專利名稱：非衍生的、非代謝的維生素d的質(zhì)譜測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非代謝的維生素D的定量測(cè)量。在具體方面，本發(fā)明涉及通過串聯(lián)質(zhì)譜法定量測(cè)量非代謝的維生素D的方法。
背景技術(shù)：
維生素D是在鈣(Ca2+)穩(wěn)態(tài)的正調(diào)節(jié)中具有重要生理作用的必需營養(yǎng)素。維生素D可通過暴露于日光而在皮膚中從頭形成或它可從飲食吸收。存在兩種形式維生素D :維生素D2(麥角鈣化醇)和維生素D3(膽鈣化醇)。維生素D3是由動(dòng)物從頭合成的形式。它還是加入到在美國生產(chǎn)的乳制品和某些食品中的常見補(bǔ)充物。飲食和內(nèi)在合成的維生素D3必須經(jīng)歷代謝激活以產(chǎn)生生物活性的代謝物。在人類中，維生素D3激活的最初步驟主要發(fā)生在肝中并包括羥基化作用以形成中間體代謝物25-羥基膽鈣化醇(骨化二醇；250HD3)。 骨化二醇是循環(huán)中維生素D3的主要形式。然后循環(huán)的250HD3由腎轉(zhuǎn)化，形成1，25-二羥基維生素D3 (骨化三醇；1，25 (OH) 2D3)，其通常被認(rèn)為是具有最高生物活性的維生素D3的代謝物。維生素D2來自真菌和植物來源。許多非處方膳食補(bǔ)充物(dietary supplements)含有麥角鈣化醇(維生素％)而不是膽鈣化醇(維生素隊(duì))。麥角骨化醇(Drisdol)—在美國可獲得的唯一的維生素D的高效處方形式——是用麥角鈣化醇配制的。維生素D2在人類中經(jīng)歷與維生素D3相似的代謝激活途徑，形成代謝物250冊(cè)2和1，25 (OH)2D20維生素仏和維生素D3已長期被假定在人類中在生物學(xué)上相等，然而最近的報(bào)道提出這兩種形式的維生素D在生物活性和生物利用率上可存在差異(Armas et. al.，(2004) J. Clin. Endocrinol.Metab. 89:5387-5391)。維生素D—無活性維生素D先驅(qū)體一的測(cè)量在臨床情況中不常發(fā)生。相反，25-羥基維生素D3、25-羥基維生素D2和總25-羥基維生素D ( “250HD”)的血清水平是維生素D營養(yǎng)狀況和某些維生素D類似物的效力的有用指示物。250HD的測(cè)量通常用于鈣代謝病癥的診斷和處理。在這方面，低水平250HD指示與疾病如低鈣血癥、低磷血癥、繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥、升高的堿性磷酸酶、成人中骨軟化癥和兒童中佝僂病有關(guān)的維生素D缺乏。在疑似維生素D中毒的患者中，升高水平的250HD使該病癥區(qū)別于引起高鈣血癥的其它病癥。I, 25 (OH)2D的測(cè)量還用于臨床情況。某些疾病狀態(tài)可通過循環(huán)水平的1，25 (OH)2D反映，例如腎疾病和腎功能衰竭常常導(dǎo)致低水平的1，25 (OH) 2D。升高水平的1，25 (OH)2D可指示過量的甲狀旁腺素或可指示某些疾病如結(jié)節(jié)病或某些類型的淋巴瘤。維生素D代謝物的檢測(cè)已通過用對(duì)250HD2和250HD3共同特異的抗體的放射免疫測(cè)定完成。因?yàn)槟壳暗幕诿庖邔W(xué)的測(cè)定不分別分辨250HD2和250HD3，所以不求助于其它試驗(yàn)，維生素D的任何營養(yǎng)缺乏的來源不能被確定。已發(fā)表了公開利用質(zhì)譜法檢測(cè)特定維生素D代謝物的方法的報(bào)道。在一些報(bào)道中，維生素D代謝物在質(zhì)譜法之前被衍生，但是在其它的報(bào)道中，它們不是這樣。例如Holmquist，et al. 2007年12月28日提交的美國專利申請(qǐng)系列號(hào) 11/946765 ;Yeung B，et al. , J Chromatogr. 1993,645(1) :115-23 ；Higashi T, et al. , Steroids. 2000, 65(5) :281-94 ；Higashi T, et al., Biol PharmBull. 2001，24(7) :738-43 ；Higashi T, et al.，J Pharm Biomed Anal. 2002，29(5) :947-55 ；Higashi T, et al. , Anal. Biochanal Chem, 2008，391:229-38 ;和 Aronov, et al. , AnalBioanal Chem，2008，391:1917_30公開通過在質(zhì)譜法之前衍生代謝物而檢測(cè)各種維生素D代謝物的方法。檢測(cè)未衍生的維生素D代謝物的方法在Clarke, et al.，2005年4月6日提交的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)11/101，166和2006年3月21日提交的11/386,215中，和Singh，et al.，2004年10月24日提交的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)10/977，121中被報(bào)道。還已公開了報(bào)道，其公開用Cookson型試劑，特別是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)和4-[2-(6，7-二甲氧基-4-甲基_3_氧代-3，4-二氫喹喔啉基(dihydroquinoxalyl))乙基]_1，2，4_ 三唑啉 _3，5_ 二酮(DMEQ-TAD)進(jìn)行的維生素 D3 的衍生。參見 Aberhart, J, et al. , J. Org. Chem. 1976, 41 (12) : 2098-2102 和 Kamao, M, et al. , JChromatogr. B2007, 859:192-200。
發(fā)明概述本發(fā)明提供通過包括串聯(lián)質(zhì)譜法在內(nèi)的質(zhì)譜法檢測(cè)樣品中一種或多種(非代謝)形式的維生素D的量的方法。一方面，來自樣品的維生素D在通過質(zhì)譜法分析之前被衍生。第二方面，來自樣品的維生素D在通過質(zhì)譜法分析之前不被衍生。在第一方面的一些實(shí)施方式中，該方法包括以下步驟(i)使樣品中的Cookson型衍生的維生素D在適合產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的先驅(qū)離子的條件下經(jīng)歷電離源；(ii)破碎至少一種所述先驅(qū)離子以產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的碎片離子；(iii)通過質(zhì)譜法測(cè)定先驅(qū)離子和碎片離子中的一種或多種的量；和(iv)使在步驟(iii)中測(cè)定的離子的量與樣品中維生素D的量相關(guān)聯(lián)。在這些方法中，在步驟(i)之前將樣品在足以產(chǎn)生Cookson型衍生的維生素D的條件下經(jīng)歷Cookson型衍生試劑。在一些實(shí)施方式中，將Cookson型衍生的維生素D在電離之前經(jīng)歷萃取柱和分析柱。在相關(guān)實(shí)施方式中，分析柱可以是高效液相色譜(HPLC)柱。在第一方面的一些實(shí)施方式中，該方法包括以下步驟(i)使樣品經(jīng)歷湍流液相色譜(TFLC) ； (ii)使來自樣品的Cookson型衍生的維生素D在適合產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的離子的條件下經(jīng)歷電離源；(iii)通過質(zhì)譜法測(cè)定一種或多種Cookson型衍生的維生素D離子的量；和(iv)使在步驟(iii)中測(cè)定的Cookson型衍生的維生素D離子的量與樣品中維生素D的量相關(guān)聯(lián)。在這些方法中，在步驟(i)之前將樣品在樣品中足以產(chǎn)生Cookson型衍生的維生素D的條件下經(jīng)歷Cookson型衍生試劑。在一些實(shí)施方式中，在步驟(i)之后但步驟(ii)之前使樣品經(jīng)歷高效液相色譜法(HPLC)。在一些實(shí)施方式中，Cookson型衍生試劑是4-苯基-1,2，4-三唑啉-3，5-二酮(PTAD)。在這些實(shí)施方式中的一些實(shí)施方式中，一種或多種先驅(qū)離子包括一種或多種選自質(zhì)荷比(m/z)為572. 4±0. 5和560. 4±0. 5的離子。在這些實(shí)施方式中的一些實(shí)施方式中，一種或多種碎片離子包括質(zhì)荷比(m/z)為298. 1±0. 5的離子。在維生素D包括維生素D2的實(shí)施方式中，一種或多種Cookson型衍生的維生素D離子可包括質(zhì)荷比(m/z)為572. 3±0. 5的先驅(qū)離子和質(zhì)荷比(m/z)為298. 1±0. 5的碎片離子。在維生素D包括維生素D3的實(shí)施方式中，一種或多種Cookson型衍生的維生素D離子可包括質(zhì)荷比(m/z)為560. 3±0. 5的先驅(qū)離子和質(zhì)荷比(m/z)為298. 1±0. 5的碎片離子。在維生素D包括維生素仏和隊(duì)的實(shí)施方式中，一種或多種先驅(qū)離子可包括質(zhì)荷比(m/z)為572. 4±0. 5的維生素D2先驅(qū)離子和m/z為560. 4±0. 5的維生素D3先驅(qū)離子；一種或多種碎片離子可包括m/z為298. 1±0. 5的維生素D2碎片離子和m/z為298. 1±0. 5的
維生素D3碎片離子。在第二方面的一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供無需電離和檢測(cè)衍生的維生素D，通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定樣品中維生素D的量的方法。在一些實(shí)施方式中，維生素D包括維生素込；這些方法包括以下步驟使來自樣品的維生素D2在適合產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的選自質(zhì)荷比(m/z)為397. 2±0. 5或379. 2±0. 5的離子的先驅(qū)離子的條件下經(jīng)歷電離源；破碎至少一種所述先驅(qū)離子以產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的碎片離子；
(iii)通過質(zhì)譜法測(cè)定步驟(i)和(ii)中產(chǎn)生的一種或多種離子的量；和(iv)使步驟
