專利名稱：黃曲霉毒素m1免疫層析試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條及其制備 方法。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉分泌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是一種能引起 人畜各種損害的天然有毒化合物。黃曲霉毒素(AFT)目前已發(fā)現(xiàn)20余種，其中黃曲霉毒素 Bl為毒性及致癌性最強(qiáng)的物質(zhì)。黃曲霉毒素Ml是黃曲霉毒素Bl的羥基化代謝產(chǎn)物，也是 一種強(qiáng)致癌物質(zhì)。當(dāng)哺乳動(dòng)物攝入AFBl污染的飼料后，在體內(nèi)經(jīng)羥基化會(huì)將AFMl分泌于乳 汁當(dāng)中。奶牛經(jīng)攝入黃曲霉毒素Bl污染的飼料后產(chǎn)出的牛奶中便含有黃曲霉毒素Ml。由 于黃曲霉毒素Ml相當(dāng)穩(wěn)定，巴氏滅菌法也無法將其殺滅，所以檢測(cè)黃曲霉毒素Ml不僅要檢 測(cè)動(dòng)物飼料原料，而且要檢測(cè)最終產(chǎn)品。為此世界各國都規(guī)定了牛乳及其制品中黃曲霉毒 素Ml的最大允許含量并將其作為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)，如中國政府規(guī)定牛乳及其制品(消毒牛奶、 新鮮生牛乳、全脂牛奶粉、淡煉乳、甜煉乳、奶油)中黃曲霉毒素Ml的最高允許含量為0. 5 ng/mL0現(xiàn)有技術(shù)中常用的黃曲霉毒素檢測(cè)技術(shù)主要有薄層層析法(TLC)、高效液相色譜 法(HPLC)、免疫學(xué)分析法。前兩者具有樣品前處理步驟繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，儀器價(jià)格昂貴，需要 專業(yè)人員操作等的缺點(diǎn)，而免疫學(xué)分析法具有特異性強(qiáng)、樣品前處理簡(jiǎn)單、成本低、對(duì)實(shí)驗(yàn) 人員和環(huán)境的污染危害小等優(yōu)點(diǎn)。最常用的免疫學(xué)分析法有酶聯(lián)免疫吸附法、納米金免疫 層析法等。目前已有黃曲霉毒素Ml的ELISA試劑盒問世，如德國拜發(fā)R-Biopharm公司以 及美國Abraxis公司等研發(fā)的黃曲霉毒素Ml ELISA檢測(cè)試劑盒。而基于納米金的免疫層 析快速檢測(cè)技術(shù)因其更短的檢測(cè)時(shí)間和更簡(jiǎn)單的樣品前處理而顯示出更大的應(yīng)用價(jià)值和 應(yīng)用前景。但目前世界上還沒有針對(duì)黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條問世。因此，研究建立 一種針對(duì)黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條對(duì)于監(jiān)控黃曲霉毒素Ml的含量具有很重要的意義 和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條及其制備 方法。該試紙條用于檢測(cè)黃曲霉毒素M1，具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的特點(diǎn)。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為
黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條(見圖1和圖2)，包括紙板，紙板的一面從上到下依次粘 貼吸水墊、檢測(cè)墊、金標(biāo)墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，所述檢測(cè)墊以硝酸纖維 素膜為基墊，硝酸纖維素膜上自上而下設(shè)置橫向質(zhì)控線和檢測(cè)線，所述檢測(cè)線包被有黃曲 霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶聯(lián)物(AFMl-BSA)，質(zhì)控線包被有兔抗鼠多克隆抗體；所述金標(biāo) 墊橫向噴涂有納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，所述抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗 體由保藏號(hào)為CCTCC NO. C201018的雜交瘤細(xì)胞株2C9產(chǎn)生。
所述的雜交瘤細(xì)胞株2C9已于2010年7月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址是，中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO. C201018。其具有序列 表中SEQ Gene No. 1所示的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體重鏈可變區(qū)編碼基因序列和序列 表中SEQ Gene No. 2所示的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體輕鏈可變區(qū)編碼基因序列。抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，它由保藏編號(hào)為CCTCC NO. C201018的雜交瘤細(xì)胞 株2C9分泌產(chǎn)生。其重鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ Protein No. 1所示的氨基酸序列；輕鏈 可變區(qū)具有序列表中SEQ Protein No. 2所示的氨基酸序列。該抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗 體可以識(shí)別黃曲霉毒素Ml，對(duì)黃曲霉毒素Ml的50%抑制濃度IC5tl為67 pg/mL。本發(fā)明采用的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的制備方法，步驟如下
(1)采用兩步篩選法獲得雜交瘤細(xì)胞株2C9將BALB/c小鼠經(jīng)黃曲霉毒素完全抗原 AFMl-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫劑量的黃曲霉毒素完全抗原AFMl-BSA作最 后一次加強(qiáng)免疫，3天后進(jìn)行細(xì)胞融合，采用ELISA方法分兩步進(jìn)行篩選融合細(xì)胞第一步 采用間接ELISA法篩選出抗黃曲霉毒素而不抗載體蛋白BSA的陽性孔；第二步采用間接競(jìng) 爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽性孔培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，用黃曲霉毒素Ml作為競(jìng)爭(zhēng)原，選擇 吸光值和靈敏度均較高的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，克隆后10天左右采用同樣的兩步 篩選法進(jìn)行檢測(cè)，如此重復(fù)克隆2-3次后，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株2C9 ；
(2)將獲得的雜交瘤細(xì)胞株2C9注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠，收 集該小鼠的腹水，純化即得抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體。按上述方案，所述的吸水墊長16 18_，寬2 4mm ；檢測(cè)墊長25 30_，寬2 4mm ；金標(biāo)墊長6 9mm，寬2 4mm ；樣品墊長12 18mm，寬2 4mm，相鄰各墊的交疊長度 為1 3mm。按上述方案，所述的吸水墊為吸水紙。按上述方案，所述檢測(cè)墊上的檢測(cè)線與硝酸纖維素膜上沿的間距為15 20mm，質(zhì) 控線和檢測(cè)線的間距為5 10mm。按上述方案，所述檢測(cè)墊上每厘米檢測(cè)線所需的黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶 聯(lián)物(AFMl-BSA)的包被量為75 375ng ；每厘米質(zhì)控線所需的兔抗鼠多克隆抗體的包被 量為50 500ng。
