乎全部為正確組裝的二聚體。對(duì)于huFcγ4h-IFNβ和huFcγ4(S到P)-IFNβ融合蛋白質(zhì)，單體的比例幾乎相同。
總之，實(shí)施例15、16和17的結(jié)果表明，對(duì)于主要由IgG4組成但具有修飾的IgG1鉸鏈的雜合同種型抗體和Ig融合蛋白質(zhì)，其具有的組裝特性優(yōu)于完全源自IgG4的相應(yīng)蛋白質(zhì)。此外，實(shí)施例15-17的結(jié)果與其他實(shí)施例一道表明，雜合同種型蛋白質(zhì)的組裝提高可以以幾個(gè)不同的方式顯現(xiàn)。例如，在一些情況中，雜合同種型抗體或融合蛋白質(zhì)與相應(yīng)單一同種型抗體或Ig融合蛋白質(zhì)相比顯示出聚集減少；而在其他情況中雜合同種型抗體或融合蛋白質(zhì)與相應(yīng)的單一同種型抗體或Ig融合蛋白質(zhì)相比顯示出增強(qiáng)的正確寡聚化。
實(shí)施例18應(yīng)用IgG1和IgG4的組分的雜合同種型Fc融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。
為產(chǎn)生從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)最低限度聚集的Fc-紅細(xì)胞生成素融合蛋白質(zhì)，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建以下的表達(dá)質(zhì)粒。應(yīng)用在WO01/36489中公開的XmaI-XhoI DNA片段，該片段含一種形式的人紅細(xì)胞生成素編碼序列，所述序列具有導(dǎo)致His32Gly、Cys33Pro、Trp88Cys和Pro90Ala氨基酸替換的突變。相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列顯示在SEQ ID NO47中APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEGPSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPCEGLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR將該XmaI-XhoI DNA片段插入到編碼IgG1鉸鏈區(qū)和IgG2 CH2和CH3區(qū)的質(zhì)粒載體中，該載體除了存在兩組突變導(dǎo)致在CH3 C末端產(chǎn)生了氨基酸替換外與在實(shí)施例1中構(gòu)建的載體基本相同，這樣CH3 C-末端和Epo N-末端的連接處的序列如下....TQKSATATPGA-APPRLI....(SEQ ID NO48)第一組突變將IgG2的CH3區(qū)序列KSLSLSPG(SEQ ID NO49)改變?yōu)镵SATATPG(SEQ ID NO45)，所述突變?cè)诿绹?guó)專利申請(qǐng)系列No.60/280，625中公開。用Ala-Thr-Ala-Thr(SEQ ID NO50的3位到6位)替換Leu-Ser-Leu-Ser(SEQ ID NO49的3位到6位)的作用是除去潛在人非己T細(xì)胞抗原表位，該表位可以因?yàn)槿薋c和人紅細(xì)胞生成素間的連接處含有非己肽序列而產(chǎn)生。第二組突變由CH3區(qū)C末端氨基酸的K到A的單氨基酸替換組成，在美國(guó)專利申請(qǐng)系列No.09/780,668中公開。
將產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染導(dǎo)入NS/0細(xì)胞并根據(jù)實(shí)施例1和2中的方法表達(dá)和純化Fc-Epo融合蛋白質(zhì)?；谂c蛋白質(zhì)A的結(jié)合進(jìn)行純化之后，含如上所述的IgG2 CH3和紅細(xì)胞生成素替換的huFcγ2h-huEpo蛋白質(zhì)通過(guò)大小排阻層析表征，發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)獨(dú)立制備物中此蛋白質(zhì)由97％的單體及90％的單體組成。發(fā)現(xiàn)以摩爾為基礎(chǔ)，在檢測(cè)紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)刺激TF-1細(xì)胞分裂的能力的基于細(xì)胞的試驗(yàn)中，包含如上所述的IgG2 CH3和紅細(xì)胞生成素替換的huFcγ2h-huEpo蛋白質(zhì)具有與人促紅細(xì)胞生成素幾乎一樣的活性。試驗(yàn)的進(jìn)行如在WO01/36489中的描述。
此外，表征了非突變?nèi)思t細(xì)胞生成素與Fc區(qū)C末端的融合物，所述Fc區(qū)由IgG1(鉸鏈-CH2-CH3)、IgG2(鉸鏈-CH2-CH3)或IgG1(鉸鏈)-IgG2(CH2-CH3)組成。構(gòu)建了含非突變?nèi)薋c序列和非突變紅細(xì)胞生成素序列的表達(dá)質(zhì)粒，所用方法類似于構(gòu)建上述及實(shí)施例1的質(zhì)粒的方法。用Fcγ1-Epo、Fcγ2-Epo和Fcγ2h-Epo表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NS/0細(xì)胞，并對(duì)于每一質(zhì)粒在篩選了大約相同數(shù)目的克隆后分離穩(wěn)定的克隆。產(chǎn)量最佳的克隆產(chǎn)生50μg/ml的Fcγ1-Epo、20μg/ml的Fcγ2-Epo和120μg/ml的Fcγ2h-Epo。
等價(jià)方案本發(fā)明可以以其他特定的形式體現(xiàn)，而不偏離其精神和本質(zhì)特征。因此認(rèn)為前述的實(shí)施方案在所有的方面均為例證性的而非限定在此描述的發(fā)明。本發(fā)明的范圍因此由附屬的權(quán)利要求而不是前面的描述來(lái)說(shuō)明，并且所有的在此權(quán)利要求的等價(jià)范圍和意義內(nèi)的變化均意在包括于其中。
參考引入所有以上提及的專利、專利申請(qǐng)和科學(xué)出版物均完整引入本申請(qǐng)作為參考。
序列表 圖1
圖2
圖3
圖4
<110>默克專利有限公司<120>用于含雜合同種型抗體部分的蛋白質(zhì)的表達(dá)技術(shù)<130>LEX-016PC<150>US 60/274,096<151>2001-03-07<160>50<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG2鉸鏈序列<400>1Glu Arg Lys Ser Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10<210>2<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG2-IgG4雜合鉸鏈序列<400>2Glu Ser Lys Tyr Gly Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10<210>3<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgE-CH2結(jié)構(gòu)域序列<400>3Val Asn Leu Thr Trp1 5<210>4<211>5