(iii)中測(cè)定的維生素D2離子的存在與樣品中維生素D2的存在相關(guān)聯(lián)。在這些方法中，如 果破碎的先驅(qū)離子包括m/z為397. 2±0. 5的離子，那么碎片離子包括一種或多種選自m/z為159. 0±0. 5、146. 9±0. 5、133. 1±0.5和121.0±0.5的離子的離子。在這些方法中，如果破碎的先驅(qū)離子包括m/z為379. 2±0. 5的離子，那么碎片離子包括一種或多種選自m/z為283. 2±0. 5,187. 3±0. 5,175. 2±0. 5和159. 0±0. 5的離子的離子。在一些實(shí)施方式中，在電離之前可將來自樣品的維生素D2經(jīng)歷萃取柱，如固相萃取(SPE)柱或湍流液相色譜(THLC)柱。在一些實(shí)施方式中，在電離之前將來自樣品的維生素D2另外經(jīng)歷分析柱，如高效液相色譜(HPLC)柱。在第二方面的其它實(shí)施方式中，維生素D包括維生素D3 ;這些方法包括以下步驟(i)使來自樣品的維生素D3在適合產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的選自質(zhì)荷比(m/z)為385. 2±0. 5或367. 2±0. 5的離子的先驅(qū)離子的條件下經(jīng)歷電離源；(ii)破碎至少一種所述先驅(qū)離子以產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的碎片離子；(iii)通過質(zhì)譜法測(cè)定步驟(i)和(ii)中產(chǎn)生的一種或多種離子的量；和(iv)使步驟(iii)中測(cè)定的維生素D3離子的存在與樣品中維生素D3的存在相關(guān)聯(lián)。在這些方法中，如果破碎的先驅(qū)離子包括m/z為385. 2±0. 5的離子，那么碎片離子包括一種或多種選自m/z為159. 0±0. 5、147. 0±0. 5、133. 1±0. 5和107. 1±0. 5的尚子的尚子。如果破碎的先驅(qū)尚子包括m/z為367. 2±0. 5的離子，那么碎片離子包括一種或多種選自m/z為172. 2±0. 5、145. 0±0. 5和119. 1±0. 5的離子。在一些實(shí)施方式中，在電離之前可將來自樣品的維生素D3經(jīng)歷萃取柱，如固相萃取(SPE)柱或湍流液相色譜(THLC)柱。在一些實(shí)施方式中，在電離之前將來自樣品的維生素D3另外經(jīng)歷分析柱，如高效液相色譜(HPLC)柱。在本文描述的方法中，質(zhì)譜法可以是串聯(lián)質(zhì)譜法。在利用串聯(lián)質(zhì)譜法的實(shí)施方式中，串聯(lián)質(zhì)譜法可通過本領(lǐng)域已知的任何方法——包括例如，多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)、先驅(qū)離子掃描或產(chǎn)物離子掃描——來進(jìn)行。在利用萃取柱的實(shí)施方式中，萃取柱可以是固相萃取(SPE)柱；如湍流液相色譜(TFLC)柱。在一些實(shí)施方式中，其利用萃取柱、分析柱和電離源中的兩個(gè)或多個(gè)，利用的組分可以以聯(lián)機(jī)方式連接以允許自動(dòng)化的樣品處理和分析。用于某些實(shí)施方式的Cookson型衍生試劑可選自4-苯基-1，2，4_三唑啉_3，5_ 二酮(PTAD)、4_ 甲基-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(MTAD)、4_[2_(6，7- 二甲氧基-4-甲基-3-氧代_3，4- 二氫喹喔啉基)乙基]-1，2，4-三唑啉-3，5- 二酮(DMEQTAD) ,4-(4-硝基苯基)-I, 2，4-三唑啉-3，5- ニ酮(NPTAD)和4- ニ茂鐵基甲基_1，2，4-三唑啉-3，5- ニ酮(FMTAD)以及其同位素標(biāo)記的變體。在優(yōu)選實(shí)施方式中，Cookson型衍生試劑是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-ニ酮(PTAD)或其同位素標(biāo)記的變體。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，Cookson型衍生試劑是4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- ニ酮(PTAD)或其同位素標(biāo)記的變體。如本文所用，術(shù)語“維生素D”指任何ー種或多種天然存在的非代謝的維生素D或合成的非代謝的維生素D的類似物。這與通過代謝過程中發(fā)生的特定化學(xué)修飾而鑒定的維生素D代謝物(例如，25-羥基維生素D和I α，25- ニ羥基維生素D)相対。非代謝的維生素D還可被稱作“營養(yǎng)性”維生素D以區(qū)別于代謝的形式。提到?jīng)]有指定代謝形式的維生素D是指非代謝的形式。如本文所用，“衍生”指使兩個(gè)分子反應(yīng)以形成新的分子。因此，衍生劑是與另ー個(gè)物質(zhì)反應(yīng)以衍生物質(zhì)的劑。例如，4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5-ニ酮(PTAD)是可與維生素D反應(yīng)以形成PTAD-衍生的維生素D的衍生試劑。
如本文所用，衍生形式維生素D的名稱包括關(guān)于衍生的性質(zhì)的表示。例如，維生素D2的PTAD衍生物被表示為PTAD-維生素D2 (或PTAD-衍生的維生素D2)。如本文所用，“ Cookson型衍生劑”是4_取代的1，2，4_三唑啉_3，5_ ニ酮化合物。示例性的Cookson型衍生劑包括4-苯基-1，2，4-三唑啉-3，5- ニ酮(PTAD)、4_甲基-I, 2，4-三唑啉-3，5- ニ酮(MTAD)、4_[2_(6，7- ニ 甲氧基-4-甲基-3-氧代-3，4- ニ氫喹喔啉基)こ基]-1，2，4-三唑啉-3，5-ニ酮(DMEQTAD)、4_ (4-硝基苯基)-1，2，4-三唑啉-3，5- ニ酮(NPTAD)和4- ニ茂鐵基甲基-1，2，4-三唑啉-3，5- ニ酮(FMTAD)。另夕卜，在一些實(shí)施方式中可利用Cookson型衍生劑的同位素標(biāo)記的變體。例如，13C6-PTAD同位素變體比正常PTAD重6個(gè)質(zhì)量單位并可用于ー些實(shí)施方式。通過Cookson型試劑進(jìn)行的維生素D代謝物的衍生可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行。參見，例如，Holmquist, etal.，2007年12月28日提交的美國專利申請(qǐng)系列號(hào)11/946765 ；Yeung B, et al.，JChromatogr. 1993, 645(I):115-23 ；Higashi T, et al. , Steroids. 2000, 65(5):281-94 ；Higashi T, et al. , Biol Pharm Bull. 2001, 24(7) :738-43 ；Higashi T, et al. , JPharm Biomed Anal.2002,29 (5):947-55 ；Higashi T,et al., Anal.BiochanalChem,2008，391:229-38 ;和 Aronov, et al. , Anal Bioanal Chem, 2008,391:19 17-30。維生素D可指ー種或多種形式的維生素D，如維生素D2和/或維生素D3。在樣品包括多種維生素D形式的實(shí)施方式中，多種維生素D形式可被同時(shí)電離。例如，在一些實(shí)施方式中，在相同的樣品中測(cè)定維生素D2和維生素D3的量。在這些實(shí)施方式中，(衍生的或未衍生的)維生素D2和維生素D3可被同時(shí)電離。如用于同時(shí)檢測(cè)兩種或多種來自樣品的分析物的量，術(shù)語“同吋”指從相同的樣品注射中獲得反映樣品中兩種或多種分析物的量的數(shù)據(jù)。每個(gè)分析物的數(shù)據(jù)可依次或平行獲得，這取決于利用的儀器技木。例如，可將包含兩種分析物的單個(gè)樣品注射進(jìn)HPLC柱，然后HPLC柱可一個(gè)接ー個(gè)地洗脫每種分析物，導(dǎo)致依次將分析物引入質(zhì)譜儀。為了本文的目的同時(shí)測(cè)定這兩種分析物中每種的量，因?yàn)閮煞N分析物都由注射進(jìn)入HPLC的相同的樣品產(chǎn)生。維生素D可在動(dòng)物的循環(huán)中找到和/或可由生物體，如動(dòng)物產(chǎn)生。像這樣，樣品可，例如，從患者；即，男性或女性的活人獲得，在臨床環(huán)境中呈現(xiàn)自身用于疾病或狀況的診斷、預(yù)后或治療。優(yōu)選的樣品可以是生物樣品；特別是生物流體樣品如血清或血漿。當(dāng)樣品來自人類時(shí)，本文呈現(xiàn)的方法可用于測(cè)定存在于樣品中的維生素D的量。在本文公開的方法的某些優(yōu)選實(shí)施方式中，質(zhì)譜法以陽離子方式進(jìn)行?？蛇x地，質(zhì)譜法以陰離子方式進(jìn)行。各種電離源，包括例如大氣壓化學(xué)電離(APCI)、激光二極管熱解吸(LDTD)或電霧化電離(ESI)，可用于本發(fā)明的實(shí)施方式。在某些實(shí)施方式中，以陽離子方式利用APCI或LDTD測(cè)量維生素D代謝物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，樣品中提供了一種或多種單獨(dú)可檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)，還在樣品中測(cè)定了該內(nèi)標(biāo)的量。在這些實(shí)施方式中，將樣品中存在的所有或部分感興趣的分析物(ー種或多種)和內(nèi)標(biāo)(ー種或多種)離子化以產(chǎn)生多種在質(zhì)譜儀中可檢測(cè)的離子，并通過質(zhì)譜法檢測(cè)從每種產(chǎn)生的ー種或多種離子。優(yōu)選地，內(nèi)標(biāo)(ー種或多種)是維生素D2-[6，19，19]-2H3、維生素 D2-[26，26，26，27，27，27]-2H6、維生素 D3-[6，19，19]-2H3 和維生素D3-[26，26，26，27，27，27]-2H6 中的ー種或多種。