按上述方案，所述金標(biāo)墊中所用的納米金的粒徑為15 20nm ；所述金標(biāo)墊上每厘 米噴涂長度所需的納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的用量為200 600ng。如上所述的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟
(1)吸水墊的制備
將吸水紙剪裁即得吸水墊；
(2)檢測(cè)墊的制備 檢測(cè)線的包被
將黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物(AFMl-BSA)配制成0. 1 0. 5mg/mL的包 被液A ；于距離硝酸纖維素膜上沿為15 20mm的位置，用點(diǎn)噴方式將包被液A橫向包被于 硝酸纖維素膜上得到檢測(cè)線，每厘米檢測(cè)線上所需黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物 (AFMl-BSA)的包被量為75 375ng，然后于37 40°C條件下干燥5 20分鐘； 質(zhì)控線的包被將兔抗鼠多克隆抗體配制成0. 1 0. 5mg/mL的包被液B ；于距檢測(cè)線5 IOmm的位 置，用點(diǎn)噴方式將包被液B橫向包被于硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線，每厘米質(zhì)控線上所需 兔抗鼠多克隆抗體的包被量為50 500ng，然后于37 40°C條件下干燥5 20分鐘；
(3)樣品墊的制備
將玻璃纖維膜放入封閉液A中浸濕，取出，于37 40°C條件下干燥4 10小時(shí)，得樣 品墊，然后置干燥器中室溫保存；
(4)金標(biāo)墊的制備
將玻璃纖維膜放入封閉液B中浸濕，取出，于37 40°C條件下干燥4 10小時(shí)，于已 干燥的玻璃纖維膜上，用點(diǎn)噴方式將納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液橫向 進(jìn)行噴涂，每厘米噴涂長度所需納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體為200 600ng， 然后真空冷凍干燥2 6h，置干燥器中室溫保存；
所述的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體由保藏號(hào)為CCTCC NO. C201018的雜交瘤細(xì)胞株 2C9產(chǎn)生；
(5)試紙條的組裝
在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測(cè)墊、金標(biāo)墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處 交疊連接，交疊長度為1 3mm，即得黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條。按上述方案，所述的包被液A是按照下述方法配制得到的將10 50mg市售黃 曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶聯(lián)物(AFMl-BSA)，1 2g牛血清白蛋白，0. 02 0. 05g疊氮 化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至 IOOmL所得；
所述的包被液B是按照下述方法配制得到的將10 50mg兔抗鼠多克隆抗體，0. 02 0. 05g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀， 加水定容至IOOmL所得。按上述方案，所述的封閉液A是按照下述方法配置得到的將1 2g牛血清白蛋 白，2 5g蔗糖，0. 02 0. 05g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯 化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得；
所述的封閉液B是按照下述方法配制得到的將1 2g牛血清白蛋白，0. 1 0. 2mL曲 拉通X-100,0. 3 05g聚乙烯吡咯烷酮，2 5g蔗糖，0. 02 0. 05g疊氮化鈉，0. 8g氯化 鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得。按上述方案，所述納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液的標(biāo)記方法為 取50. OmL市售質(zhì)量濃度為0. 01%的納米金溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值為5. 5 ；在攪拌的狀態(tài)下 緩慢加入2. 5mL 0. lmg/mL的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體水溶液，繼續(xù)攪拌30min ；加入質(zhì) 量濃度為10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的終質(zhì)量濃度為1%，繼續(xù)攪拌30min; 于4°C放置2h后，1500r/min離心15min，取上清液，棄沉淀；將上清液12000r/min離心30 min，棄去上清液，加入50. OmL標(biāo)記洗滌保存液；再以12000r/min離心30 min，棄去上清液， 將沉淀用標(biāo)記洗滌保存液重懸，得到5. OmL濃縮物，置4°C冰箱備用，其中納米金標(biāo)記的抗 黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液的質(zhì)量濃度為0. 05mg/mL ；
所述的標(biāo)記洗滌保存液是按照下述方法配制得到的2. Og聚乙二醇20000,0. 2g疊氮 鈉，0. 1235克硼酸，純水定容至1000mL，0. 22Mm濾膜過濾所得。
如上所述的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的應(yīng)用，方法如下取ImL待測(cè)液態(tài)牛 乳及其制品，加入0. 25 0. 5mL水，混勻，得到樣品溶液，取100 μ L已稀釋好的樣品溶液做 為檢測(cè)液逐滴滴加到一黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的樣品墊，將其作為檢測(cè)試紙條，同 時(shí)取ImL不含黃曲霉毒素Ml的空白牛奶樣品，加0. 25 0. 5mL水，混勻，得到陰性對(duì)照溶 液，取IOOyL陰性對(duì)照溶液，逐滴滴加到另一黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的樣品墊，將 其作為對(duì)照試紙條，15分鐘后讀取結(jié)果；
