專利名稱：鼠李糖乳桿菌菌毛多肽和產(chǎn)生它們的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)和食品、飼料或制藥工業(yè)。具體而言，本發(fā)明涉及新的肽、蛋白質(zhì)、菌毛結(jié)構(gòu)、多核苷酸以及包含所述多核苷酸、肽、蛋白質(zhì)或菌毛結(jié)構(gòu)的載體、宿主細(xì)胞、產(chǎn)品和藥物組合物。本發(fā)明也涉及基因簇和抗體。另外，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生所述肽、蛋白質(zhì)、或菌毛結(jié)構(gòu)或產(chǎn)生包含所述肽、蛋白質(zhì)、或菌毛結(jié)構(gòu)的產(chǎn)品的方法。另外，本發(fā)明涉及用于篩選細(xì)菌菌株、用于減低或抑制致病菌黏附、促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞黏附于黏液和/或上皮和/ 或用于調(diào)節(jié)受試者中免疫應(yīng)答的療法以及用途和方法。再者，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)待鑒定和/或抑制的益生細(xì)菌菌株或病原菌株的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌病原體對(duì)宿主組織的侵襲性黏附經(jīng)常受到從微生物細(xì)胞表面向外突出的稱作菌毛或傘毛的延長毛發(fā)樣蛋白質(zhì)性纖維的促進(jìn)。在革蘭氏陰性致病細(xì)菌中，充分認(rèn)識(shí)到菌毛作為定植物在發(fā)病機(jī)理中的作用并且菌毛裝配的總體機(jī)理因超過50年的研究被清晰地定義。結(jié)構(gòu)最充分表征的革蘭氏陰性菌毛是例如存在于腸致病性大腸桿菌(E.coli)中的I型形式和例如存在于奈瑟氏菌屬(Neisseria)和假單胞菌屬(I^eudomonas)物種以及大腸桿菌中的IV型形式。一般，革蘭氏陰性菌毛長(長度1至4μπι)且薄(寬度5至8nm)， 并且還顯示柔性和堅(jiān)韌的結(jié)構(gòu)特性。這些菌毛總體上由一系列非共價(jià)連接的多個(gè)蛋白亞基組成，其中所述多個(gè)蛋白亞基的裝配依賴于特定伴侶蛋白，但是不依賴任何酶活性。經(jīng)常地，具有黏附特性的蛋白質(zhì)位于菌毛的頂端。通常認(rèn)為微生物表面的蛋白質(zhì)亞基的插入長度促進(jìn)黏附性頂端蛋白質(zhì)與相應(yīng)宿主細(xì)胞受體部位之間的無障礙接觸，其中所述的宿主細(xì)胞受體部位由胞外基質(zhì)(ECM)的組件或糖蛋白和糖脂的特定糖部分潛在地代表(Scott J. R.和Zahner D，2006，Mol Microbiol 62，320-330 ;Telford，J. L.，等人 2006，Nat Rev Microbiol 4，509-519)。革蘭氏陽性菌毛樣結(jié)構(gòu)的存在實(shí)際上首先在二十世紀(jì)60年代后期借助牛腎盂炎棒桿菌(Corynebacterium renale)的電子顯微鏡結(jié)果(Yanagawa,R.等人 1968，Jpn J Vet Res 16,31-37)觀察到，并且在后續(xù)數(shù)年中，已經(jīng)在一些其他革蘭氏陽性細(xì)菌物種中找到菌毛，包括在人類中的3種主要侵襲性致病鏈球菌病原體即，釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)禾口月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)中最近發(fā)現(xiàn)菌毛(Telford，J. L.，等人 2006，Nat Rev Microbiol 4,509-519) 革蘭氏陽性菌毛的最詳細(xì)表征研究源自棒桿菌、鏈球菌和芽孢桿菌病原體。不同于革蘭氏陰性細(xì)菌中，革蘭氏陽性細(xì)菌中的菌毛在寬度上窄得多0至 3nm)并且更難以眼觀區(qū)分，這也提示在許多革蘭氏陽性細(xì)菌物種中為何忽視這些菌毛的存在(Kang，H. J.等人2007，Science 318，1625-1628)。迄今，已經(jīng)通過白喉棒桿菌 (Corynebacterium diphtheriae)中菌毛生物發(fā)生的體內(nèi)表征研究實(shí)施對(duì)菌毛裝配過程的最徹底描述，這也通常是對(duì)全部革蘭氏陽性菌毛的總體描述(T0n-That，H. *khneewind， 0. 2004, Trends Microbiol 12，2觀_2；34)。在結(jié)構(gòu)上，原型菌毛作為由共價(jià)交聯(lián)的蛋白質(zhì)亞基(稱作菌毛蛋白)組成的聚合物出現(xiàn)，其中所述的蛋白質(zhì)亞基又共價(jià)地在基部錨定于細(xì)
6胞壁的肽聚糖組分，同時(shí)這兩種共價(jià)鍵均酶促依賴于不同分選酶家族膜結(jié)合轉(zhuǎn)肽酶(即分別是菌毛蛋白特異性分選酶和持家性分選酶)的催化作用(Mandlik，A.等人2008，Trends Microbiol 16，33-40)。革蘭氏陽性菌毛一般由3種菌毛蛋白亞基組成，并且在白喉棒桿菌的情況下，這些蛋白質(zhì)(或編碼它們的基因)命名為完全形成菌毛的軸或主鏈的主要菌毛蛋白亞基SpaA(SpaA)(分選酶介導(dǎo)的菌毛蛋白裝配)、附屬小菌毛蛋白亞基SpaB(SpaB)和位于菌毛頂端的具有黏附特性的另一種小菌毛蛋白亞基SpaC(SpaC)(

圖1)。編碼這3種菌毛蛋白亞基的基因作為菌毛蛋白基因簇連同緊鄰的至少一種編碼菌毛蛋白特異性分選酶的基因定位于相同基因座內(nèi)部。另外，菌毛蛋白簇內(nèi)部的基因經(jīng)常在兩端側(cè)翼為轉(zhuǎn)座元件， 提示其源于水平基因轉(zhuǎn)移。全部這些基因的轉(zhuǎn)錄處于相同的方向并顯示有操縱子調(diào)控作用 (Scott J.R.禾口 Zahner D，2006，MoI Microbiol 62，320—330)。依賴于每種菌毛蛋白亞基一級(jí)序列內(nèi)部的幾個(gè)不同保守基序和結(jié)構(gòu)域的整體革蘭氏陽性菌毛裝配過程的修訂模型包括4個(gè)基本階段(Mandlik，Α.等人2008，Proc Natl Acad Sci USA 105,14147-14152 ；Telford, J. L.，等人 2006，Nat Rev Microbiol 4， 509-519)(圖1)。在第一階段，各自含有N端信號(hào)肽的菌毛蛋白通過Sec依賴性途徑經(jīng)細(xì)菌細(xì)胞膜分泌并且隨后因C端跨膜結(jié)構(gòu)域的存在而停留在細(xì)胞膜中，其中所述的C端跨膜結(jié)構(gòu)域由具有約20個(gè)殘基的疏水區(qū)和帶正電荷的尾組成。