在用Cookson型衍生試劑(如果可適用)的處理或來自樣品的分析物(一種或多種)的任何純化之前，可在樣品中提供一種或多種單獨(dú)可檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)。在這些實(shí)施方式中，一種或多種內(nèi)標(biāo)可連同內(nèi)源性維生素D—起進(jìn)行衍生和/或純化，在該情況下，衍生的和/或純化的內(nèi)標(biāo)的離子通過質(zhì)譜法來檢測(cè)。在這些實(shí)施方式中，從感興趣的分析物產(chǎn)生的離子的存在或量可與樣品中感興趣分析物的存在或量相關(guān)。在一些實(shí)施方式中，內(nèi)標(biāo)可以是維生素D的同位素標(biāo)記的形式，如維生素D2-[6，19，19]-2H3、維生素 D2-[26，26，26，27，27，27]-2H6、維生素 D3-[6，19，19]-2H3 和維生素D3-[26，26，26，27，27，27]-2H60可針對(duì)上面列出的示例性內(nèi)標(biāo)中的每個(gè)產(chǎn)生質(zhì)譜儀中可檢測(cè)的離子。針對(duì)幾個(gè)示例性內(nèi)標(biāo)產(chǎn)生的示例性光譜在實(shí)施例8和9中描述，并顯示在圖6-7、9-10、12-13和15-16中。如本文所用，當(dāng)用質(zhì)譜技術(shù)分析時(shí)，相對(duì)于未標(biāo)記的分子，“同位素標(biāo)記”在標(biāo)記的分子中產(chǎn)生質(zhì)量漂移。適合的標(biāo)記的例子包括氘(2H)、13C和15N。例如，維生素D2-[6，19，19]-2H3和維生素D3-[6，19，19]-2 分別具有比維生素D2和維生素D3高約3個(gè)質(zhì)量単位的質(zhì)量。同位素標(biāo)記可在分子中的ー個(gè)或多個(gè)位置處摻入，并且ー種或多種同位素標(biāo)記可用于相同同位素標(biāo)記的分子上。在其它實(shí)施方式中，維生素D離子(ー種或多種)的量可通過與ー種或多種外參考標(biāo)準(zhǔn)比較而測(cè)定。示例性的外參考標(biāo)準(zhǔn)包括摻有維生素D2-[6，19，19]-2H3、維生素 D2-[26，26，26，27，27，27]-2H6、維生素 D3-[6，19，19]-2 和維生素D3-[26, 26，26，27，27，27]- 中的ー種或多種的空白血漿或血清。在衍生的維生素D被檢測(cè)的實(shí)施方式中，外標(biāo)通常將經(jīng)歷與將被分析的任何其它樣品相同的處理和分析，包括在質(zhì)譜法之前用ー種或多種Cookson型試劑的處理。在某些實(shí)施方式中，維生素D2和維生素D3的定量的下限(LLOQ)小于10ng/mL ;優(yōu)選小于5ng/mL ;優(yōu)選小于2ng/mL。如本文所用，除非另外說明，単數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”、“所述(the)”包括復(fù)數(shù)參考。因此，例如，提及“一蛋白(a protein)”包括多個(gè)蛋白分子。如本文所用，術(shù)語“純化(purification)”或“純化(purifying)”不是指從樣品中去除除了感興趣的分析物(ー種或多種)外的所有物質(zhì)。相反，純化指相對(duì)于樣品中可能干擾感興趣的分析物檢測(cè)的其它組分，富集一種或多種感興趣的分析物的量的過程。通過各種手段的樣品純化可允許ー種或多種干擾物質(zhì)一例如，可能或可能不干擾通過質(zhì)譜法的選擇的母離子或子離子檢測(cè)的ー種或多種物質(zhì)一的相對(duì)減少。當(dāng)該術(shù)語使用時(shí)，相對(duì)減少不要求將被純化的材料中與感興趣的分析物一起存在的任何物質(zhì)通過純化被完全去除。如本文所用，術(shù)語“固相萃取法”或“SPE”指由于溶解或懸浮于溶液(即，流動(dòng)相)中的組分對(duì)溶液通過或流經(jīng)的固體(即，固相)的親和カ而將化學(xué)混合物分成各組分的過程。在一些實(shí)例中，當(dāng)流動(dòng)相通過或流經(jīng)固相時(shí)，流動(dòng)相的不期望的組分可保留在固相中，導(dǎo)致流動(dòng)相中分析物的純化。在其它實(shí)例中，分析物可保留在固相中，允許流動(dòng)相的不期望的組分通過或流經(jīng)固相。在這些實(shí)例中，然后將第二流動(dòng)相用于將保留的分析物從固相洗脫下來用于進(jìn)一歩的處理或分析。SPE——包括TFLC——可通過單ー模式或混合模式機(jī)制運(yùn)行。混合模式機(jī)制在同一柱中利用離子交換和疏水保留；例如，混合模式SPE柱的固相可顯示強(qiáng)陰離子交換和疏水保留；或可顯示強(qiáng)陽離子交換和疏水保留。如本文所用，術(shù)語“色譜法”指由于流過固定的液相或固相時(shí)化學(xué)實(shí)體的差別分布 而將液體或氣體攜帯的化學(xué)混合物分成各組分的過程。如本文所用，術(shù)語“液相色譜”或“LC”指當(dāng)流體通過精細(xì)分開的物質(zhì)的柱或通過毛細(xì)管通道均勻地濾過時(shí)流體溶液的一種或多種組分的選擇性阻滯的過程。阻滯由當(dāng)流體相對(duì)于固定相(或多個(gè))運(yùn)動(dòng)時(shí)，ー個(gè)或多個(gè)固定相和大量流體(即，流動(dòng)相)之間的混合物的各組分分布產(chǎn)生?！耙合嗌V”的實(shí)例包括反相液相色譜法(RPLC)、高效液相色譜法(HPLC)和湍流液相色譜(TFLC)(有時(shí)被稱作高湍流液相色譜(HTLC)或高通量液相色譜)。如本文所用，術(shù)語“高效液相色譜法”或“HPLC” (有時(shí)被稱作“高壓液相色譜”)指這樣的液相色譜，其中通過在壓力下迫使流動(dòng)相通過固定相，通常是緊密填充的柱，而增加分離的程度。如本文所用，術(shù)語“湍流液相色譜”或“ TFLC”(有時(shí)被稱作高湍流液相色譜或高通量液相色譜)指ー種形式的色譜，其利用通過柱填充而正被測(cè)定的物質(zhì)的湍流作為進(jìn)行分離的基礎(chǔ)。在通過質(zhì)譜法分析之前，TFLC已應(yīng)用于制備包含兩種未命名的藥物的樣品。參見，例如，Zimmer et al. , J Chromatogr A 854:23-35(1999);還參見，美國專利號(hào)5，968，367,5, 919，368,5, 795，469 和 5，772，874，其進(jìn)ー步解釋 TFLC0 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解“湍流”。當(dāng)流體慢慢地并流暢地流動(dòng)時(shí)，該流動(dòng)被稱作“層流”。例如，以低流速通過HPLC柱的流體是層狀的。在層流中流體的顆粒運(yùn)動(dòng)是有秩序的，具有通常以直線運(yùn)動(dòng)的顆粒。在較快的速度，水的慣性克服流體摩擦カ并產(chǎn)生湍流。不與不規(guī)則邊界接觸的流體“超過”被摩擦減慢或被粗糙表面偏離的流體。當(dāng)流體以湍流流動(dòng)時(shí)，它以漩渦和渦動(dòng)(或旋渦)流動(dòng)，較流動(dòng)是層狀時(shí)具有更多的“阻力(drag)”?？色@得許多參考資料用于輔助確定什么時(shí)候流體流動(dòng)是層狀的或瑞流(例如，Turbulent Flow Analysis !Measurementand Prediction, P.S.Bernard & J. M. Wallace, John Wiley & Sons, Inc. , (2000);AnIntroduction to Turbulent Flow,Jean Mathieu & Julian Scott, Cambridge UniversityPress (2001))。如本文所用，術(shù)語“氣相色譜”或“GC”指這樣的色譜，其中將樣品混合物蒸發(fā)并注射進(jìn)通過包含固定相——由液體或顆粒固體組成——的柱運(yùn)動(dòng)的載氣(如氮?dú)饣蚝?流，并根據(jù)化合物對(duì)固定相的親合力分成其各組成化合物。如本文所用，術(shù)語“大顆粒柱”或“萃取柱”指包含大于約50 μ m的平均粒徑的色譜柱。如本文所用，術(shù)語“分析柱”指具有足夠色譜板以引起樣品中物質(zhì)分離的色譜柱，該物質(zhì)從柱洗脫足以允許測(cè)定分析物的存在或量。在優(yōu)選實(shí)施方式中，分析柱含有直徑約5μπι的顆粒。這樣的柱常常區(qū)別于“萃取柱”，萃取柱具有從非保留的物質(zhì)中分離或萃取保留的物質(zhì)的以獲得純化的樣品用于進(jìn)一歩分析的目的。如本文所用，術(shù)語“聯(lián)機(jī)(on-1 ine ) ”和“在線(ini ine ) ”，例如如“聯(lián)機(jī)自動(dòng)方式”或“聯(lián)機(jī)萃取”中所用，指不需要操作員干預(yù)而進(jìn)行的程序。相比之下，如本文所用，術(shù)語“脫機(jī)(off-line)”指需要操作員的人工干預(yù)的程序。因此，如果將樣品進(jìn)行沉淀，然后將上清液手動(dòng)裝載到自動(dòng)進(jìn)樣器中，沉淀和裝載步驟與隨后的步驟是脫機(jī)的。在方法的各種實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)步驟可以以聯(lián)機(jī)自動(dòng)方式進(jìn)行。 如本文所用，術(shù)語“質(zhì)譜法”或“MS”指通過化合物的質(zhì)量鑒定化合物的分析技木。MS指基于離子的質(zhì)荷比或“m/z”，過濾、檢測(cè)和測(cè)量離子的方法。MS技術(shù)通常包括⑴電離化合物以形成帶電荷的化合物；和(2)檢測(cè)帶電荷的化合物的分子量和計(jì)算質(zhì)荷比?；衔锟杀浑婋x和通過任何適合的方法檢測(cè)。“質(zhì)譜儀”通常包括電離源和離子檢測(cè)器。一般而言，將ー種或多種感興趣的分子電離，井隨后將離子引入質(zhì)譜儀器，在質(zhì)譜儀器中由于磁場(chǎng)和電場(chǎng)的聯(lián)合，離子順著空間中取決于質(zhì)量(“m”)和電荷(“z”)的路徑走。參見，例如，名稱為 “Mass Spectrometry From Surfaces” 的美國專利號(hào) 6，204，500 ;名稱為 “Methodsand Apparatus for Tandem Mass Spectrometry，，的6，107，623 ;名稱為“DNA DiagnosticsBased On Mass Spectrometry” 的 6，268，144 ;名稱為 “Surface-Enhanced PhotolabileAttachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes” 的 6, 124, 137 ；Wright et al. , Prostate Cancer and Prostatic Diseases 1999，2:264-76 ;和Merchantand Weinberger, Electrophoresis 2000,21:1164-67。如本文所用，術(shù)語“以陰離子方式運(yùn)轉(zhuǎn)”指產(chǎn)生和檢測(cè)陰離子的那些質(zhì)譜法方法。如本文所用，術(shù)語“以陽離子方式運(yùn)轉(zhuǎn)”指產(chǎn)生和檢測(cè)陽離子的那些質(zhì)譜法方法。如本文所用，術(shù)語“電離(ionization)”或“電離(ionizing)”指產(chǎn)生具有等于ー個(gè)或多個(gè)電子単位的凈電荷的分析物離子的過程。陰離子是具有一個(gè)或多個(gè)電子単位的凈負(fù)電荷的那些離子，而陽離子是具有一個(gè)或多個(gè)電子単位的凈正電荷的那些離子。如本文所用，術(shù)語“電子電離”或“EI ”指這樣的方法，其中氣相或汽相的感興趣的分析物與電子流相互作用。電子與分析物的撞擊產(chǎn)生分析物尚子，然后可將該分析物尚子經(jīng)歷質(zhì)譜法技木。如本文所用，術(shù)語“化學(xué)電離”或“Cl”指這樣的方法，其中將試劑氣體(例如銨)進(jìn)行電子碰撞，通過試劑氣體離子和分析物分子的相互作用形成分析物離子。如本文所用，術(shù)語“快速原子轟擊”或“FAB”指這樣的方法，其中高能原子束(通常Xe或Ar)撞擊不揮發(fā)的樣品，解吸和電離樣品中包含的分子。將試驗(yàn)樣品溶解于粘稠的液體基體如甘油、硫甘油、間位硝基芐醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯辛醚、環(huán)丁砜、ニこ醇胺和三こ醇胺。化合物或樣品的合適基體的選擇是經(jīng)驗(yàn)過程。如本文所用，術(shù)語“基體輔助激光解吸電離”或“MALDI”指這樣的方法，其中將不揮發(fā)的樣品暴露于激光輻射，其通過各種電離途徑一包括光電離、質(zhì)子化作用、脫質(zhì)子化