檢測(cè)結(jié)果(1)陽性當(dāng)檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線顯示出紅色線條，而檢測(cè)線不顯色時(shí)，或 者質(zhì)控線顯示出紅色線條，而檢測(cè)線顏色比對(duì)照試紙條檢測(cè)線顏色淺時(shí)，判為陽性，表明待 測(cè)樣品中黃曲霉毒素Ml的含量高于或等于0. 5ng/mL ； (2)陰性當(dāng)檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線和 檢測(cè)線均顯示出紅色線條，并且檢測(cè)線顏色與對(duì)照試紙條檢測(cè)線顏色接近時(shí)，判為陰性結(jié) 果，表明待測(cè)樣品中黃曲霉毒素Ml的含量低于0. 5ng/mL ； (3)無效當(dāng)質(zhì)控線不顯色時(shí)，無 論檢測(cè)試紙條的檢測(cè)線顯示或不顯示紅色線條，該試紙條判為無效。該黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的工作原理當(dāng)待測(cè)樣品溶液加入到試紙條下 端的樣品墊上時(shí)，待測(cè)樣品溶液通過毛細(xì)作用沿試紙條向吸水墊方向移動(dòng)，當(dāng)其移動(dòng)至金 標(biāo)墊時(shí)，納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體被溶解。當(dāng)樣品中含有黃曲霉毒素Ml 時(shí)，游離的黃曲霉毒素Ml將和金標(biāo)墊上的納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體結(jié)合 并一同向上泳動(dòng)，其到達(dá)固定著抗原的檢測(cè)線時(shí)，抗原將和黃曲霉毒素Ml競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合納米金 標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體上有限的抗原結(jié)合位點(diǎn)，樣品中黃曲霉毒素Ml含量越 高，檢測(cè)線上的抗原能夠結(jié)合的納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體將越少，形成的 顯色帶顏色越淺。當(dāng)抗原所結(jié)合的納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體少于一定的 數(shù)量時(shí)，檢測(cè)線處將不會(huì)有紅色線條出現(xiàn)。無論樣品中是否含有黃曲霉毒素，未被檢測(cè)線上 的抗原截獲的納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體或納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml 單克隆抗體與黃曲霉毒素Ml的結(jié)合物將繼續(xù)移動(dòng)到質(zhì)控線并與質(zhì)控線上的第二抗體結(jié)合 并被富集顯色，所以樣品中不含黃曲霉毒素M1，即為陰性時(shí)為兩條紅色條帶，質(zhì)控線和檢測(cè) 線均為紅色；含有一定量黃曲霉毒素M1，即為陽性時(shí)有兩種情況1、只出現(xiàn)一條紅色質(zhì)控 線，檢測(cè)線不顯色；2、一條紅色質(zhì)控線和一條淺紅色檢測(cè)線；而質(zhì)控線沒有色帶出現(xiàn)則表 明試紙條失效。本發(fā)明的有益效果在于
(1)檢測(cè)黃曲霉毒素Ml。本發(fā)明提供的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條使用的抗體為 抗黃曲霉毒素Ml特異性單克隆抗體，用于特異性快速檢測(cè)黃曲霉毒素Ml ；
(2)操作簡(jiǎn)單。用該黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)時(shí)只需將樣品溶液逐滴 加到試紙條的樣品墊上即可，為一步式操作，操作簡(jiǎn)單、方便；
(3)檢測(cè)過程不需要黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽性對(duì)照。本發(fā)明提供的黃曲霉毒 素Ml免疫層析試紙條檢測(cè)樣品時(shí)不需要使用黃曲霉毒素Ml標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽性對(duì)照，而只 需用空白樣品作為陰性對(duì)照即可；
(4)檢測(cè)靈敏度高。本發(fā)明提供的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條對(duì)樣品中黃曲霉毒 素Ml的最低檢測(cè)限為0. 5ng/mL。


圖1為本發(fā)明的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的正視圖。圖中1紙板、2吸水 墊；3檢測(cè)墊；4金標(biāo)墊；5樣品墊；6質(zhì)控線；7檢測(cè)線。圖2為本發(fā)明的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的側(cè)視結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1紙 板；2吸水墊；3檢測(cè)墊；4金標(biāo)墊；5樣品墊。圖3為實(shí)施例2的的結(jié)果判定圖。圖中 4檢測(cè)線。圖4為實(shí)施例3的的結(jié)果判定圖。圖中 4檢測(cè)線。圖5為實(shí)施例4的的結(jié)果判定圖。圖中 4檢測(cè)線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的制備方法
抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體由保藏號(hào)為CCTCC NO. C201018的雜交瘤細(xì)胞株2C9產(chǎn) 生，其制備方法，包括以下步驟
1.采用兩步篩選法獲得雜交瘤細(xì)胞株2C9 (1)動(dòng)物免疫
購買6周齡BALB/c小鼠6只，免疫市售的黃曲霉毒素完全抗原AFM1-BSA。第一次 免疫將黃曲霉毒素完全抗原與等量福氏完全佐劑乳化后，于小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射。第 二次免疫于4周后進(jìn)行，采用福氏不完全佐劑與等量黃曲霉毒素完全抗原乳化，于小鼠腹 腔注射。第三次免疫與第二次免疫間隔4周，免疫方式與其相同，第四次免疫于第三次免 疫3周后進(jìn)行，免疫方式與第二次免疫相同，同樣為腹腔注射。4次免疫劑量相同，均為每 鼠40 μ g/mL。前3次每次免疫后8天，尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測(cè)小鼠 血清效價(jià)。第4次免疫后8天，尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測(cè)小鼠血清效 價(jià)，并用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定小鼠血清靈敏度，選擇效價(jià)、靈敏度均相對(duì)較高的血清對(duì)應(yīng) 的小鼠進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為之前的2倍。黃曲霉毒素完全抗原AFMl-BSA購 于 Sigma-Aldrich 公司； 2)細(xì)胞融合
于最后一次加強(qiáng)免疫3天后，采用50%(重量百分?jǐn)?shù))的聚乙二醇即PEG(分子量為1450) 作融合劑，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟無菌條件下殺死免疫小鼠，分離脾細(xì)胞，與 鼠源骨髓瘤細(xì)胞SP2/0以5 : 1的個(gè)數(shù)比混合，用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗混合細(xì)胞，用 50%PEG融合，融合1分鐘，然后加滿RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心，移去上清，小鼠脾細(xì)胞和 鼠源骨髓瘤細(xì)胞SP2/0形成的融合細(xì)胞用7aiiLRPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，將重懸起來的 細(xì)胞滴加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，2滴/孔，置37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，所述的RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含有20% (體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清，2% (重量百分?jǐn)?shù))生長因子和1% (重量百 分?jǐn)?shù))次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即HAT。上述SP2/0購于上海泛柯生物科技有 限公司；RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液購于Hyclone公司；1%次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷 即 HAT 購于 Sigma-Aldrich 公司；1對(duì)照試紙條；2檢測(cè)試紙條；3質(zhì)控線； 1對(duì)照試紙條；2檢測(cè)試紙條；3質(zhì)控線； 1對(duì)照試紙條；2檢測(cè)試紙條；3質(zhì)控線；3)細(xì)胞株的篩選及克隆