在裝配過程的第二階段，緊鄰于該跨膜結(jié)構(gòu)域之前的細(xì)胞壁分選信號(hào)(CWSS)，優(yōu)選LPXTG-基序，可用于細(xì)胞膜錨定的菌毛蛋白的分選酶依賴性剪切。菌毛蛋白特異性分選酶剪切在蘇氨酸(T)和甘氨酸(G)殘基之間的這個(gè)5殘基基序并且形成?；?酶中間體， 其涉及蘇氨酸殘基的羧基與存在于分選酶的催化口袋內(nèi)部的半胱氨酰硫醇之間的共價(jià)硫酯鍵。第三階段代表菌毛蛋白亞基通過形成異肽鍵而聚合并且涉及剪切硫酯鍵和通過親核攻擊來自賴氨酸(K)殘基側(cè)鏈的ε氨基從菌毛蛋白亞基釋放分選酶，其中所述的賴氨酸(K)殘基在第二個(gè)菌毛蛋白亞基的菌毛蛋白基序(WXXXVXVYPKN)中保守。認(rèn)為酰胺鍵在第一菌毛蛋白亞基中的蘇氨酸殘基的C-末端羧基和來自第二菌毛蛋白亞基的菌毛蛋白基序賴氨酸中的側(cè)鏈氨基之間形成，其中所述的第二菌毛蛋白亞基作為共價(jià)硫酯仍與另一種菌毛蛋白特異性分選酶結(jié)合(Budzik,J. Μ.等人2008，Proc Natl Acad Sci USA 105， 10215-10220)。在這個(gè)菌毛裝配模型中，逐步增長的聚合物結(jié)構(gòu)由菌毛基部處的額外菌毛蛋白亞基送入并且總體長度受與菌毛蛋白特異性分選酶結(jié)合的可用菌毛蛋白亞基的量控制。由于菌毛蛋白基序是主要菌毛蛋白亞基(SpaA)及附屬小菌毛蛋白亞基(SpaB)的特征性特征，然而在展示黏附特性的小菌毛蛋白亞基(SpaC)的一級(jí)序列中缺失，這種菌毛蛋白亞基有可能位于菌毛軸和第一菌毛蛋白亞基的頂端以啟動(dòng)菌毛聚合。聚合的菌毛對(duì)細(xì)胞壁的附著代表裝配過程的第四階段。這里，附屬小菌毛蛋白亞基(SpaB)發(fā)出停止菌毛聚合的信號(hào)，但是僅當(dāng)與持家性分選酶結(jié)合時(shí)才如此，所述持家性分選酶的基因在基因組上其他地方編碼。在這個(gè)終末階段，逐步增長的主要菌毛蛋白亞基 (SpaA)的逐步增長的聚合結(jié)構(gòu)通過菌毛蛋白特異性分選酶從硫酯鍵轉(zhuǎn)移，以與作為持家性分選酶酰基-酶中間體被偶聯(lián)的SpaB小菌毛蛋白亞基的菌毛蛋白-基序中賴氨酸的側(cè)鏈形成酰胺鍵。由肽聚糖脂質(zhì)II前體的五肽的氨基的親核攻擊隨后允許持家性分選酶催化連接SpaB菌毛蛋白連接的菌毛聚合物附著于細(xì)胞壁。E-box代表第三且表征較少的保守的一級(jí)序列基序aXLXETXAPXGY)，其存在于來自眾多革蘭氏陽性細(xì)菌的菌毛蛋白亞基的 LPXTG基序與菌毛蛋白基序之間。

迄今，借助X射線晶體學(xué)的三維(3-D)結(jié)構(gòu)測(cè)定已經(jīng)僅針對(duì)兩種革蘭氏陽性菌毛蛋白亞基蛋白揭示對(duì)于裝配和功能的結(jié)構(gòu)深入認(rèn)識(shí)。Krishnan等人Q007，Mructure 15 893-903)已經(jīng)解析了無乳鏈球菌的小菌毛蛋白GBS52的晶體結(jié)構(gòu)并且揭示存在與金黃色葡萄球菌(S. aureus)膠原結(jié)合蛋白Cna共享結(jié)構(gòu)相似性的兩種IgG樣結(jié)構(gòu)域折疊，這也表明這個(gè)小菌毛蛋白亞基如何可能促進(jìn)菌毛黏附于特定宿主組織。由Kang等人0007， Science318,1625-1628)解析的來自釀膿鏈球菌的主要菌毛蛋白Spy0128的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)展示菌毛蛋白亞基內(nèi)部的賴氨酸和天冬氨酸殘基的側(cè)鏈之間自我產(chǎn)生的分子內(nèi)異肽鍵也如何能夠彌補(bǔ)分選酶催化的分子間異肽鍵以維持菌毛的總體強(qiáng)度和穩(wěn)定性。大部分益生微生物是革蘭氏陽性乳桿菌和雙歧桿菌成員并且具有在發(fā)酵食品和乳制品中使用的悠久傳統(tǒng)(Goldin，B. R.和 Gorbach，S. L. 2008，Clin Infect Dis 46， S96-S100 ；Ljungh, Α.禾口 Wadstrom，Τ·2006，Curr Issues Intest Microbiol 7，73-89; Salminen, S.等人1998，Br J Nutr 80，S147-S171)。文獻(xiàn)中未描述過益生性乳桿菌的菌毛結(jié)構(gòu)或編碼這些菌毛結(jié)構(gòu)的基因。從未在鼠李糖乳桿菌(LactcAacillus rhamnosus)中證實(shí)菌毛樣結(jié)構(gòu)或多核苷酸的存在。發(fā)明簡述本發(fā)明的目的是提供新的菌毛多肽以及編碼它們的多核苷酸。另外，本發(fā)明的目的是提供新的菌毛結(jié)構(gòu)。再者，本發(fā)明的目的是提供涉及上述肽、多肽、蛋白質(zhì)、菌毛結(jié)構(gòu)和多核苷酸的新方法、用途和產(chǎn)品。本發(fā)明涉及肽，其中所述的肽包含與SEQ ID NO 1 (GG00441)具有至少94%序列同一性、與 SEQ ID NO 2 (GG00442)具有至少 94%序列同一性、與 SEQ ID NO 3 (GG00443)具有至少84%序列同一性、與SEQ ID N04(GG00444)具有至少91%序列同一性、與SEQ ID NO 5 (GG02369)具有至少83%序列同一性、與SEQ ID NO 6 (GG02370)具有至少94%序列同一性、與SEQ ID NO 7(GG02371)具有至少93%序列同一性或者與SEQ ID N08 (GG02372)具有至少93%序列同一性的序列或其片段或變體。本發(fā)明也涉及編碼肽序列的多核苷酸，其中所述的肽序列與SEQ ID NO 1 (GG00441)或其片段或變體具有至少94%序列同一性、與SEQ ID N02 (GG00442)或其片段或變體具有至少94%序列同一性、與SEQ ID N03 (GG00443)或其片段或變體具有至少84% 序列同一性、與SEQ ID N04(GG00444)或其片段或變體具有至少91%序列同一性、與SEQ ID N05 (GG02369)或其片段或變體具有至少83%序列同一性、與SEQ ID N06 (GG02370)或其片段或變體具有至少94%序列同一性、與SEQ ID N07(GG02371)或其片段或變體具有至少93%序列同一性或者與SEQ ID N08 (GG02372)或其片段或變體具有至少93%序列同一性。本發(fā)明也涉及包含至少一種本發(fā)明肽的菌毛結(jié)構(gòu)、包含至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)的產(chǎn)品并涉及包含至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)的藥物或營養(yǎng)組合物。