作用和簇衰變(cluster decay)-解吸和電離樣品中的分析物。為了 MALDI,將樣品與
吸收能量的基體混合，該基體促進(jìn)分析物分子的解吸。 如本文所用，術(shù)語“表面增強(qiáng)激光解吸電離”或“SELDI ”指另ー種方法，其中將不揮發(fā)的樣品暴露于激光輻射，其通過各種電離途徑——包括光電離、質(zhì)子化作用、脫質(zhì)子化作用和簇衰變(cluster decay)——解吸和電離樣品中的分析物。為了 SELDI，通常將樣品結(jié)合到優(yōu)先保留一種或多種感興趣的分析物的表面。如在MALDI中，該過程還可利用吸收能量的物質(zhì)以促進(jìn)電離。如本文所用，術(shù)語“電霧化電離”或“ESI ”指這樣的方法，其中將溶液沿著小段毛細(xì)管傳送，將高的正或負(fù)的電勢(shì)施加到毛細(xì)管末端。使到達(dá)管末端的溶液汽化(霧化)成溶劑蒸汽中溶液的非常小滴的射流或噴霧。該滴的霧流過蒸發(fā)室，其被輕微加熱以防止凝結(jié)和使溶劑蒸發(fā)。隨著滴變小，電表面電荷密度増加直到這樣的時(shí)間——同樣的電荷之間的 天然排斥引起離子以及中性分子釋放。如本文所用，術(shù)語“大氣壓化學(xué)電離”或“APCI”指與ESI相似的質(zhì)譜法方法；然而，通過在大氣壓發(fā)生在等離子體內(nèi)的離子-分子相互作用，APCI產(chǎn)生離子。等離子體通過噴霧毛細(xì)管和對(duì)電極之間的放電來保持。然后通常利用ー組差示泵出的撇乳器階段(skimmerstages)將離子通常提取到質(zhì)量分析器。干燥和預(yù)熱的隊(duì)氣的逆流可用于提高溶劑的去除。APCI中的氣相電離可較ESI更有效地用于分析極性較低的種類。如本文所用，術(shù)語“大氣壓光電離”或“APPI”指ー種形式的電離，其中分子M的電離機(jī)制是光子吸收和電子噴射以形成分子離子M+。因?yàn)槲盏墓庾幽芰客ǔ偤酶哂陔婋x電勢(shì)，所以分子離子比較不易離解。在許多情況下，可能分析樣品而無需色譜，因此節(jié)省大量時(shí)間和花費(fèi)。在存在水蒸汽或質(zhì)子溶劑的情況下，分子離子可吸取H以形成MH+。如果M具有高的質(zhì)子親合力，這趨于發(fā)生。這不影響定量準(zhǔn)確度，因?yàn)镸+和MH+之和是恒定的。通常將質(zhì)子溶劑中的藥物化合物觀察為MH+，而非極性化合物如萘或睪酮通常形成M+。參見，例如，Robb et al.，Anal. Chem. 2000，72 (15) :3653-3659。如本文所用，術(shù)語“電感耦合等離子體”或“ICP”指這樣的方法，其中樣品與部分電離的氣體在充分高的溫度相互作用以便使大部分元素原子化和電離。如本文所用，術(shù)語“解吸”指從表面去除分析物和/或分析物進(jìn)入氣相。激光二極管熱解吸(LDTD)是這樣的技術(shù)，其中包含分析物的樣品通過激光脈沖熱解吸到氣相。激光撞擊用金屬基托特別制備的96孔板的背面。激光脈沖加熱基托，熱使樣品轉(zhuǎn)換成氣相。然后可將氣相樣品吸進(jìn)電離源，在那里將氣相樣品在制備中電離，用于在質(zhì)譜儀中分析。當(dāng)利用LDTD吋，氣相樣品的電離可通過本領(lǐng)域已知的任何合適的技術(shù)完成，如通過用電暈放電的電離(例如通過APCI)。如本文所用，術(shù)語“場(chǎng)致解吸”指這樣的方法，其中將不揮發(fā)的試驗(yàn)樣品放到電離表面上，強(qiáng)電場(chǎng)用于以產(chǎn)生分析物離子。如本文所用，術(shù)語“選擇性離子監(jiān)測(cè)”是質(zhì)譜儀器的檢測(cè)方式，其中只有相對(duì)窄的質(zhì)量范圍的離子——通常約ー個(gè)質(zhì)量單位——被檢測(cè)到。如本文所用，“多反應(yīng)方式”有時(shí)被稱作“選擇的反應(yīng)監(jiān)測(cè)”，是質(zhì)譜儀器的檢測(cè)方式，其中先驅(qū)離子和一種或多種碎片離子被選擇性地檢測(cè)。
如本文所用，術(shù)語“定量的下限(lower limit of quantification)”、“定量的下限(lower limit of quantitation)”或“LLOQ”指測(cè)量變得在數(shù)量上有意義的點(diǎn)。在該LOQ的分析物響應(yīng)是可識(shí)別的、離散的和可再現(xiàn)的，具有小于20%的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)和80%至120%的準(zhǔn)確度。如本文所用，術(shù)語“檢測(cè)限值”或“L0D”是這樣的點(diǎn)，在該點(diǎn)測(cè)量值較與其相關(guān)的不確定度大。LOD是這樣的點(diǎn)，在該點(diǎn)，值超過與其測(cè)量相關(guān)的不確定度并被定義為在零濃度平均值的RSD的三倍。如本文所用，體液樣品中分析物的“量”通常指反映樣品體積中可檢測(cè)的分析物質(zhì)量的絕對(duì)值。然而，量還考慮與另一個(gè)分析物量相比的相對(duì)量。例如，樣品中分析物的量可以是大于通常存在于樣品中的分析物的對(duì)照或正常水平的量。如本文所用，提到不包括離子質(zhì)量測(cè)量的定量測(cè)量，術(shù)語“約”指加或減10%的指示值。質(zhì)譜法儀器在測(cè)定給定分析物的質(zhì)量時(shí)可輕微變化。術(shù)語“約”在離子的質(zhì)量或離 子的質(zhì)荷比的上下文中指+/-0. 50原子質(zhì)量單位。上面描述的發(fā)明概述是非限制的，根據(jù)以下本發(fā)明的詳細(xì)描述和根據(jù)權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢(shì)將是明顯的。附圖簡述圖IA-C分別顯示PTAD-維生素D2、PTAD-維生素D3和PTAD-維生素D3-[6, 19，19]-2H3(內(nèi)標(biāo))的示例性色譜圖。詳情在實(shí)施例3中討論。圖2A和2B顯示通過實(shí)施例3中描述的方法測(cè)定的血清樣品中的維生素D2和維生素D3的示例性校正曲線。圖3顯示維生素D2和維生素D3的變異系數(shù)對(duì)濃度的圖。詳情在實(shí)施例5中描述。圖4顯示不同的樣品基體中維生素D3分析的比較研究的結(jié)果。詳情在實(shí)施例11中描述。圖5A顯示維生素D2電離的示例性Ql掃描譜(覆蓋約300至450的m/z范圍)。圖5B顯示具有約397. 2的m/z的維生素D2先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約100至400的m/z范圍)。圖5C顯示具有約379. 2的m/z的維生素D2先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約100至400的m/z范圍)。詳情在實(shí)施例14中描述。圖6A顯示維生素D2-[6，19，19]」H3離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約300至450的m/z范圍)。圖6B顯示具有約400. 2的m/z的維生素D2 - [6，19，19]-2H3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約100至400的m/z范圍)。圖6C顯示具有約382. 2的m/z的維生素D2-[6，19，19]-2H3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約100至400的m/z范圍)。詳情在實(shí)施例14中描述。圖7A顯示維生素D2-[26，26，26，27，27，27]- 離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約300至450的m/z范圍)。圖7B顯示具有約403. 2的m/z的維生素D2-[26，26，26，27，27，27]-2H6先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約100至400的m/z范圍)。圖7C顯示具有約385. 2的m/z的維生素D2-[26，26，26，27，27，27]-2H6先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約100至400的m/z范圍)。詳情在實(shí)施例14中描述。圖8A顯示維生素D3電離的示例性Ql掃描譜(覆蓋約300至450的m/z范圍)。圖8B顯示具有約385. 2的m/z的維生素D3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約100至400的m/z范圍)。圖8C顯示具有約367. 2的m/z的維生素D3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約100至400的m/z范圍)。詳情在實(shí)施例14中描述。圖9A顯示維生素D3 - [6，19，19]」H3離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約300至450的m/z范圍)。圖9B顯示具有約388. 2的m/z的維生素D3 - [6，19，19]-2H3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約100至400的m/z范圍)。圖9C顯示具有約370. 2的m/z的維生素D3 - [6，19，19]-2H3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約100至400的m/z范圍)。詳情在實(shí)施例14中描述。圖IOA顯示維生素D3 - [26，26，26，27，27，27] -2H6離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約300至450的m/z范圍)。圖IOB顯示具有約391. 2的m/z的維生素D3 -[26，26，26，27，27，27] -2H6先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約100至400的m/z范圍)。圖IOC顯示具有約373. 2的m/z的維生素D3 _ [26，26，26，27，27，27] -2H6先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約100至400的m/z范圍)。詳情在實(shí)施例14中描述。