待細(xì)胞融合后第12天左右，細(xì)胞集落長到占孔底1/2大小，培養(yǎng)液變黃，即可進(jìn)行抗體 檢測(cè)。采用ELISA方法對(duì)有雜交瘤細(xì)胞生長的培養(yǎng)孔進(jìn)行篩選，篩選分兩步進(jìn)行，第一步采 用間接ELISA法篩選出抗黃曲霉毒素Ml而不抗載體蛋白BSA的陽性孔；第二步采用間接競(jìng) 爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽性孔進(jìn)行檢測(cè)，用黃曲霉毒素Ml作為競(jìng)爭(zhēng)原，選擇吸光值 和靈敏度均較高的孔(吸光值較高指競(jìng)爭(zhēng)原為0的孔即陽性對(duì)照孔的最終測(cè)定值較高，靈敏 度較高指抑制率為50%時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)原濃度亦即IC5tl值較小)，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，克隆后 10天左右采用同樣的兩步法進(jìn)行檢測(cè)，如此重復(fù)克隆2-3次后，獲得雜交瘤細(xì)胞株2C9。采用如下方法測(cè)定雜交瘤細(xì)胞株2C9抗體可變區(qū)序列
(1)測(cè)定提取總RNA采用天根公司的總RNA提取試劑盒并按照說明書提取可產(chǎn)生雜交 瘤細(xì)胞株2C9的總RNA ；
(2)合成cDNA:以步驟1獲得的總RNA為模板，oligo(dT) 15為引物，按照 SuperScript -2 II反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈；引物oligo (dT) 15由 Invitrogen 購得；
(3)PCR法克隆可變區(qū)基因根據(jù)GENEBANK中小鼠抗體基因序列的保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物， 以cDNA為模版擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。PCR程序?yàn)?4°C 30s,55°C lmin、72°C Imin ，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(重量百分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠 電泳分離后，用試劑盒純化回收DNA片段，連接到載體pMDIS-T中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感 受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。其中引物的序列分別 為重鏈可變區(qū)引物為 5’-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CffG G_3’(22mer)和 5’_TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’(32mer)其中 S、M、R 和 W 為兼并堿基，M=A/C，R=A/G， S=C/G, W=A/T，輕鏈可變區(qū)引物為 5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC -3'(24mer) 和 5'-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3'(24mer)；
得到的基因序列結(jié)果重鏈可變區(qū)編碼基因序列長354bp，序列如SEQ ID NO: 1所示， 根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的重鏈可變區(qū)由117個(gè)氨基酸組成，序列 如SEQ ID N0:3所示。輕鏈可變區(qū)編碼基因序列長332bp，序列如SEQ ID N0:2所示，根據(jù)所 獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的輕鏈可變區(qū)由110個(gè)氨基酸組成，序列如SEQ ID N0:4 所示。2.抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的純化
將步驟1獲得的雜交瘤細(xì)胞株2C9注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過的BALB/c小鼠， 收集該小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，具體操作為用雙層濾紙過濾小鼠腹 水，4°C，12000r/min離心15min，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混 合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為33 μ L，室溫混合30min，4°C 靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過濾后，加 入1/10濾液體積的摩爾濃度為0. lmol/L和pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，用2 mol/L的 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的PH值至7. 4,4 °C預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為 0. 277g/mL，4°C靜置濁，然后4°C，12000r/min離心30min，棄上清，將所得沉淀用原腹水體 積1/10的0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，對(duì)純水透析，將充分透析好的蛋白溶 液置-70°C冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機(jī)凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，將抗體置-20°C冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為0. 29g醋酸鈉，0. 141mL醋酸加水定容至IOOmL所得；所述的 0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液為0. Sg氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，磷酸二 氫鉀0. 02g加水定容至IOOmL所得。用市售亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細(xì)胞株2C9分泌的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗 體的亞型為IgGh。用常規(guī)非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測(cè)得2C9的鼠腹水抗體的 效價(jià)可達(dá)4. 26 X IO6,即鼠腹水抗體稀釋4. 26 X IO6倍時(shí)的溶液測(cè)定結(jié)果為陽性。用常規(guī)間 接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法鑒定其對(duì)黃曲霉毒素Ml的靈敏度為67 pg/mL，與黃曲霉毒素Bi，B2, Gl, G2交叉反應(yīng)率均小于0. 1%。實(shí)施例2-4 黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的制備及應(yīng)用