另外，本發(fā)明涉及產(chǎn)品，其包含用作藥物或用于預(yù)防或治療腹瀉、動(dòng)脈性高血壓、 血管病、變態(tài)反應(yīng)、癌癥、特應(yīng)性疾病、病毒病、傳染病、尿道感染、呼吸道感染、齲齒、腸易激綜合征(IBS)、炎性腸病(IBD)、粘膜炎癥、腸通透性紊亂、肥胖癥、代謝綜合征、氧化性應(yīng)激或腹痛的至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)。另外，本發(fā)明涉及至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)在制造用于預(yù)防或治療腹瀉、動(dòng)脈性高血壓、血管病、變態(tài)反應(yīng)、癌癥、特應(yīng)性疾病、病毒病、傳染病、尿道感染、呼吸道感染、 齲齒、IBS、IBD、粘膜炎癥、腸通透性紊亂、肥胖癥、代謝綜合征、氧化性應(yīng)激或腹痛的藥物中的用途。另外，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療腹瀉、動(dòng)脈性高血壓、血管病、變態(tài)反應(yīng)、癌癥、 特應(yīng)性疾病、病毒病、傳染病、尿道感染、呼吸道感染、齲齒、IBS、IBD、粘膜炎癥、腸通透性紊亂、肥胖癥、代謝綜合征、氧化性應(yīng)激或腹痛的至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)。此外，本發(fā)明涉及包含SEQ ID NOs 9_16任一者或其簡并序列的序列或編碼本發(fā)明肽的多核苷酸，涉及包含本發(fā)明多核苷酸的載體，涉及包含本發(fā)明的多核苷酸或肽的宿主細(xì)胞并且涉及包含至少一種本發(fā)明多核苷酸的基因簇。另外，本發(fā)明涉及針對(duì)本發(fā)明肽或其功能域的一種或多種抗體。本發(fā)明也涉及用于預(yù)防或治療腹瀉、動(dòng)脈性高血壓、血管病、變態(tài)反應(yīng)、癌癥、特應(yīng)性疾病、病毒病、傳染病、尿道感染、呼吸道感染、齲齒、IBS、IBD、粘膜炎癥、腸通透性紊亂、 肥胖癥、代謝綜合征、氧化性應(yīng)激或腹痛的方法，包括施用至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)至受試者。本發(fā)明也涉及用于篩選包含至少一種本發(fā)明多核苷酸或其片段的細(xì)菌菌株的方法，其中該方法包括i)提供來自細(xì)菌菌株的DNA或RNA ；ii)使針對(duì)本發(fā)明多核苷酸或其片段特異的引物或探針與來自步驟i)的DNA或 RNA雜交并任選地?cái)U(kuò)增該多核苷酸或其片段；iii)檢測(cè)與本發(fā)明多核苷酸或其片段同源的至少一種多核苷酸或其片段。本發(fā)明也涉及至少一種本發(fā)明多核苷酸或其片段或至少一種本發(fā)明抗體用于篩選細(xì)菌菌株的用途。本發(fā)明涉及使用至少一種本發(fā)明抗體篩選包含至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)的細(xì)菌菌株的方法，其中該方法包括i)提供細(xì)菌菌株的蛋白質(zhì)；ii)使用所述抗體檢測(cè)至少一種多肽、菌毛結(jié)構(gòu)或其片段。本發(fā)明涉及減低或抑制致病細(xì)菌對(duì)受試者胃腸道、對(duì)其上皮或?qū)ζ漯ひ吼じ降姆椒?，其中該方法包括施用至少一種本發(fā)明肽和/或菌毛結(jié)構(gòu)至該受試者。本發(fā)明涉及至少一種本發(fā)明肽和/或菌毛結(jié)構(gòu)用于減低或抑制致病菌對(duì)受試者胃腸道、對(duì)其上皮或?qū)ζ漯ひ吼じ降挠猛?。本發(fā)明涉及用于減低或抑制致病菌對(duì)受試者胃腸道、對(duì)其上皮或?qū)ζ漯ひ吼じ降闹辽僖环N本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)。本發(fā)明涉及促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞黏附于或任何其他物質(zhì)黏附于黏液或上皮的方法，其中該方法包括i)產(chǎn)生至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)或其片段；ii)在細(xì)菌細(xì)胞上或任何其他物質(zhì)上展示該肽、菌毛結(jié)構(gòu)和/或其片段；iii)使所述細(xì)菌細(xì)胞或任何其他物質(zhì)與黏液或上皮接觸。
本發(fā)明涉及至少一種本發(fā)明肽和/或菌毛結(jié)構(gòu)用于促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞或任何其他物質(zhì)黏附于黏液或上皮的用途。本發(fā)明涉及用于促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞或任何其他物質(zhì)黏附于黏液或上皮的至少一種本發(fā)明肽和/或菌毛結(jié)構(gòu)。本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)受試者中免疫應(yīng)答的方法，其中所述方法包括i)產(chǎn)生至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)或其片段；ii)在宿主細(xì)胞上展示該肽、菌毛結(jié)構(gòu)和/或其片段；iii)任選地使該宿主細(xì)胞與黏液或另一個(gè)宿主細(xì)胞接觸。本發(fā)明涉及至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的用途。本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)。本發(fā)明涉及產(chǎn)生本發(fā)明產(chǎn)品的方法，其中該方法包括對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)生至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)的步驟。本發(fā)明也涉及產(chǎn)生至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)的方法，其中該方法以下步驟i)提供本發(fā)明的至少一種多核苷酸；ii)用所述多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；iii)培養(yǎng)來自步驟ii)的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)；iv)任選地回收所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)。