圖IlA顯示PTAD-維生素D2離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約500至620的m/z范圍)。圖IlB顯示具有約572. 2的m/z的PTAD-維生素D2先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約250至350的m/z范圍)。詳情在實(shí)施例15中描述。

圖12A顯示PTAD-維生素D2 - [6，19，19]」H3離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約500至620的m/z范圍)。圖12B顯示具有約575. 2的m/z的PTAD-維生素D2 - [6，19，19]-2H3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約250至350的m/z范圍)。詳情在實(shí)施例15中描述。圖13A顯示PTAD-維生素D2 - [26，26，26，27，27，27]- 離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約500至620的m/z范圍)。圖13B顯示具有約578. 2的m/z的PTAD-維生素D2-[26，26，26，27，27，27]-2H6先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約250至350的m/z范圍)。詳情在實(shí)施例15中描述。圖14A顯示PTAD-維生素D3離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約500至620的m/z范圍)。圖14B顯示具有約560. 2的m/z的PTAD-維生素D3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約250至350的m/z范圍)。詳情在實(shí)施例15中描述。圖15A顯示PTAD-維生素D3-[6，19，19]-2H3離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約500至620的m/z范圍)。圖15B顯示具有約563. 2的m/z的PTAD-維生素D3-[6，19，19]-2H3先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約250至350的m/z范圍)。詳情在實(shí)施例15中描述。圖16A顯示PTAD-維生素D3 - [26，26，26，27，27，27]- 離子的示例性Ql掃描譜(覆蓋約500至620的m/z范圍)。圖16B顯示具有約566. 2的m/z的PTAD-維生素D3 - [26，26，26，27，27，27] -2H6先驅(qū)離子碎裂的示例性產(chǎn)物離子譜(覆蓋約250至350的m/z范圍)。詳情在實(shí)施例15中描述。發(fā)明詳述描述測(cè)量樣品中維生素D的方法。更具體地，描述檢測(cè)和定量樣品中維生素D的質(zhì)譜方法。該方法可利用Cookson型試劑，如PTAD，產(chǎn)生衍生的維生素D。然而，在一些方法中，不使用衍生劑，通過質(zhì)譜法檢測(cè)未衍生的維生素D2和/或維生素D3。該方法可利用提取色譜技術(shù)，如湍流液相色譜(TFLC)，結(jié)合質(zhì)譜法(MS)方法來進(jìn)行未衍生的或衍生的維生素D2和/或維生素D3純化，由此提供檢測(cè)和定量樣品中維生素D2和/或維生素D3的高通量測(cè)定系統(tǒng)?？蛇x地，在一些方法中，色譜一包括提取色譜一對(duì)樣品分析不是必需的。在這些方法中，用LDTD使未衍生的或衍生的維生素D2/或維生素D3電離。優(yōu)選實(shí)施方式特別適合自動(dòng)化維生素D定量的大的臨床實(shí)驗(yàn)室中的應(yīng)用。用于本發(fā)明方法的合適的試驗(yàn)樣品包括可含有感興趣的分析物的任何試驗(yàn)樣品。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，樣品是生物樣品；即，從任何生物來源，如動(dòng)物、細(xì)胞培養(yǎng)物、器官培養(yǎng)物等獲得的樣品。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，樣品從哺乳動(dòng)物，如狗、貓、馬等獲得。特別優(yōu)選的哺乳動(dòng)物是靈長類，最優(yōu)選男性或女性人類。優(yōu)選的樣品包括體液如血液、血漿、血清、唾液、腦脊液或組織樣品；優(yōu)選血漿(包括EDTA和肝素血漿)和血清；最優(yōu)選血清。這樣的樣品可，例如，從患者；即，活人，男性或女性獲得，在臨床環(huán)境中呈現(xiàn)自身用于疾病或狀況的診斷、預(yù)后或治療。本發(fā)明還考慮維生素D定量測(cè)定試劑盒。維生素D定量測(cè)定的試劑盒可包括包含本文提供的組合物的試劑盒。例如，試劑盒可包括包裝材料和測(cè)量過的量的Cookson型試 劑和同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)——以足夠至少一個(gè)測(cè)定的量。通常，試劑盒還將包括以有形形式記錄的說明書(例如，包含在紙或電子媒介上)用于使用維生素D定量測(cè)定中使用的包裝的試劑。用于本發(fā)明的實(shí)施方式的校準(zhǔn)和QC庫優(yōu)選利用與期望的樣品基體相似的基體來制備。用于質(zhì)i普分析的樣品制備在用于質(zhì)譜分析的制備中，維生素D可通過本領(lǐng)域已知的任何方法，包括例如，液相色譜、過濾、離心、薄層色譜(TLC)、包括毛細(xì)管電泳在內(nèi)的電泳、包括免疫親和分離在內(nèi)的親和分離、包括乙酸乙酯或甲醇提取在內(nèi)的提取法，和利用離液劑或以上或類似方法的任何組合相對(duì)于樣品中的一種或多種其它組分(例如蛋白質(zhì))進(jìn)行富集。蛋白質(zhì)沉淀是一種制備試驗(yàn)樣品，特別是生物試驗(yàn)樣品，如血清或血漿的方法。蛋白質(zhì)純化方法是本領(lǐng)域熟知的，例如，Poison et al. , Journal of ChromatographyB2003, 785:263-275，描述了適合用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)沉淀技術(shù)。蛋白質(zhì)沉淀可用于從樣品中去除大部分蛋白質(zhì)，留下維生素D在上清液中?？蓪悠冯x心以從沉淀的蛋白質(zhì)中分離液體上清液；可選地可將樣品過濾以去除沉淀的蛋白質(zhì)。然后可將得到的上清液或?yàn)V液直接應(yīng)用于質(zhì)譜法分析；或可選地應(yīng)用于液相色譜和隨后的質(zhì)譜法分析。在某些實(shí)施方式中，樣品，如血漿或血清，可通過雜化蛋白質(zhì)沉淀/液-液提取法而被純化。在這些實(shí)施方式中，將樣品與甲醇、乙酸乙酯和水混合，并將產(chǎn)生的混合物渦旋和離心。將產(chǎn)生的上清液移去、完全干燥和在乙腈中重構(gòu)(reconstituted)。然后可將純化的維生素D用任何Cookson型試劑，優(yōu)選PTAD或其同位素標(biāo)記的變體衍生?？稍谫|(zhì)譜法之前使用的樣品純化的另一個(gè)方法是液相色譜(LC)。包括HPLC在內(nèi)的液相色譜的某些方法依賴相對(duì)慢的層流技術(shù)。傳統(tǒng)的HPLC分析依賴柱填充，其中通過柱的樣品的層流是從樣品中分離感興趣的分析物的基礎(chǔ)。熟練的技術(shù)人員將理解，這樣的柱中的分離是擴(kuò)散過程并可選擇適合衍生的維生素D使用的包括HPLC在內(nèi)的LC、儀器和柱。色譜柱通常包括介質(zhì)(即，填充材料)以促進(jìn)化學(xué)部分的分離(即，分級(jí))。介質(zhì)可包括微小的顆粒，或可包括具有孔道的整體材料。介質(zhì)的表面通常包括鍵合表面，其與各種化學(xué)部分相互作用以促進(jìn)化學(xué)部分的分離。一個(gè)合適的鍵合表面是疏水鍵合表面如烷基鍵合、氰基鍵合表面或高純的二氧化硅表面。烷基鍵合表面可包括C-4、C-8、C-12或C-18鍵合的烷基。在優(yōu)選實(shí)施方式中，柱是高純的二氧化娃柱(如Thermo Hypersil Gold Aq柱)。色譜柱包括用于接收樣品的入口和用于排出包括分級(jí)的樣品的流出液的出口?？蓪悠分苯犹峁┑饺肟?，或從萃取柱，如聯(lián)機(jī)SPE柱體或TFLC萃取柱。在一個(gè)實(shí)施方式中，可將樣品在入口施加到LC柱，用溶劑或溶劑混合物洗脫，并在出口排出?？蛇x擇不同的溶劑方式用于洗脫感興趣的分析物(或多個(gè))。例如，液相色譜可利用梯度方式、等度方式或多變(即混合)方式進(jìn)行。在色譜期間，物質(zhì)的分離通過變量如洗脫液(也被稱作“流動(dòng)相”)、洗脫方式、梯度條件、溫度等的選擇來完成。在某些實(shí)施方式中，通過將樣品在感興趣的分析物被柱填充材料可逆地保留，而一種或多種其它物質(zhì)不被保留的條件下施加到柱可將分析物純化。在這些實(shí)施方式中，感興趣的分析物被柱保留時(shí)可利用第一流動(dòng)相條件，一旦非保留的物質(zhì)被洗過，隨后可利用第二流動(dòng)相條件以從柱去除保留的物質(zhì)?？蛇x地，通過在感興趣的分析物相比一種或多種其它物質(zhì)以有差別的速度洗脫的流動(dòng)相條件下將樣品施加到柱可純化分析物。這樣的操作 可相對(duì)于樣品的一種或多種其它組分富集一種或多種感興趣的分析物的量。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，用烷基鍵合的分析柱色譜系統(tǒng)進(jìn)行HPLC。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，使用高純二氧化娃柱(如Thermo Hypersil Gold Aq柱)。