下述實(shí)施例2-4使用的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體為實(shí)施例1制備得到的抗黃曲霉 毒素Ml單克隆抗體。實(shí)施例2
黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟 (1)吸水墊的制備
將吸水紙剪裁成長16mm寬3mm的規(guī)格，即得吸水墊； (2檢測(cè)墊的制備 檢測(cè)線的包被
將黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物AFMl-BSA配制成0. lmg/mL的包被液A ；于 距硝酸纖維素膜上沿15mm的位置，用點(diǎn)噴方式將包被液A橫向包被于硝酸纖維素膜上，得 到檢測(cè)線，每厘米檢測(cè)線所需黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物的包被量為75ng，然 后于37°C條件下干燥15分鐘；
所述的包被液A為10mg市售黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶聯(lián)物AFM1-BSA，Ig牛血 清白蛋白，0. 02g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷 酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得； 質(zhì)控線的包被
將兔抗鼠多克隆抗體配成0. 2mg/mL的包被液B ；于距檢測(cè)線5mm的位置，用點(diǎn)噴方式 將包被液B橫向包被于硝酸纖維素膜上，得質(zhì)控線，每厘米質(zhì)控線所需的兔抗鼠多克隆抗 體的包被量為lOOng，然后于37°C條件下干燥15分鐘；
所述的包被液B為將20mg兔抗鼠多克隆抗體，0.02g疊氮化鈉，0.8g氯化鈉，0. 29g 十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得； 所述的硝酸纖維素膜長25mm，寬3mm ；
(3)樣品墊的制備
將玻璃纖維膜剪裁成長13mm寬3mm的規(guī)格，放入封閉液A中浸濕，取出，于37°C條件下 干燥6小時(shí)，得樣品墊，然后置干燥器中室溫保存；
所述的封閉液A為Ig牛血清白蛋白，2g蔗糖，0. 02g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二 水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得；
(4)金標(biāo)墊的制備
將玻璃纖維膜剪裁成長9mm寬3mm的規(guī)格，放入封閉液B中浸濕，取出，于37°C條件下干燥16小時(shí)，于干燥好的玻璃纖維膜上，用點(diǎn)噴方式將納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克 隆抗體溶液橫向噴涂，每厘米噴涂長度所需納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體為 600ng，然后真空冷凍干燥6h，置干燥器中室溫保存；
所述的封閉液B為Ig牛血清白蛋白，0. ImL曲拉通X-100，0. 3g聚乙烯吡咯烷酮，2g蔗 糖，0. 02g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫 鉀，加水定容至IOOmL所得；
所述的納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液的具體標(biāo)記方法為量取 50. OmL質(zhì)量濃度為0. 01%的納米金溶液，用0. 1 mol/L碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為 5. 5 ；在攪拌的狀態(tài)下緩慢加入2. 5mL 0. lmg/mL的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體水溶液，繼 續(xù)攪拌30min ；加入質(zhì)量濃度為10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的終質(zhì)量濃度為 1%，繼續(xù)攪拌30min ；于4°C放置2h后，1500r/min離心15min，取上清液，棄沉淀；將上清液 12000r/min離心30 min，棄去上清液，加入50. OmL標(biāo)記洗滌保存液；再以12000r/min離心 30 min,棄去上清液，將沉淀用標(biāo)記洗滌保存液重懸，得到5. OmL濃縮物，置4°C冰箱備用， 其中納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液的質(zhì)量濃度為0. 05mg/mL ； 所述納米金溶液中納米金的粒徑為15nm ；
所述的0. 1 mol/L碳酸鉀水溶液為13. 8g碳酸鉀溶于純水定容至1000mL，0. 22Mm濾 膜過濾所得；所述的0. lmg/mL抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體水溶液為Img抗黃曲霉毒素Ml 單克隆抗體溶解在10 mL純水中制成；所述的10%牛血清白蛋白水溶液為IOg牛血清白 蛋白溶解在IOOmL純水中，0. 22ΜΠ1濾膜過濾所得；所述的標(biāo)記洗滌保存液為2. Og聚乙二 醇-20000,0. 2g疊氮鈉，0. 1235克硼酸，純水定容至1000mL，0. 22Mm濾膜過濾所得；
(5)試紙條的組裝在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測(cè)墊、金標(biāo)墊和樣品 墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，交疊長度為1mm，即得黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條，見 圖1和圖2。上述黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的應(yīng)用
吸取1#和2#待測(cè)牛奶樣品各lmL，加入0. 25mL水，混勻，得到樣品溶液，取100 μ L已 稀釋好的樣品溶液分別做為檢測(cè)液逐滴加入一黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的樣品墊， 將其作為檢測(cè)試紙條；同時(shí)取ImL不含黃曲霉毒素Ml的空白牛奶樣品，加入0. 25mL水，混 勻，得到陰性對(duì)照溶液，取100 μ L陰性對(duì)照溶液，逐滴加到另一黃曲霉毒素Ml免疫層析試 紙條的樣品墊，將其作為對(duì)照試紙條，15分鐘后讀取結(jié)果；
檢測(cè)結(jié)果1#檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線顯示出紅色線條，而檢測(cè)線不顯色，則判為陽性結(jié) 果，表明待測(cè)樣品中的黃曲霉毒素Ml的含量高于0. 5ng/mL，見圖3-1 ；2#檢測(cè)試紙條的質(zhì) 控線顯示出紅色線條，而檢測(cè)線顏色比對(duì)照試紙條檢測(cè)線顏色淺，則判為陽性結(jié)果，表明待 測(cè)樣品中的黃曲霉毒素Ml的含量高于或等于0. 5ng/mL,見圖3_2。實(shí)施例3
黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟
(1)吸水墊的制備
將吸水紙剪裁成長18mm寬4mm的規(guī)格，即得吸水墊；
(2)檢測(cè)墊的制備 檢測(cè)線的包被將黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物AFMl-BSA配制成0. 2mg/mL的包被液A ；于 距硝酸纖維素膜上沿18mm的位置，用點(diǎn)噴方式將包被液A橫向包被于硝酸纖維素膜上，得 到檢測(cè)線，每厘米檢測(cè)線所需的黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物的包被量為150ng， 然后于38°C條件下干燥10分鐘；