此外，本發(fā)明涉及產(chǎn)生至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)的方法，其中該方法包括以下步驟i)破壞產(chǎn)生或包含至少一種本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)的細(xì)胞；ii)任選地回收所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)。另外，本發(fā)明涉及產(chǎn)生至少一種本發(fā)明肽的方法，其中該方法以下步驟i)提供氨基酸；ii)用合成至少一種肽從步驟i)的氨基酸制造本發(fā)明的至少一種肽。本發(fā)明涉及通過使用生物信息學(xué)方法檢測(cè)潛在的益生性細(xì)菌菌株的方法，其中該方法包括以下步驟i)提供至少一種肽、多核苷酸或其片段的序列；ii)將步驟i)的序列針對(duì)序列集合的序列進(jìn)行比較；iii)檢測(cè)與步驟i)的序列具有生物學(xué)適合片段或與步驟i)的序列具有高同一性的序列。本發(fā)明也涉及通過使用生物信息學(xué)方法檢測(cè)本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)有效針對(duì)的病原菌株的方法，其中該方法包括i)提供至少一種肽、多核苷酸或其片段的序列；ii)將步驟i)的序列針對(duì)序列集合的序列進(jìn)行比較；iii)檢測(cè)與步驟i)的序列具有生物學(xué)適合片段或與步驟i)的序列具有高同一性的序列。本發(fā)明的肽、菌毛結(jié)構(gòu)和多核苷酸提供了用于食品、飼料、化妝品和制藥工業(yè)中進(jìn)一步開發(fā)的工具。本發(fā)明使得多種細(xì)菌菌株的快速與有效篩選方法和可靠且精確的定性或定量分析成為可能。因此，本發(fā)明的方法和手段使得發(fā)現(xiàn)新的益生細(xì)菌菌株以及發(fā)現(xiàn)新產(chǎn)品(包括成分、補(bǔ)充劑和營養(yǎng)品)、藥物和治療方法成為可能。另外，借助本發(fā)明，更有效和特異的療法變得可獲得。存在向消費(fèi)者提供新產(chǎn)品的持續(xù)、明顯的需要，其中所述的新產(chǎn)品對(duì)健康具有明確證實(shí)的效果并且以這樣的形式產(chǎn)生，從而允許這些產(chǎn)品原樣地或作為另一種產(chǎn)品(如藥品或食品或飼料產(chǎn)品)的一部分使用。根據(jù)本發(fā)明，產(chǎn)品也可用作允許作為例如日常膳食或藥物的便利部分(convenient part)或補(bǔ)充劑使用的膠囊劑、丸劑或片劑。附圖簡述圖Ia和Ib顯示革蘭氏陽性棒狀桿菌中菌毛裝配和共價(jià)附著于細(xì)胞壁的模型。圖2顯示包括編碼菌毛蛋白特異性分選酶、主要菌毛軸蛋白、小菌毛軸蛋白和加帽菌毛蛋白質(zhì)的基因的鼠李糖乳桿菌GG(LGG)菌毛簇。CWSS表示細(xì)胞壁分選信號(hào)，即在許多革蘭氏陽性細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的保守基序，Pilin基序和E-盒也表示在許多革蘭氏陽性細(xì)菌中存在的保守基序。圖 3 顯示與 LGG 菌毛結(jié)構(gòu)的肽 GG00442、GG00443、GG00444、GG02370、GG02371 和 GG02372結(jié)合的多克隆抗體的實(shí)例。圖4顯示LGG的突出菌毛結(jié)構(gòu)的相差原子力顯微鏡顯微圖片。圖fe和5b顯示重組組氨酸標(biāo)記的LGG蛋白即SpaA、SpaB, SpaC, SpaD和SpaF菌毛蛋白與人腸黏液的體外結(jié)合。使用切除的人腸組織作為聚苯乙烯微量滴定平板上的黏液來源。通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)結(jié)合的蛋白質(zhì)。圖6a和6b分別地顯示使用SpaA和SpaC菌毛蛋白特異性多克隆抗體時(shí)，在 mTSB-培養(yǎng)基或MRS+0.6%牛膽汁培養(yǎng)基中培育的LGG和(作為陰性對(duì)照的)鼠李糖乳桿菌LC705(LC7(^)的細(xì)胞壁級(jí)分的蛋白質(zhì)印跡。圖6a顯示在LGG中存在含有SpaA的菌毛和 SpaA單體，并且圖6b顯示在LGG中存在含有SpaC的菌毛和SpaC單體。泳道1 重組SpaA/ SpaC菌毛蛋白；泳道2 在mTSB中培育的LGG ；泳道3 在MRS+0. 6%牛膽汁中培育的LGG ； 泳道4 在mTSB中培育的LC705 ；泳道5 在MRS+0. 6%牛膽汁中培育的LC705。使用的抗體在每幅圖的頂部顯示。在圖6b中，分圖A 泳道1至5曝光1秒；分圖B 泳道2-5分別曝光60秒。分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置在左邊顯示為千道爾頓。HMW表示高分子量梯。圖6c顯示含有SpaB的菌毛和SpaB單體在LGG細(xì)胞壁級(jí)分的蛋白質(zhì)印跡中存在。泳道1 分子量標(biāo)記； 泳道2 在MRS中培育的LGG。用SpaB菌毛蛋白特異性多克隆抗體、山羊抗兔IgG-AP綴合物(Bio Rad)和BCIP/NBT顯色劑進(jìn)行檢測(cè)。圖7a_c顯示PCR篩選具有菌毛結(jié)構(gòu)的新益生菌菌株的結(jié)果。圖7a_c分別顯示鼠李糖乳桿菌GG、鼠李糖乳桿菌LC705和干酪乳桿菌(LactcAacillus case) ATCC 334的擴(kuò)增產(chǎn)物。泳道1 分子量標(biāo)記；泳道2 采用SpaF的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道3 采用SpaE的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道4 采用SpaD的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道5 采用SpaC的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道6 采用SpaB的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道7 采用SpaA的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖8a_d顯示表明spaC、spaB或spaA在干酪乳桿菌ATCC 334、鼠李糖乳桿菌LC705 和鼠李糖乳桿菌GG中存在的DNA印跡雜交信號(hào)。