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，利用HPLC級(jí)水作為流動(dòng)相A和HPLC級(jí)乙醇作為流動(dòng)相B進(jìn)行HPLC和/或TFLC。通過仔細(xì)地選擇閥和連接管道，需要時(shí)可將兩個(gè)或多個(gè)色譜柱連接以便物質(zhì)從一個(gè)通過到下一個(gè)無需任何手動(dòng)步驟。在優(yōu)選實(shí)施方式中，閥和管道的選擇由預(yù)編程序的計(jì)算機(jī)控制以進(jìn)行必需的步驟。最優(yōu)選，色譜系統(tǒng)還以這樣的聯(lián)機(jī)方式連接到檢測(cè)器系統(tǒng)，例如，MS系統(tǒng)。因此，操作員可將樣品的托盤放到自動(dòng)進(jìn)樣器中，剩余的操作在計(jì)算機(jī)控制下進(jìn)行，導(dǎo)致所有選擇的樣品得到純化和分析。在一些實(shí)施方式中，在質(zhì)譜法之前萃取柱可用于維生素D代謝物的純化。在這樣的實(shí)施方式中，在電離之前利用捕獲分析物的萃取柱，樣品可被提取，然后在第二萃取柱上或在分析HPLC柱上洗脫和層析。例如，用TFLC萃取柱的樣品提取可用大粒度(50i!m)的填充柱實(shí)現(xiàn)。然后可將該柱的洗脫出的樣品轉(zhuǎn)移到HPLC分析柱用于質(zhì)譜法之前的進(jìn)一步純化。因?yàn)檫@些色譜程序中包括的步驟可以以自動(dòng)化方式連接，所以可將分析物純化過程中操作員參與的需要減到最小。該特點(diǎn)可導(dǎo)致節(jié)省時(shí)間和成本，并消除操作員錯(cuò)誤的可能。在一些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)沉淀通過雜化蛋白質(zhì)沉淀/液-液提取法一包括從血清的甲醇蛋白質(zhì)沉淀和乙酸乙酯/水萃取一實(shí)現(xiàn)。在經(jīng)歷萃取柱之前產(chǎn)生的維生素D代謝合物可被衍生。優(yōu)選地，雜化蛋白質(zhì)沉淀/液-液提取法和萃取柱以聯(lián)機(jī)方式連接。在優(yōu)選實(shí)施方式中，萃取柱是C-8萃取柱,如Cohesive Technologies C8XL聯(lián)機(jī)萃取柱(50iim粒度，0. 5X50mm)或同等物。然后在質(zhì)譜分析之前可將來自萃取柱的洗脫液施加到分析型LC柱，如以聯(lián)機(jī)方式的HPLC柱。因?yàn)檫@些色譜程序中包括的步驟可以以自動(dòng)化方式連接，所以可將分析物純化過程中對(duì)操作員參與的需要減到最小。該特點(diǎn)可導(dǎo)致節(jié)省時(shí)間和成本，并消除操作員錯(cuò)誤的可能。通過質(zhì)譜法的檢測(cè)和定量在各種實(shí)施方式中，衍生的維生素D可通過熟練的技術(shù)人員已知的任何方法而被電離。利用質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜法，質(zhì)譜儀包括用于電離分級(jí)的樣品和產(chǎn)生用于進(jìn)一步分析的帶電荷分子的離子源。例如樣品的電離可通過電子電離、化學(xué)電離、電霧化電離(ESI)、光電離、大氣壓化學(xué)電離(APCI)、光電離、大氣壓光電離(APPI)、激光二極管熱解吸(LDTD)、快原子轟擊(FAB)、液體二次電離(LSI)、基體輔助激光解吸電離(MALDI)、場(chǎng)致電離、場(chǎng)致解吸、熱噴射/等離子體噴射電離、表面增強(qiáng)激光解吸電離(SELDI)、電感耦合等離子體(ICP)和顆粒束電離進(jìn)行。熟練的技術(shù)人員將理解，可基于將被測(cè)量的分析物、樣品類型、檢測(cè)器類型、陽性對(duì)陰性方式的選擇等確定電離方法的選擇。衍生的維生素D可以以陽性或陰性方式電離。在優(yōu)選實(shí)施方式中，衍生的維生素D以陽離子方式通過APCI或LDTD而被電離。在質(zhì)譜法技術(shù)中，通常在樣品已被電離之后，可分析由此產(chǎn)生的帶正電荷或帶負(fù)電荷的離子以測(cè)定質(zhì)荷比。測(cè)定質(zhì)荷比的合適的分析器包括四極分析器、離子阱分析器和飛行時(shí)間分析器。示例性的離子講方法在Bartolucci, et al. , Rapid Commun. MassSpectrom. 2000，14:967-73 中被描述。
可利用幾種檢測(cè)方式來檢測(cè)離子。例如，選擇的離子可被檢測(cè)，即利用選擇性離子監(jiān)測(cè)方式(SIM)，或可選地，由碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生的質(zhì)量變遷或中性喪失可被監(jiān)測(cè)，例如，多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)或選擇性反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)。優(yōu)選，利用四極分析器測(cè)定質(zhì)荷比。例如，在“四極”或“四極離子阱”儀器中，振蕩射頻場(chǎng)中的離子經(jīng)歷與在電極之間施加的DC電勢(shì)、RF信號(hào)的振幅和質(zhì)荷比成比例的力。可選擇電壓和振幅以便只有具有特定質(zhì)荷比的離子經(jīng)歷四極的長度，而所有其它離子偏離。因此，四極儀器可充當(dāng)注射進(jìn)儀器的離子的“質(zhì)量過濾器”和“質(zhì)量檢測(cè)器”。人們可通過利用“串聯(lián)質(zhì)譜法”或“MS/MS”提高M(jìn)S技術(shù)的分辨率。在該技術(shù)中，可將從感興趣的分子產(chǎn)生的先驅(qū)離子(也稱作母離子)在MS儀器中過濾，隨后破碎先驅(qū)離子以產(chǎn)生一種或多種碎片離子(也稱作子離子或產(chǎn)物離子)，然后將其在第二 MS程序中分析。通過仔細(xì)地選擇先驅(qū)離子，只將某些分析物產(chǎn)生的離子送到碎裂室，在那里與惰性氣體的原子碰撞產(chǎn)生碎片離子。因?yàn)橄闰?qū)離子和碎片離子都在給定的電離/碎裂條件下以可再現(xiàn)的方式產(chǎn)生，所以MS/MS技術(shù)可提供非常強(qiáng)大的分析工具。例如，過濾/碎裂的組合可用于消除干擾物質(zhì)，并可在復(fù)雜樣品，如生物樣品中特別有用。操作串聯(lián)質(zhì)譜儀器的替換方式包括產(chǎn)物離子掃描和先驅(qū)離子掃描。對(duì)于這些操作方式的描述，參見，例如，E. Michael Thurman, et al. , Chromatographic-MassSpectrometric Food Analysis for Trace Determination of Pesticide Residues,第8章(AmadeoR. Fernandez-Alba 編，Elsevier 2005) (387)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的為數(shù)眾多的方法將分析物測(cè)定的結(jié)果與最初樣品中分析物的量關(guān)聯(lián)。例如，假定仔細(xì)控制采樣和分析參數(shù)，可將給定離子的相對(duì)豐度與將該相對(duì)豐度轉(zhuǎn)化成原始分子的絕對(duì)量的表比較。可選地，外標(biāo)可與樣品一起進(jìn)行，基于從那些標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生的離子作標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用這樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可將給定離子的相對(duì)豐度轉(zhuǎn)化成原始分子的絕對(duì)量。在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，內(nèi)標(biāo)用于產(chǎn)生計(jì)算維生素D的量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。產(chǎn)生和利用這樣的標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的，普通技術(shù)人員能選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)。例如，在優(yōu)選實(shí)施方式中，一種或多種同位素標(biāo)記的維生素D (例如，維生素D2-[6，19，19]-2H3和維生素D3-[6，19，19]-2 )可用作內(nèi)標(biāo)。將離子的量與原始分子的量相關(guān)聯(lián)的為數(shù)眾多的其它方法對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說將是熟知的。方法的一個(gè)或多個(gè)步驟可利用自動(dòng)化機(jī)器進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)純化步驟聯(lián)機(jī)進(jìn)行，更優(yōu)選所有的純化和質(zhì)譜法步驟可以以聯(lián)機(jī)方式進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，如MS/MS，其中將先驅(qū)離子分離用于進(jìn)一步碎裂，碰撞活化解離(CAD)常常用于產(chǎn)生碎片離子用于進(jìn)一步檢測(cè)。在CAD中，先驅(qū)離子通過與惰性氣體碰撞而獲得能量，并隨后通過稱作“單分子分解”的過程被破碎。足夠的能量必須沉積在先驅(qū)離子中以便由于增加的振動(dòng)能，離子內(nèi)的某些鍵可被斷裂。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，可如下利用MS/MS檢測(cè)和/或定量樣品中的維生素D。樣品可首先通過蛋白質(zhì)沉淀或雜化蛋白質(zhì)沉淀/液-液提取來純化。然后，任選地將純化的樣品中的維生素D用Cookson型試劑，如PTAD衍生。然后將純化的樣品進(jìn)行液相色譜，優(yōu)選在萃取柱(如TFLC柱)上，該萃取柱之后是分析柱(如HPLC柱)；來自色譜柱的液體溶劑流進(jìn)入MS/MS分析器的霧化器接口 ；溶劑/分析物混合物在接口的加熱的帶電荷的管道中被轉(zhuǎn)化成蒸汽。通過將大的電壓施加到溶劑/分析物混合物而將溶劑中含有的分析物(一 種或多種)(例如，衍生的或未衍生的維生素D)電離。當(dāng)分析物退出接口的帶電荷的管道時(shí)，溶劑/分析物混合物霧化，溶劑蒸發(fā)，留下分析物離子。