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG1 CH2結(jié)構(gòu)域序列<400>4Val Lys Phe Asn Trp1 5<210>5<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG3 CH2結(jié)構(gòu)域序列<400>5Val Gln Phe Lys Trp1 5<210>6<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>來(lái)自IgD的糖基化位點(diǎn)<400>6Asn Thr Ser Gly Phe1 5<210>7<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>來(lái)自IgD的糖基化位點(diǎn)<400>7Leu Asn Ala Ser Arg1 5<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于人Fcγ2的正向引物<400>8ccttaagcga gcgcaaatgt tgtgtcgag 29<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人Fcγ2鉸鏈編碼區(qū)<400>9gagcgcaaat gttgtgtcga g 21<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于人Fcγ2的反向引物<400>10cctcgagtca tttacccggg gacagggag 29<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>針對(duì)CH3上部區(qū)域的DNA序列<400>11ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 30<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于在CH3上部區(qū)域中引入C到A的替換的正向引物<400>12ctgcccccat cacgggagga gatgaccaag30<210>13<211>34<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于在CH3區(qū)域中引入C到A的替換的反向引物<400>13ggtcatctcc tcccgtgatg ggggcagggtgtac 34<210>14<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>γ2鉸鏈<400>14Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10<210>15<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>γ2鉸鏈外顯子<400>15cttaagcgag cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccaggtaagc cagcccaggc 60ct 62<210>16<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有Cys到ser突變的γ1鉸鏈序列<400>16Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10 15<210>17<211>71<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有γ1鉸鏈外顯子的DNA片段<400>17cttaagcgag cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc caggtaagcc60agcccaggcc t 71
<210>18<211>112<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼胰高血糖素樣肽1的序列<400>18cttaagccat gctgaaggga cctttactag tgatgtaagt tcttatttgg aaggccaagc 60tgccaaggaa ttcattgctt ggctggtgaa aggccgagga ggatccttaa gc 112<210>19<211>31<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>胰高血糖素樣肽1<400>19His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>20<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于免疫球蛋白γ2恒定區(qū)的正向引物<400>20caagctttct ggggcgagc19<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于免疫球蛋白γ2恒定區(qū)的反向引物<400>21cctcgagtca tttacccggg gacagggag 29<210>22<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>用于γ1鉸鏈區(qū)的正向引物<400>22ctgcagagcc caaatcttc 19<210>23<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于γ1鉸鏈區(qū)的反向引物<400>23cagctggggc ctgtccctg 19<210>24<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pDHL2-huKS抗體中的序列<400>24gggtaaatga 10<210>25<211>89<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>IgA1鉸鏈外顯子<400>25cttaagtccc tcaactccac ctaccccatc tccctcaact ccacctaccc catctccctc 60atgctgccac ggtaagccag cccaggcct 89<210>26<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgA1鉸鏈區(qū)<400>26Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser1 5 10 15