圖8a顯示通過瓊脂糖凝膠電泳分離的已消化基因組DNA并且圖汕、8(3和8d顯示分別使用DIG-標(biāo)記的鼠李糖乳桿菌GG spaC基因的801-bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、鼠李糖乳桿菌GG spaB基因的612-bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或鼠李糖乳桿菌GG spaA基因的780-bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為探針時(shí)，相同DNA的DNA印跡雜交。泳道1 分子量標(biāo)記I HindIII-(pX174HaeIII混合物；泳道2 :DIG標(biāo)記的分子量標(biāo)記II (Roche)； 泳道3 用HindIII消化的干酪乳桿菌ATCC 334 ；泳道4 用HindIII消化的鼠李糖乳桿菌 LC705，泳道5 用HindIII消化的鼠李糖乳桿菌GG ；泳道6 -；泳道7 未標(biāo)記的探針。圖9顯示用活的鼠李糖乳桿菌GG 2xl06cfu/ml或用大約30pmol/ml純化的His 標(biāo)簽標(biāo)記的鼠李糖乳桿菌GG蛋白SpaA、SpaB和SpaC刺激巨噬細(xì)胞期間的TNF- α水平。圖10顯示來自人腸黏液致病細(xì)菌屎腸球菌由鼠李糖乳桿菌GG或SpaC、SpaB和 SpaA菌毛蛋白逐出。黏附(％)表述為5個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)士S. D.。*指顯著減少的屎腸球菌黏附(P < 0. 05)。圖Ila和lib顯示編碼圖2中所述的菌毛操縱子的核苷酸序列。圖Ila顯示編碼 GG00441-GG00444基因的操縱子(粗體)。推定性保守元件_35序列(下劃線)、-10序列 (雙下劃線)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(下劃線斜體)和rho終止子(點(diǎn)下劃線)。圖lib顯示編碼GG02369-GG02372基因的操縱子(粗體)。推定性保守元件_35序列(下劃線)、-10序列(雙下劃線)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(下劃線斜體)和rho終止子(點(diǎn)下劃線)。發(fā)明詳述乳酸細(xì)菌已經(jīng)在食物工業(yè)中長久使用并且它們?nèi)缃裼迷诙喾N食物供給品如乳產(chǎn)品中。例如，已知乳桿菌和雙歧桿菌具有益生效果，但是沒有充分理解益生細(xì)菌影響健康的方式。因此，需要深入研究益生菌。本發(fā)明基于革蘭氏陽性細(xì)菌也具有菌毛結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果。另外，本發(fā)明基于在革蘭氏陽性細(xì)菌中、具體在乳桿菌中，更具體在鼠李糖乳桿菌中的新菌毛肽和結(jié)構(gòu)中的發(fā)現(xiàn)。菌毛結(jié)構(gòu)的肽總體而言，革蘭氏陽性細(xì)菌菌毛從細(xì)菌的外膜伸出，通常1-4 μ m長和2-8nm寬并且以低數(shù)目出現(xiàn)。認(rèn)為菌毛促進(jìn)細(xì)菌黏附于靶表面。實(shí)際上，如本文中所用，表達(dá)“菌毛結(jié)構(gòu)”指修長的毛狀或毛發(fā)樣蛋白質(zhì)纖維，包含多個(gè)蛋白亞基(優(yōu)選地多于1個(gè)亞基)。這些蛋白質(zhì)的裝配可以依賴于特定蛋白質(zhì)，即分選酶。具有黏附特性的蛋白質(zhì)通常位于菌毛的頂部。具有異聚體菌毛結(jié)構(gòu)的其他蛋白質(zhì)可以是黏附性的。如本文中所用，表述“菌毛結(jié)構(gòu)的部分”指菌毛的任何組分，優(yōu)選該菌毛的任何蛋白質(zhì)或任何片段或任何變體。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，菌毛結(jié)構(gòu)位于微生物的表面上或源自其中。如本文中所用，表述“肽”指任何肽，如二肽、多肽、蛋白質(zhì)和/或菌毛蛋白。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，菌毛蛋白的特征性特征是主要菌毛蛋白亞基 (SpaA)，附屬小菌毛蛋白亞基(SpaB)和加帽菌毛蛋白亞基(SpaC)。菌毛蛋白特異性分選酶通過轉(zhuǎn)移SpaA至逐步增長的菌毛蛋白聚合物結(jié)構(gòu)中的 SpaC來起作用(圖1)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，包含與SEQ ID NO 1 (GG00441)具有至少94%序列同一性的序列或與SEQ ID N05 (GG002369)具有至少83%序列同一性的序列的肽是菌毛蛋白特異性分選酶(圖2，對(duì)于編碼2圖中所述的菌毛操縱子的核苷酸序列，還見圖11)。SpaA同樣形成菌毛結(jié)構(gòu)的主鏈。不同菌毛結(jié)構(gòu)的長度取決于SpaA在主鏈中的量 (圖1)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，包含與SEQ ID N02 (GG00442)具有至少94%序列同一性的序列或與SEQ ID N06 (GG002370)具有至少94%序列同一性的序列的肽是主要菌毛軸蛋白，即主要菌毛蛋白亞基(圖2，對(duì)于編碼2圖中所述的菌毛操縱子的核苷酸序列，還見圖11)。GG00442和GG02370含有分選酶識(shí)別位點(diǎn)，因而是分選酶的底物。SpaB同樣在菌毛形成的最晚時(shí)期(終末階段)添加至菌毛結(jié)構(gòu)并且它形成菌毛至細(xì)胞壁的連接(圖1)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，包含與SEQ ID NO 3(GG00443)具有至少84%序列同一性的序列或與SEQ ID N07 (GG002371)具有至少93%序列同一性的序列的肽是小菌毛軸蛋白(圖2，對(duì)于編碼2圖中所述的菌毛操縱子的核苷酸序列，還見圖11)。 GG00443和GG002370含有分選酶識(shí)別位點(diǎn)，因而是分選酶的底物。SpaC可能位于菌毛軸和第一菌毛蛋白亞基的頂端以啟動(dòng)菌毛聚合(圖1)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，包含與SEQ ID NO 4(GG00444)具有至少91%序列同一性的序列或與SEQ ID NO 8 (GG002372)具有至少93%序列同一性的序列的肽是結(jié)合性菌毛蛋白(圖 2，對(duì)于編碼2圖中所述的菌毛操縱子的核苷酸序列，還見圖11)。