所述的包被液A為20mg市售黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶聯(lián)物AFMl-BSA，1.5g牛 血清白蛋白，0. 02g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g 磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得； 質(zhì)控線的包被
將兔抗鼠多克隆抗體配成0. 2mg/mL的包被液B ；于距檢測(cè)線8mm的位置，用點(diǎn)噴方式 將包被液B橫向包被于硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線，每厘米質(zhì)控線所需的兔抗鼠多克隆 抗體的包被量為200ng，然后于38°C條件下干燥10分鐘；
所述的包被液B為將20mg兔抗鼠多克隆抗體，0.02g疊氮化鈉，0.8g氯化鈉，0. 29g 十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得； 所述的硝酸纖維素膜長^mm,寬4mm ；
(3)樣品墊的制備
將玻璃纖維膜剪裁成長15mm寬4mm的規(guī)格，放入封閉液A中浸濕，取出，于38°C條件下 干燥5小時(shí)，得樣品墊，然后置干燥器中室溫保存；
所述的封閉液A為1. 5g牛血清白蛋白，2. 5g蔗糖，0. 02g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g 十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得；
(4)金標(biāo)墊的制備將玻璃纖維膜剪裁成長8mm寬4mm的規(guī)格，放入封閉液B中浸濕， 取出，于38°C條件下干燥5小時(shí)，于已干燥的玻璃纖維膜上，用點(diǎn)噴方式將納米金標(biāo)記的抗 黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液橫向噴涂，每厘米噴涂長度所需納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒 素Ml單克隆抗體為450ng，然后真空冷凍干燥4h，置干燥器中室溫保存；
所述的封閉液B為1.5g牛血清白蛋白，0. ImL曲拉通X-100，0.4g聚乙烯吡咯烷酮， 2. 5g蔗糖，0. 02g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷 酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得；
所述納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液的具體標(biāo)記方法為量取50. OmL 質(zhì)量濃度為0. 01%的納米金溶液，用0. 1 mol/L碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為5. 5 ；在攪 拌的狀態(tài)下緩慢加入2. 5mL 0. lmg/mL的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體水溶液，繼續(xù)攪拌 30min ；加入質(zhì)量濃度為10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的終質(zhì)量濃度為1%，繼續(xù) 攪拌30min ；于4°C放置2h后，1500r/min離心15min，取上清液，棄沉淀；將上清液12000r/ min離心30 min，棄去上清液，加入50. OmL標(biāo)記洗滌保存液；再以12000r/min離心30 min， 棄去上清液，將沉淀用標(biāo)記洗滌保存液重懸，得到5. OmL濃縮物，置4°C冰箱備用，其中納米 金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液的質(zhì)量濃度為0. 05mg/mL ； 所述納米金溶液中納米金的粒徑為17nm ；
所述的0. 1 mol/L碳酸鉀溶液為13. 8g碳酸鉀溶于純水定容至1000mL，0. 22Mm濾膜 過濾所得；所述的0. lmg/mL抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液為Img抗黃曲霉毒素Ml單克 隆抗體溶解在10 mL純水中制成；所述的10%牛血清白蛋白溶液為IOg牛血清白蛋白溶解 在IOOmL純水中，0. 22ΜΠ1濾膜過濾所得；所述的標(biāo)記洗滌保存液為2. Og聚乙二醇-20000，0. 2g疊氮鈉，0. 1235克硼酸，純水定容至1000mL，0. 22Mm濾膜過濾所得；
(5)試紙條的組裝在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測(cè)墊、金標(biāo)墊和樣品 墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，交疊長度為2mm，即得黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條，見 圖1和圖2。如上所述的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的應(yīng)用
吸取待測(cè)牛奶樣品lmL，加入0. 3mL水，混勻，得到樣品溶液，取100μ L稀釋好的樣品溶 液做為檢測(cè)液逐滴加入一黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的樣品墊，將其作為檢測(cè)試紙條， 同時(shí)取ImL空白牛奶樣品，加入0. 3mL水，混勻，得到陰性對(duì)照溶液，取100 μ L陰性對(duì)照溶 液，逐滴加入另一黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的樣品墊，將其作為對(duì)照試紙條，15分鐘 后讀取結(jié)果；
檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線和檢測(cè)線均顯示出紅色線條，并且檢測(cè)線顏色與對(duì) 照試紙條檢測(cè)線顏色接近，判為陰性結(jié)果，表明待測(cè)樣品中的黃曲霉毒素Ml的含量低于 0. 5ng/mL，見圖 4。實(shí)施例4
黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟
(1)吸水墊的制備
將吸水紙剪裁成長17mm寬2mm的規(guī)格，即得吸水墊；
(2)檢測(cè)墊的制備 檢測(cè)線的包被
將黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物AFMl-BSA配制成0. 5mg/mL的包被液A ；于 距硝酸纖維素膜上沿20mm的位置，用點(diǎn)噴方式將包被液A橫向包被于硝酸纖維素膜上，得 到檢測(cè)線，每厘米檢測(cè)線所需的黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的包被量為375ng，然 后于39°C條件下干燥8分鐘；
所述的包被液A為50mg市售黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶聯(lián)物AFM1-BSA，2g牛血 清白蛋白，0. 04g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷 酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得； 質(zhì)控線的包被
將兔抗鼠多克隆抗體配成0. 5mg/mL的包被液B ；于距檢測(cè)線IOmm的位置，用點(diǎn)噴方式 將包被液B橫向包被于硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線，每厘米質(zhì)控線所需的兔抗鼠多克隆 抗體的包被量為500ng，然后于39°C條件下干燥8分鐘；
所述的包被液B為將50mg兔抗鼠多克隆抗體，0. 04g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g 十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得； 所述的硝酸纖維素膜長30mm，寬2mm ；
(3)樣品墊的制備
將玻璃纖維膜剪裁成長17mm寬2mm的規(guī)格，放入封閉液A中浸濕，取出，于39°C條件下 干燥10小時(shí)，得樣品墊，然后置干燥器中室溫保存；