Pro Ser Cys Cys His20<210>27<211>85<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>上置換鏈<400>27ttaagtccct caactccacc taccccatct ccctcaactc cacctacccc atctccctca 60tgctgccacg gtaagccagc ccagg 85<210>28<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>下置換鏈<400>28cctgggctgg cttaccgtgg cagcatgagg gagatggggt aggtggagtt gagggagatg 60gggtaggtgg agttgaggga c 81<210>29<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于IgM CH3和CH4的引物<400>29gcagccggcc ctgagccttg gcttcccaga gcg 33<210>30<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于IgM CH3和CH4的引物<400>30gctcccgggt cagtagcagg tgccagctgt gtcg 34<210>31<211>33<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>用于將IgM中最C端的Cys突變?yōu)閟er的引物<400>31gcagccggcc ctgagccttg gcttcccaga gcg33<210>32<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于將IgM中最C端的Cys突變?yōu)閟er的引物<400>32gctcccgggt cagtagctgg tgccagctgt gtcg 34<210>33<211>460<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG1-IgM雜合體的恒定區(qū)<400>33Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys100 105 110Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro15 120 125Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys130 135 140Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asr Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu165 170 175Glu Gln Tyr Asn ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu180 185 190His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn195 200 205Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Asp210 215 220Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser225 230 235 240Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu245 250 255Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu260 265 270Ala Val Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr275 280 285Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser290 295 300Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro305 310 315 320Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro325 330 335Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu340 345 350Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val355 360 365Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr370 375 380Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe385 390 395 400Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu405 410 415Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr420 425 430Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val435 440 445Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr450 455 460
<210>34<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG1-IgM雜合體中的肽序列<400>34Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp1 5<210>35<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有ser到Pro的突變的IgG4鉸鏈區(qū)<400>35Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro1 5 10<210>36<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸雙鏈體<400>36acgtctcagg tttataccag ggggtacggg tggaacgggt ccattcggtt gggtcc56<210>37<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>IgG4鉸鏈<400>37Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys1 5 10<210>38<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于IgG4鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的引物