分析物離子，例如先驅(qū)離子，通過儀器的孔口并進(jìn)入第一四極。四極I和3(Q1和Q3)是質(zhì)量過濾器，允許基于它們的質(zhì)荷比(m/z)選擇離子(即，分別選擇Ql和Q3中的“先驅(qū)”離子和“碎片”離子)。四極2(Q2)是碰撞小室，離子在那里被破碎。質(zhì)譜儀的第一四極(Ql)選擇具有感興趣的質(zhì)荷比的離子。允許具有正確質(zhì)/荷比的先驅(qū)離子進(jìn)入碰撞室(Q2)，而具有任何其它質(zhì)荷比的不需要的離子與四極的側(cè)面撞擊并被消除。進(jìn)入Q2的先驅(qū)離子與中性氬氣分子撞擊并破碎。產(chǎn)生的碎片離子進(jìn)入四極3 (Q3)，在那里衍生的或未衍生的維生素D碎片離子被選擇，而其它離子被排除。方法可包括以陽離子方式或陰離子方式，優(yōu)選陽離子方式進(jìn)行的MS/MS。利用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能鑒定可用于四極3 (Q3)中選擇的衍生的維生素D的特定先驅(qū)離子的一種或多種碎片離子。當(dāng)離子與檢測(cè)器碰撞時(shí)，它們產(chǎn)生電子脈沖，其被轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。將獲得的數(shù)據(jù)傳遞給計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)繪制收集的離子計(jì)數(shù)對(duì)時(shí)間的圖。產(chǎn)生的質(zhì)譜圖與傳統(tǒng)的HPLC-MS方法產(chǎn)生的色譜圖相似?？蓽y(cè)量對(duì)應(yīng)于特定離子的峰下面積或這樣的峰的振幅并使之與感興趣的分析物的量相關(guān)聯(lián)。在某些實(shí)施方式中，測(cè)量碎片離子(一種或多種)和/或先驅(qū)離子的曲線下面積或峰的振幅，以測(cè)定維生素D的量。如上所述，基于內(nèi)部分子標(biāo)準(zhǔn)的一種或多種離子的峰，可利用校正標(biāo)準(zhǔn)曲線將給定離子的相對(duì)豐度轉(zhuǎn)換成原始分析物的絕對(duì)量。
實(shí)施例實(shí)施例I :雜化蛋白質(zhì)沉淀/液-液提耳又和Cookson型衍生對(duì)患者血清樣品進(jìn)行以下自動(dòng)化的雜化蛋白質(zhì)沉淀/液-液提取技術(shù)。已將凝膠屏障血清(Gel Barrier Serum)(即，在血清分離管中采集的血清)以及EDTA血衆(zhòng)和肝素血漿建立為該測(cè)定所接受的。Perkin-Elmer Janus機(jī)器人和TomTec Quadra Tower機(jī)器人用于使以下程序自動(dòng)化。對(duì)于每個(gè)樣品，將50 ii L血清加到96孔板的孔中。然后向每個(gè)孔中加入25 ii L內(nèi)標(biāo)混合物(包含同位素標(biāo)記的維生素D3-[6, 19，19]-2H3),并將板渦旋。然后加入75iiL甲醇,之后進(jìn)行另外的渦旋。然后加入300 ii L乙酸乙酯和75 ii L水,之后進(jìn)行另外的渦旋、離心,并將得到的上清液轉(zhuǎn)移到新的96孔板。將第二 96孔板中的轉(zhuǎn)移的液體在流動(dòng)的氮?dú)馄绻芟赂稍锿耆Ｍㄟ^向每個(gè)孔加A 100 u L的乙腈中的Cookson型衍生劑PTAD的0. lmg/mL溶液來實(shí)現(xiàn)衍生。允許衍生反應(yīng)進(jìn)行大約一個(gè)小時(shí)，并通過向反應(yīng)混合物中加入100 u L水而使之淬滅。實(shí)施例2 :用液相色譜提取維生素D利用Aria OS V I. 5. I 或更新的軟件用 Cohesive Technologies Aria TX-4 TFLC系統(tǒng)進(jìn)行樣品注射。TFLC系統(tǒng)自動(dòng)化地將上述制備的樣品的等分試樣注射進(jìn)填充有大顆粒的Cohesive Technologies C8XL 聯(lián)機(jī)萃取柱(50 U m 粒度，005 X 50mm,來自 Cohesive Technologies, Inc.)。在高流速下裝載樣品以在萃取柱內(nèi)部產(chǎn)生瑞流。該瑞流確保柱中衍生的維生素D與大顆粒優(yōu)化的結(jié)合，和過量衍生試劑和碎片到廢物的通道。裝載之后，用水/乙醇洗脫梯度將樣品洗脫到分析柱-Thermo Hypersil Gold
Aq分析柱(5iim粒度，50X2. 1mm)。將HPLC梯度施加到分析柱以將維生素D與樣品中含有的其它分析物分離。流動(dòng)相A是水，流動(dòng)相B是乙醇。HPLC梯度從35%有機(jī)梯度開始，其在大約65秒中上升到99%。實(shí)施例3 :通討MS/MS檢測(cè)和定量衍牛的維牛素D利用Finnigan TSQ Quantum Ultra MS/MS系統(tǒng)(Thermo Electron Corporation)對(duì)上面產(chǎn)生的樣品進(jìn)行MS/MS。以下軟件程序——所有都來自Thermo Electron——在本文描述的實(shí)施例中使用Quantum Tune Master V I. 5或更新的、Xcalibur V 2. 07或更新的、LCQuan V 2. 56 (Thermo Finnigan)或更新的和 ARIA OS vl. 5. I (Cohesive Technologies)或更新的。退出分析柱的液體溶劑/分析物流到MS/MS分析器的霧化器接口。在接口的管道中溶劑/分析物混合物被轉(zhuǎn)化成蒸汽。霧化的溶劑中的分析物通過APCI被電離。離子經(jīng)過第一四極(Ql)，其選擇分別具有質(zhì)荷比572. 3 ±0. 5m/z和560. 3 ±0. 5m/z的維生素D2和維生素D3先驅(qū)離子。進(jìn)入四極2(Q2)的離子與氬氣碰撞，產(chǎn)生離子碎片，其被送到四極3(Q3)用于進(jìn)一步選擇。質(zhì)譜儀設(shè)置顯示在表I。同時(shí)，用內(nèi)標(biāo)，維生素D3 - [6，19，19]-2 進(jìn)行利用同位素稀釋質(zhì)譜法的相同的過程。在正極性和指示的碰撞能量下驗(yàn)證的過程中用于檢測(cè)和定量的質(zhì)量變遷顯示在表2。表I.用于PTAD-維生素D2、PTAD_維生素D3和維生素D3 _ [6，19，19]-2H3(內(nèi)標(biāo))(正極性)檢測(cè)的質(zhì)譜儀設(shè)置
權(quán)利要求
1.通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定樣品中維生素D2的量的方法，所述方法包括步驟 (i)使來自樣品的維生素D2在適于產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的先驅(qū)離子的條件下經(jīng)歷電離源,所述先驅(qū)離子選自具有397. 2±0. 5或379. 2±0. 5的質(zhì)荷比(m/z)的離子; (ii)破碎至少一種所述先驅(qū)離子以產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的碎片離子； (iii)通過質(zhì)譜法測(cè)定步驟(i)和(ii)中產(chǎn)生的一種或多種所述離子的量；和 (iv)使步驟(iii)中測(cè)定的維生素D2離子的存在與所述樣品中維生素D2的存在相關(guān)聯(lián)， 其中如果所述破碎的先驅(qū)離子包括具有397. 2±0. 5的m/z的離子，所述碎片離子包括一種或多種選自具有159. 0±0. 5,146. 9±0. 5,133. 1±0. 5和121. 0±0. 5的m/z的離子的離子，并且如果所述破碎的先驅(qū)離子包括具有379. 2±0. 5的m/z的離子，所述碎片離子包括一種或多種選自具有283. 2±0. 5,187. 3±0. 5,175. 2±0. 5和159. 0±0. 5的m/z的離子的尚子。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述破碎的先驅(qū)離子是具有397.2±0. 5的m/z的離子。
3.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述破碎的先驅(qū)離子是具有379.2±0. 5的m/z的離子。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述樣品在電離之前經(jīng)歷萃取柱。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述萃取柱是固相萃取(SPE)柱。
6.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述萃取柱是湍流液相色譜(TFLC)柱。
7.權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述樣品在電離之前另外經(jīng)歷分析柱。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述分析柱是高效液相色譜(HPLC)柱。
9.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述萃取柱和分析柱和步驟(i)的所述電離源以聯(lián)機(jī)方式連接。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述電離源是大氣壓化學(xué)電離(APCI)源。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述串聯(lián)質(zhì)譜法作為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)、先驅(qū)離子掃描或產(chǎn)物離子掃描而進(jìn)行。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)所述樣品中的維生素D3。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述維生素D2和維生素D3被同時(shí)電離。
14.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括生物樣品。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述生物樣品來自人類，當(dāng)取自所述人類時(shí)，所述樣品中測(cè)定的所述維生素D2的量是所述樣品中存在的量。
16.權(quán)利要求14-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括血清或血漿。