GG00444蛋白含有von Willebrand因子(vWF)結(jié)構(gòu)域，并且GG00444和GG02372含有分選酶識(shí)別位點(diǎn)，因而是分選酶的底物。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽或多肽包含與SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、 7或8的氨基酸序列或與其片段或變體具有至少60、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5,99. 8,99. 9 或 100% 同一性的序列。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，該肽與SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7或8的氨基酸序列任一者或與其片段或變體具有至少 60、65、70、75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5,99. 8,99. 9 或 100% 同一性。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，該肽具有在序列SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7 或8任一者或其片段或變體中所示的序列。與本發(fā)明序列比較的任何序列或片段的同一性指與本發(fā)明完整序列比較的任何序列的同一性。序列同一性可以例如通過使用BLAST(基本局部比對(duì)搜索工具)或 FASTA(FAST-AII)確定。在所述搜索中，設(shè)置參數(shù)"空位罰分"和"矩陣"一般選擇為默認(rèn)。如本文中所用，肽的片段或變體指肽的可以具有生物學(xué)功能的任何部分或變體。 變體指在肽序列中具有微小變動(dòng)如例如小缺失、突變或插入的肽。如本文中所用，“肽的功能性片段或變體”例如指能夠在不同菌毛蛋白亞基之間形成異肽鍵(例如，菌毛蛋白特異性分選酶的轉(zhuǎn)肽酶活性)、作為分選酶的底物(例如，SpaA,SpaB, SpaC,SpaD, SpaE和SpaF的功能)或與細(xì)胞壁結(jié)合(例如，SpaC和SpaF的功能)或與其他蛋白質(zhì)或片段結(jié)合(例如， SpaC的功能)的片段或變體。另外，“肽的功能性片段或變體”可以指包含生物學(xué)結(jié)構(gòu)域的任何片段或變體。如今，多肽內(nèi)部的結(jié)構(gòu)域通常定義為空間上明顯的結(jié)構(gòu)，其可想象地折疊并獨(dú)立地發(fā)揮作用(Ponting C. P.和 Russell R. R. 2002，Annu Rev Biophys Biomol Struct. 31 45-71)。基于使用流行結(jié)構(gòu)域-數(shù)據(jù)庫PFAM (Finn，R.D.等人2009年11月17日，Nucleic Acids Res.[先于印刷版的電子版發(fā)布])的工具分析例如SEQ ID NO 4的多肽序列，本研究中將SEQ ID NO 4的多肽序列表征為具有小于或等于0. 1的顯著性E值的3個(gè)結(jié)構(gòu)域。從SEQ ID NO 4第137至271位的氨基酸形成第一結(jié)構(gòu)域(PF00092_von Willebrand因子A型結(jié)構(gòu)域)，其中所述的第一結(jié)構(gòu)域也存在于許多介導(dǎo)和參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)中(Colombatti，A.等人1993，Matrix. 13 :297-306 ； Whittaker C. A.禾Π Hynes R. 0. 2002，MoI Biol Cell. 13 :3369-87 ；Konto-Ghiorghi, Y 等人 2009，PLoS Pathog. 5 :el000422)。含有 von Willebrand 因子 A 型結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)經(jīng)常在多蛋白質(zhì)復(fù)合體中發(fā)揮功能并且已經(jīng)記載參與真核生物中的眾多生物學(xué)事件，包括膜運(yùn)輸、蛋白酶體、轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、細(xì)胞黏附、移行、歸巢、圖式形成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) (Colombatti，A.等人Matrix. 13 =297-306)。最近，證實(shí)致病性無乳鏈球菌菌株NEM316的菌毛蛋白的von Willebrand因子A型結(jié)構(gòu)域是該蛋白質(zhì)對(duì)人上皮細(xì)胞的黏附功能必需的 (Konto-Ghiorghi, Y.等人 2009，PLoS Pathog. 5 :el000422)。從SEQ ID NO 4第617至691位的氨基酸形成第二結(jié)構(gòu)域(PF05738_Cna蛋白B 型結(jié)構(gòu)域)并且從SEQ ID NO 4第749至821位的氨基酸形成第三結(jié)構(gòu)域(PF05738-Cna 蛋白B型結(jié)構(gòu)域)。已經(jīng)記載Cna蛋白B型結(jié)構(gòu)域在金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)膠原結(jié)合表面蛋白中共有重要作用。然而，該區(qū)域不介導(dǎo)膠原蛋白結(jié)合，但是相反， 作為“柄”發(fā)揮作用，其中所述的柄將該蛋白質(zhì)的其他區(qū)域從細(xì)菌表面伸出并且因而促進(jìn)細(xì)菌黏附于膠原(Deivanayagam，C. C.等人 2000，Structure. 8 :67-78)。最近，對(duì) Cna 蛋白 B 型結(jié)構(gòu)域提出另一個(gè)特性，因?yàn)橹赋鏊凶C實(shí)對(duì)于菌毛裝配和不同菌毛蛋白亞基連接在一起重要的異肽鍵形成殘基(Kang, H. J.等人2007，Science 318，1625-1628)。片段的序列同一性百分?jǐn)?shù)可以如對(duì)完整多肽那樣，使用相同的工具和設(shè)置進(jìn)行度量?？