所述的封閉液A為2g牛血清白蛋白，5g蔗糖，0. 04g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0.29g十二 水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得；
(4)金標(biāo)墊的制備將玻璃纖維膜剪裁成長6mm寬2mm的規(guī)格，放入封閉液B中浸濕，取出，于39°C條件下 干燥10小時(shí)，于已干燥的玻璃纖維膜上，用點(diǎn)噴方式將納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克 隆抗體溶液橫向噴涂，每厘米噴涂長度所需納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體為 200ng，然后真空冷凍干燥池，置干燥器中室溫保存；
所述的封閉液B為2g牛血清白蛋白，0. 15mL曲拉通X_100，05g聚乙烯吡咯烷酮，5g 蔗糖，0. 04g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二 氫鉀，加水定容至IOOmL所得；
所述納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液的具體標(biāo)記方法為量取50. OmL 質(zhì)量濃度為0. 0. 1%的納米金溶液，用0. 1 mol/L碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為5. 5 ；在 攪拌的狀態(tài)下緩慢加入2. 5mL 0. lmg/mL的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體水溶液，繼續(xù)攪拌 30min ；加入質(zhì)量濃度為10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的終質(zhì)量濃度為1%，繼續(xù) 攪拌30min ；于4°C放置2h后，1500r/min離心15min，取上清液，棄沉淀；將上清液12000r/ min離心30 min，棄去上清液，加入50. OmL標(biāo)記洗滌保存液；再以12000r/min離心30 min， 棄去上清液，將沉淀用標(biāo)記洗滌保存液重懸，得到5. OmL濃縮物，置4°C冰箱備用，其中納米 金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液的質(zhì)量濃度為0. 05mg/mL ； 所述納米金溶液中納米金的粒徑為20nm ；
所述的0. 1 mol/L碳酸鉀水溶液為13. 8g碳酸鉀溶于純水定容至1000mL，0. 22Mm濾 膜過濾所得；所述的0. lmg/mL抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體水溶液為Img抗黃曲霉毒素Ml 單克隆抗體溶解在10 mL純水中制成；所述的10%牛血清白蛋白水溶液為IOg牛血清白 蛋白溶解在IOOmL純水中，0. 22ΜΠ1濾膜過濾所得；所述的標(biāo)記洗滌保存液為2. Og聚乙二 醇-20000,0. 2g疊氮鈉，0. 1235克硼酸，純水定容至1000mL，0. 22Mm濾膜過濾所得；
(5)試紙條的組裝在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測(cè)墊、金標(biāo)墊和樣品 墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，交疊長度為3mm，即得黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條，見 圖1和圖2。 如上所述的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的應(yīng)用
吸取1#和2#待測(cè)牛奶樣品各lmL，加入0. 4mL水，混勻，得到樣品溶液，取100 μ L已稀 釋好的樣品溶液分別做為檢測(cè)液逐滴滴加到一黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的樣品墊， 將其作為檢測(cè)試紙條，同時(shí)取ImL空白牛奶樣品，加入0. 4mL水，混勻，得到陰性對(duì)照溶液， 取100 μ L陰性對(duì)照溶液，逐滴加入另一黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的樣品墊，將其作為 對(duì)照試紙條，15分鐘后讀取結(jié)果；
檢測(cè)結(jié)果1#檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線不顯色，檢測(cè)試紙條的檢測(cè)線顯示紅色線條，則判 為無效，見圖5-1 ；姊檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線不顯色，檢測(cè)試紙條的檢測(cè)線亦不顯示紅色線 條，則判為無效，見圖5-2。
權(quán)利要求
1.黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條，其特征在于包括紙板，紙板的一面從上到下依次 粘貼吸水墊、檢測(cè)墊、金標(biāo)墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，所述檢測(cè)墊以硝酸纖 維素膜為基墊，硝酸纖維素膜上自上而下設(shè)置橫向質(zhì)控線和檢測(cè)線，所述檢測(cè)線包被有黃 曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控線包被有兔抗鼠多克隆抗體；所述金標(biāo)墊橫向噴 涂有納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，所述抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體由保藏 號(hào)為CCTCC NO. C201018的雜交瘤細(xì)胞株2C9產(chǎn)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條，其特征在于所述的吸水墊 長16 18mm，寬2 4mm ；檢測(cè)墊長25 30mm，寬2 4mm ；金標(biāo)墊長6 9mm，寬2 4mm ； 樣品墊長12 18mm，寬2 4mm，相鄰各墊的交疊長度為1 3mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條，其特征在于所述檢測(cè)墊上 的檢測(cè)線與硝酸纖維素膜上沿的間距為15 20mm，質(zhì)控線和檢測(cè)線的間距為5 10mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條，其特征在于所述檢測(cè)墊上 每厘米檢測(cè)線所需的黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的包被量為75 375ng ；每厘米 質(zhì)控線所需的兔抗鼠多克隆抗體的包被量為50 500ng。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條，其特征在于所述金標(biāo)墊中 所用的納米金的粒徑為15 20nm ；所述金標(biāo)墊上每厘米噴涂長度所需的納米金標(biāo)記的抗 黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的用量為200 600ng。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的制備方法，其特征在 于包括以下步驟(1)吸水墊的制備將吸水紙剪裁即得吸水墊；(2)檢測(cè)墊的制備檢測(cè)線的包被將黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物配制成0. 1 0. 5mg/mL的包被液A ；于距離 硝酸纖維素膜上沿為15 20mm的位置，用點(diǎn)噴方式將包被液A橫向包被于硝酸纖維素膜 上得到檢測(cè)線，每厘米檢測(cè)線上所需黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物(AFMl-BSA)的 包被量為75 375ng，然后于37 40°C條件下干燥5 20分鐘；質(zhì)控線的包被將兔抗鼠多克隆抗體配制成0. 