權(quán)利要求
1.融合蛋白質(zhì)，其包含與非免疫球蛋白部分融合的免疫球蛋白部分，其中所述免疫球蛋白部分包含來(lái)自第一抗體同種型的第一結(jié)構(gòu)域和來(lái)自第二抗體同種型的第二結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其中所述免疫球蛋白區(qū)包含來(lái)自第一抗體同種型的鉸鏈區(qū)和來(lái)自第二抗體同種型的恒定區(qū)。
3.權(quán)利要求2的融合蛋白質(zhì)，其中所述恒定區(qū)為CH2結(jié)構(gòu)域。
4.權(quán)利要求3的融合蛋白質(zhì)，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域來(lái)自人IgG2重鏈，且所述鉸鏈區(qū)含有三個(gè)或更少的半胱氨酸殘基。
5.權(quán)利要求3的融合蛋白質(zhì)，其中所述CH2結(jié)構(gòu)域來(lái)自人IgG4重鏈。
6.權(quán)利要求2的融合蛋白質(zhì)，其中鉸鏈區(qū)不是IgG2鉸鏈區(qū)。
7.權(quán)利要求2的融合蛋白質(zhì)，其中鉸鏈區(qū)來(lái)自人IgG1。
8.權(quán)利要求3-6的融合蛋白質(zhì)，其中鉸鏈區(qū)具有兩個(gè)或更少的半胱氨酸。
9.權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域缺乏抗原結(jié)合位點(diǎn)。
10.權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包含抗原結(jié)合位點(diǎn)。
11.權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其中非Ig部分通過(guò)遺傳工程融合到Ig結(jié)構(gòu)域重鏈的C末端。
12.權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其中非Ig部分通過(guò)遺傳工程融合到Ig結(jié)構(gòu)域重鏈的N末端。
13.權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其中非Ig部分與輕鏈多肽融合。
14.權(quán)利要求2的融合蛋白質(zhì)，其中鉸鏈區(qū)來(lái)自人IgA。
15.權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其中所述第一免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)镃H2結(jié)構(gòu)域且所述第二免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域?yàn)镃H3結(jié)構(gòu)域。
16.權(quán)利要求15的融合蛋白質(zhì)，其中第一抗體同種型為IgG且第二抗體同種型為IgM或IgA。
17.包含IgG2抗體部分的抗體或Ig融合蛋白質(zhì)，其中IgG2鉸鏈經(jīng)過(guò)突變包含兩個(gè)半胱氨酸。
18.包含針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的V結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白部分，該免疫球蛋白部分包含來(lái)自第一抗體同種型的第一結(jié)構(gòu)域和來(lái)自第二抗體同種型的第二結(jié)構(gòu)域。
19.權(quán)利要求18的蛋白質(zhì)，其包含失活的Fc受體I結(jié)合位點(diǎn)和具有三個(gè)或更少的半胱氨酸的鉸鏈區(qū)。
20.編碼權(quán)利要求1、17或18的融合蛋白質(zhì)的核酸。
21.表達(dá)權(quán)利要求1、17或18的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
22.用于提高抗體或Ig融合蛋白質(zhì)的組裝的方法，所述方法包括步驟a.用不同的鉸鏈區(qū)替換該蛋白質(zhì)的鉸鏈區(qū)；和b.檢測(cè)改變的蛋白質(zhì)的組裝。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述蛋白質(zhì)和所述改變的蛋白質(zhì)通過(guò)遺傳工程技術(shù)得以產(chǎn)生。
24.權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其中免疫球蛋白部分包含F(xiàn)c重鏈區(qū)且非免疫球蛋白部分包含紅細(xì)胞生成素分子。
25.編碼權(quán)利要求24的融合蛋白質(zhì)的核酸。
26.權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其中非免疫球蛋白部分包含紅細(xì)胞生成素分子。
27.用于提高細(xì)胞中抗體或Ig融合蛋白質(zhì)產(chǎn)生的方法，所述方法包括步驟a.用不同的鉸鏈區(qū)替換所述蛋白質(zhì)的鉸鏈區(qū)；和b.檢測(cè)改變的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述蛋白質(zhì)和所述改變的蛋白質(zhì)通過(guò)遺傳工程技術(shù)產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于有效表達(dá)抗體融合蛋白質(zhì)的方法和組合物。本發(fā)明的抗體融合蛋白質(zhì)包括一雜合抗體部分，所述雜合抗體部分含有來(lái)自一種以上抗體的序列和/或突變體抗體序列。本發(fā)明的雜合抗體融合蛋白質(zhì)可以高水平產(chǎn)生，且除了非抗體部分的功能活性外還可以將不同抗體類型的特征性功能活性組合在一起。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1509293SQ02806064
公開日2004年6月30日 申請(qǐng)日期2002年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月7日
發(fā)明者S·D·吉利斯, J·韋, 勞健明, S D 吉利斯 申請(qǐng)人:默克專利有限公司