17.通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定樣品中維生素D3的量的方法，所述方法包括步驟 (i)使來自樣品的維生素D3在適于產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的先驅(qū)離子的條件下經(jīng)歷電離源,所述先驅(qū)離子選自具有385. 2±0. 5或367. 2±0. 5的質(zhì)荷比(m/z)的離子; (ii)破碎至少一種所述先驅(qū)離子以產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的碎片離子； (iii)通過質(zhì)譜法測(cè)定步驟(i)和(ii)中產(chǎn)生的一種或多種所述離子的量；和(iv)使步驟(iii)中測(cè)定的維生素D2離子的存在與所述樣品中維生素D3的存在相關(guān)聯(lián)， 其中如果所述破碎的先驅(qū)離子包括具有385. 2±0. 5的m/z的離子，所述碎片離子包括一種或多種選自具有159. 0±0. 5,147. 0±0. 5,133. 1±0. 5和107. 1±0. 5的m/z的離子的離子，并且如果所述破碎的先驅(qū)離子包括具有367. 2±0. 5的m/z的離子，所述碎片離子包括一種或多種選自具有172. 2±0. 5、145. 0±0. 5和119. I ±0. 5的m/z的尚子的尚子。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述破碎的先驅(qū)離子是具有385.2±0. 5的m/z的離子。
19.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述破碎的先驅(qū)離子是具有367.2±0. 5的m/z的離 子。
20.權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述樣品在電離之前經(jīng)歷萃取柱。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述萃取柱是固相萃取(SPE)柱。
22.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述萃取柱是湍流液相色譜(TFLC)柱。
23.權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述樣品在電離之前另外經(jīng)歷分析柱。
24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述分析柱是高效液相色譜(HPLC)柱。
25.權(quán)利要求23-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述萃取柱和分析柱和步驟(i)的所述電離源以聯(lián)機(jī)方式連接。
26.權(quán)利要求17-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述電離源是大氣壓化學(xué)電離(APCI)源。
27.權(quán)利要求17-26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述串聯(lián)質(zhì)譜法作為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)、先驅(qū)離子掃描或產(chǎn)物離子掃描而進(jìn)行。
28.權(quán)利要求17-27中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)所述樣品中的維生素D2。
29.權(quán)利要求28所述的方法，其中所述維生素D2和維生素D3被同時(shí)電離。
30.權(quán)利要求17-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括生物樣品。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述生物樣品來自人類，當(dāng)取自所述人類時(shí)，所述樣品中測(cè)定的所述維生素D3的量是所述樣品中存在的量。
32.權(quán)利要求30-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括血清或血漿。
33.通過串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定樣品中維生素D2和維生素D3的量的方法，所述方法包括步驟 (i)使樣品中的維生素D2和維生素隊(duì)在適于產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的維生素D2先驅(qū)離子和一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的維生素D3先驅(qū)離子的條件下經(jīng)歷電離源，所述維生素D2先驅(qū)離子選自具有397.2±0.5和379.2±0.5的質(zhì)荷比(m/z)的離子，所述維生素D3先驅(qū)離子選自具有385. 2 ±0.5和367. 2 ±0.5的質(zhì)荷比(m/z)的離子； (ii)破碎至少一種所述維生素D2先驅(qū)離子以產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的維生素D2碎片離子； 其中如果所述破碎的維生素D2先驅(qū)離子包括具有397. 2±0. 5的m/z的離子，那么 所述維生素D2碎片離子包括一種或多種選自具有159. 0±0. 5、146. 9±0. 5、133. I±0. 5和121.0±0. 5的m/z的離子的離子，并且如果所述破碎的維生素D2先驅(qū)離子包括具有379. 2±0. 5的m/z的離子，那么所述維生素D2碎片離子包括一種或多種選自具有、283. 2±0. 5，187. 3±0. 5、175. 2±0. 5 和 159. 0±0. 5 的 m/z 的離子的離子； (iii)破碎至少一種所述維生素隊(duì)先驅(qū)離子以產(chǎn)生一種或多種通過質(zhì)譜法可檢測(cè)的維生素D3碎片離子；和 其中如果所述破碎的維生素D3先驅(qū)離子包括具有385. 2±0. 5的m/z的離子，那么所述維生素D3碎片離子包括一種或多種選自具有159. 0±0. 5,147. 0±0. 5,133. 1±0. 5和107. 1±0. 5的m/z的離子的離子，并且如果所述破碎的維生素D3先驅(qū)離子包括具有367. 2±0. 5的m/z的離子，那么所述維生素D3碎片離子包括一種或多種選自具有、172. 2±0. 5、145. 0±0. 5 和 119. I ±0. 5 的 m/z 的尚子的尚子； (iv)通過質(zhì)譜法測(cè)定步驟和(iii)中產(chǎn)生的一種或多種所述維生素D2和維生素D3尚子的量；和 (v)使步驟(iv)中測(cè)定的所述維生素D2和維生素D3離子的量與所述樣品中維生素D2和維生素D3的量相關(guān)聯(lián)。
34.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述破碎的維生素D2先驅(qū)離子是具有397.2±0. 5的m/z的離子。
35.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述破碎的維生素D2先驅(qū)離子是具有379.2±0. 5的m/z的離子。
36.權(quán)利要求33-35中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述破碎的維生素D3先驅(qū)離子是具有385. 2±0. 5 的 m/z 的尚子。
37.權(quán)利要求33-35中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述破碎的維生素D3先驅(qū)離子是具有367. 2±0. 5 的 m/z 的尚子。
38.權(quán)利要求33-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述樣品在電離之前經(jīng)歷萃取柱。
39.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述萃取柱是固相萃取(SPE)柱。
40.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述萃取柱是湍流液相色譜(TFLC)柱。
41.權(quán)利要求40-41中任一項(xiàng)所述的方法，其中使所述樣品在電離之前另外經(jīng)歷分析柱。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述分析柱是高效液相色譜(HPLC)柱。
43.權(quán)利要求40-41中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述萃取柱和分析柱和步驟(i)的所述電離源以聯(lián)機(jī)方式連接。
44.權(quán)利要求33-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述電離源是大氣壓化學(xué)電離(APCI)源。
45.權(quán)利要求33-44中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述串聯(lián)質(zhì)譜法作為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)、先驅(qū)離子掃描或產(chǎn)物離子掃描而進(jìn)行。
46.權(quán)利要求33-45中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括生物樣品。
47.權(quán)利要求46所述的方法，其中所述生物樣品來自人類，當(dāng)取自所述人類時(shí)，所述樣品中測(cè)定的所述維生素D2和維生素D3的量是所述樣品中存在的量。
48.權(quán)利要求46-47中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品包括血清或血漿。
全文摘要
本發(fā)明涉及非代謝的維生素D的檢測(cè)。在具體方面，本發(fā)明涉及通過質(zhì)譜法檢測(cè)未衍生的非代謝的維生素D的方法。
文檔編號(hào)G01N24/00GK102753964SQ201080063540
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2010年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者B·霍爾奎斯特, N·J·克拉克 申請(qǐng)人:奎斯特診斷投資公司