梢匀缟纤雠cSEQ ID NO 4類似地分析本發(fā)明的任何多肽序列。Cna蛋白B型結(jié)構(gòu)域存在于SEQ ID NO 2(第73-155和第193-295位氨基酸)、SEQ ID NO 3(第72-164 位氨基酸)、SEQ ID NO 6 (第 374-470 和第 69-168 位氨基酸)、SEQ ID NO 7 (第 238-3 位氨基酸)和SEQ ID NO 8 (第743-805和第839-906位氨基酸)中?；诂F(xiàn)有知識(shí)，具有足夠高同一性百分?jǐn)?shù)的多肽共享相似的空間結(jié)構(gòu)并且有可能涉及相似的(盡管并非必然涉及相同的)功能。功能與結(jié)構(gòu)等價(jià)性的序列水平同一性百分?jǐn)?shù)是比對(duì)長度的函數(shù)(Sander C.和 Schneider R. 1991，Proteins. 9 :56-68)。例如，當(dāng)具有至少50個(gè)氨基酸的多肽的序列水平同一性百分?jǐn)?shù)超過35%時(shí)，它們具有良好的結(jié)構(gòu)相似性。因而，現(xiàn)有知識(shí)說明序列同一性百分?jǐn)?shù)高于35%并且長度超過50個(gè)氨基酸的多肽序列可能涉及相似的功能、具有相似的空間結(jié)構(gòu)并且使用相同的抗體相關(guān)篩選方法予以檢測(cè)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，具有SEQ ID NO 2_4或6_8的肽是菌毛結(jié)構(gòu)的一部分。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的菌毛結(jié)構(gòu)包含本發(fā)明的至少1種肽，更優(yōu)選地包含本發(fā)明的至少2種或至少3種肽。另外，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，該菌毛結(jié)構(gòu)包含肽 GG00442 (SEQ ID NO 2)，GG00443 (SEQ ID NO 3)和 GG00444(SEQ ID NO 4)和 / 或月太 GG02370(SEQ ID NO 6)，GG02371 (SEQ ID NO 7)和 GG02372(SEQ ID NO 8)。革蘭氏陽性及益生性細(xì)菌本發(fā)明的肽或菌毛結(jié)構(gòu)可以來自任何細(xì)菌，如革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。然而，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)來自革蘭氏陽性細(xì)菌?？梢园景l(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)的革蘭氏陽性細(xì)菌包括但不限于乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌、丙酸桿菌、明串珠菌、鏈球菌、棒狀桿菌、放線菌和分枝桿菌。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)來自益生性細(xì)菌(如益生性乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌、腸球菌、丙酸桿菌、明串珠菌和鏈球菌或酵母。益生菌是活的微生物， 優(yōu)選地是非致病性微生物，當(dāng)以足夠的量施用至人或動(dòng)物時(shí)，其促進(jìn)宿主的健康(Fuller， R. 1989，J. App 1. Microbiol. 66 :365-378)。當(dāng)作為食物或食物補(bǔ)充劑以足夠的量消費(fèi)時(shí)，益生菌將對(duì)宿主產(chǎn)生有益的健康好處。益生菌在人或動(dòng)物中的健康好處包括可能預(yù)防和治療許多疾病。益生菌的健康促進(jìn)作用例如包括平衡和維系腸菌群、刺激免疫系統(tǒng)和抗癌變活性。益生菌在人腸道中有用效果基于活細(xì)菌細(xì)胞、其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物所引起的幾個(gè)獨(dú)立因素。如果一種細(xì)菌滿足以下要求，則可以稱它為益生菌(Lee，Y-K和&ilminen，S. 1995 Trend Food Sci Technol,6 =241-245)它在消化道中優(yōu)勢(shì)的苛刻條件(胃部低pH、消化系統(tǒng)的酸，等)下仍是活的；附著于腸壁；定植至GIT ；在腸內(nèi)代謝；是技術(shù)上可應(yīng)用的(承受加工過程)；顯示經(jīng)臨床檢驗(yàn)和報(bào)道過的健康效果；并且是消費(fèi)安全的。胃腸道不同部分之間的微生物含量存在巨大差異，全部腸細(xì)菌的約95%出現(xiàn)在結(jié)腸中。除暫居微生物之外，估計(jì)超過400個(gè)細(xì)菌物種在結(jié)腸中旺盛生長。優(yōu)勢(shì)物種如下擬桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、糞球菌屬 (Coprococcus)、消化鏈球菌屬(P印tostr印tococcus)、真細(xì)菌屬(Eubacterium)禾口瘤胃球菌屬(Ruminococcus) ο 乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、梭桿菌屬 (Fusobacterium)、韋榮球菌屬(Veillonella)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)禾口腸桿菌科(Enterobacteriaceae)物種的數(shù)目略少。所述物種的某些代表有用的微生物，而其他甚至可以有害(Tannock，G. W. 1998，Int. Dairy J. 8 :527-533)。腸菌群組成的變化或其量的突然降低(因重度腹瀉、抗生素治療等所致)增加了潛在致病性物種的感染性，這可以造成嚴(yán)重后果(變態(tài)反應(yīng)爆發(fā)、腸病、癌癥)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)與胃腸道(GIT)結(jié)合，最優(yōu)選地與胃腸道的上皮結(jié)合。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)與黏液結(jié)合。黏液是來自黏液產(chǎn)生細(xì)胞的滑膩分泌產(chǎn)物，粘稠膠質(zhì)。黏液保護(hù)例如在GIT中的上皮細(xì)胞。除了殺菌酶類和免疫球蛋白之外，黏液也含有粘蛋白和無機(jī)鹽。