1 0. 5mg/mL的包被液B ；于距檢測(cè)線5 IOmm的位 置，用點(diǎn)噴方式將包被液B橫向包被于硝酸纖維素膜上，得到質(zhì)控線，每厘米質(zhì)控線上所需 兔抗鼠多克隆抗體的包被量為50 500ng，然后于37 40°C條件下干燥5 20分鐘；(3)樣品墊的制備將玻璃纖維膜放入封閉液A中浸濕，取出，于37 40°C條件下干燥4 10小時(shí)，得樣 品墊，然后置干燥器中室溫保存；(4)金標(biāo)墊的制備將玻璃纖維膜放入封閉液B中浸濕，取出，于37 40°C條件下干燥4 10小時(shí)，于已 干燥的玻璃纖維膜上，用點(diǎn)噴方式將納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液橫向 進(jìn)行噴涂，每厘米噴涂長度所需納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體為200 600ng， 然后真空冷凍干燥2 6h，置干燥器中室溫保存；所述的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體由保藏號(hào)為CCTCC NO. C201018的雜交瘤細(xì)胞株 2C9產(chǎn)生；(5)試紙條的組裝在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測(cè)墊、金標(biāo)墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處 交疊連接，交疊長度為1 3mm，即得黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于所 述的包被液A是按照下述方法配制得到的將10 50mg市售黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋 白偶聯(lián)物(AFMl-BSA)，1 2g牛血清白蛋白，0. 02 0. 05g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g 十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得；所述的包被液B是按照下述方法配制得到的將10 50mg兔抗鼠多克隆抗體，0. 02 0. 05g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀， 加水定容至IOOmL所得。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于所 述的封閉液A是按照下述方法配置得到的將1 2g牛血清白蛋白，2 5g蔗糖，0. 02 0. 05g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀， 加水定容至IOOmL所得；所述的封閉液B是按照下述方法配制得到的將1 2g牛血清白蛋白，0. 1 0. 2mL曲 拉通X-100,0. 3 05g聚乙烯吡咯烷酮，2 5g蔗糖，0. 02 0. 05g疊氮化鈉，0. 8g氯化 鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于所 述納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液的標(biāo)記方法為取50. OmL市售質(zhì)量濃度 為0. 01%的納米金溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值為5. 5 ；在攪拌的狀態(tài)下緩慢加入2. 5mL 0. lmg/mL 的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體水溶液，繼續(xù)攪拌30min ；加入質(zhì)量濃度為10%牛血清白蛋 白水溶液至牛血清白蛋白的終質(zhì)量濃度為1%，繼續(xù)攪拌30min ；于4°C放置池后，1500r/ min離心15min，取上清液，棄沉淀；將上清液12000r/min離心30 min,棄去上清液，加入 50. OmL標(biāo)記洗滌保存液；再以12000r/min離心30 min,棄去上清液，將沉淀用標(biāo)記洗滌保 存液重懸，得到5. OmL濃縮物，置4°C冰箱備用，其中納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆 抗體溶液的質(zhì)量濃度為0. 05mg/mL ；所述的標(biāo)記洗滌保存液是按照下述方法配制得到的2. Og聚乙二醇20000,0. 2g疊氮 鈉，0. 1235克硼酸，純水定容至1000mL，0. 22Mm濾膜過濾所得。
10.一種權(quán)利要求1或2所述的黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的應(yīng)用，其特征在于取 ImL待測(cè)液態(tài)牛乳及其制品，加入0. 25 0. 5mL水，混勻，得到樣品溶液，取100 μ L已稀釋 好的樣品溶液做為檢測(cè)液逐滴滴加到一黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的樣品墊，將其作 為檢測(cè)試紙條，同時(shí)取ImL不含黃曲霉毒素Ml的空白牛奶樣品，加0. 25 0. 5mL水，混勻， 得到陰性對(duì)照溶液，取100 μ L陰性對(duì)照溶液，逐滴滴加到另一黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙 條的樣品墊，將其作為對(duì)照試紙條，15分鐘后讀取結(jié)果；檢測(cè)結(jié)果(1)陽性當(dāng)檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線顯示出紅色線條，而檢測(cè)線不顯色時(shí)，或 者質(zhì)控線顯示出紅色線條，而檢測(cè)線顏色比對(duì)照試紙條檢測(cè)線顏色淺時(shí)，判為陽性，表明待 測(cè)樣品中黃曲霉毒素Ml的含量高于或等于0. 5ng/mL ； (2)陰性當(dāng)檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線和檢測(cè)線均顯示出紅色線條，并且檢測(cè)線顏色與對(duì)照試紙條檢測(cè)線顏色接近時(shí)，判為陰性結(jié) 果，表明待測(cè)樣品中黃曲霉毒素Ml的含量低于0. 5ng/mL ； (3)無效當(dāng)質(zhì)控線不顯色時(shí)，無 論檢測(cè)試紙條的檢測(cè)線顯示或不顯示紅色線條，該試紙條判為無效。
全文摘要
本發(fā)明屬生物檢測(cè)領(lǐng)域。黃曲霉毒素M1免疫層析試紙條，其特征在于包括紙板，紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測(cè)墊、金標(biāo)墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，所述檢測(cè)墊以硝酸纖維素膜為基墊，硝酸纖維素膜上自上而下設(shè)置橫向質(zhì)控線和檢測(cè)線，所述檢測(cè)線包被有黃曲霉毒素M1-牛血清白蛋白偶聯(lián)物(AFM1-BSA)，質(zhì)控線包被有兔抗鼠多克隆抗體；所述金標(biāo)墊橫向噴涂有納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體，所述抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體由保藏號(hào)為CCTCCNO.C201018的雜交瘤細(xì)胞株2C9產(chǎn)生。該試紙條用于檢測(cè)黃曲霉毒素M1，具有檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/532GK102109518SQ20111006294
公開日2011年6月29日 申請(qǐng)日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者丁小霞, 姜俊, 張奇, 張文, 張道宏, 李培武, 管笛 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所