如本文中所用，胃腸道指從嘴至肛門的管，其參與消化食物。GIT包括口、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、小腸、 大腸(結(jié)腸)、盲腸、直腸和肛門。記載最詳細(xì)的益生菌包括鼠李糖乳桿菌(L. rhamnosus) GG、約氏乳桿菌 (L. johnsonii)LAl、干酪乳桿菌(L. casei) Shirota 和乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)Bbl20此外，已經(jīng)在本領(lǐng)域文獻(xiàn)中描述眾多的其他益生菌。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)來自鼠李糖乳桿菌，最優(yōu)選地來自鼠李糖乳桿菌GG(LGG，LGG )菌株，其是最初來自美國的非致病性革蘭氏陽性分離株(US4839281 A)。LGG菌株分離自人糞便，它能夠在PH 3良好生長并且甚至在更低pH 3以及高膽酸含量下存活。該菌株顯示優(yōu)異的黏液和上皮細(xì)胞黏附性并且定植GIT。來自葡萄糖的乳酸產(chǎn)率是良好的在MRS培養(yǎng)液中培育時(shí)，該菌株產(chǎn)生1. 5-2%乳酸。該菌株不發(fā)酵乳糖并且它不從乳糖產(chǎn)生乳酸。該菌株發(fā)酵以下糖類D_阿拉伯糖、核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、鼠李糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、甘露醇、山梨醇、N-乙酰葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉苷、水楊苷、纖維二糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、龍膽二糖、D-塔格糖、L-巖藻糖和葡萄糖酸。該菌株在15-45°C 良好生長，最佳溫度是3-37°C。LGG已經(jīng)以保藏號(hào)ATCC 53103保藏于保藏機(jī)構(gòu)美國典型培養(yǎng)物保藏中心。菌毛基因編碼菌毛結(jié)構(gòu)的菌毛蛋白的基因簇集在LGG基因組中的相同基因座上。在LGG基因組中通過生物信息學(xué)方法總計(jì)找到編碼菌毛肽的兩個(gè)不同基因簇(圖2，對(duì)于編碼2圖中所述的菌毛操縱子的核苷酸序列，還見圖11)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多核苷酸具有SEQ ID N0s9-16任一者或其簡并序列或片段的序列，或它編碼本發(fā)明的肽或其片段。具有SEQ ID NOs 9-16任一者中所示序列的簡并序列的核苷酸意指它含有1個(gè)或多個(gè)不同的核苷酸，但是仍編碼相同的氨基酸。如本文中所用的“多核苷酸”是核苷酸序列，如DNA或RNA序列，并且可以是單鏈或雙鏈的多核酸。術(shù)語“多核苷酸”包括基因組DNA、cDNA和mRNA。多核苷酸也可以是分離的 DNA。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基因簇包含本發(fā)明的至少一種多核苷酸。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述基因簇包含本發(fā)明的至少2種、至少3種或至少4種多核苷酸。最優(yōu)選地，該基因簇包含SEQ ID NOs 9_12或SEQ ID NOs 13-16中所示的多核苷酸。如本文中所用，“基因簇”指編碼聯(lián)合功能(協(xié)同作用)所需的肽/蛋白質(zhì) (在此例如編碼菌毛結(jié)構(gòu))的至少2個(gè)基因的集合。相同簇的基因通常一起歸并在相同的遺傳基因座上。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，該多核苷酸與SEQ ID NO 9、10、11、12、13、14、15或 16的核苷酸序列任一者或與其片段具有至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5、99. 8、99.9 或 100 %
同一性。在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，該多核苷酸具有在序列SEQ IDNO 9、10、11、 12、13、14、15或16任一者中所示的序列。產(chǎn)品和藥物組合物在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述產(chǎn)物包含本發(fā)明的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)。該產(chǎn)物也可以包含本發(fā)明的至少2種或至少3種肽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)物包含本發(fā)明肽的至少一個(gè)片段。本發(fā)明的產(chǎn)品可以選自但不限于由食品、動(dòng)物飼料、營養(yǎng)品、食物補(bǔ)充劑、食物成分、健康食品、藥品和化妝品組成的組。在發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，產(chǎn)品是食品或飼料產(chǎn)品。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)品是功能性食品，即具有任何健康促進(jìn)和/或疾病預(yù)防或治療特性的食品。優(yōu)選地，本發(fā)明的食品選自由奶產(chǎn)品、烘焙產(chǎn)品、巧克力和甜食、糖和口香糖、谷物產(chǎn)品、小吃、基于漿果或水果的產(chǎn)品和飲料/飲品組成的組。奶產(chǎn)品包括但不限于乳、酸乳、酸奶和其他發(fā)酵的乳產(chǎn)品如奶酪和膏糊(spreads)、 乳粉、兒童食品、嬰兒食品、學(xué)步兒童食品、嬰兒配方食品、果汁和湯。除本發(fā)明的肽或菌毛結(jié)構(gòu)之外，該產(chǎn)品也可以含有其他starters、益生菌等。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，該產(chǎn)品是藥物組合物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該藥物組合物包含本發(fā)明的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)，并且在另一個(gè)實(shí)施方案中包含本發(fā)明的至少2種或至少3種肽。藥物組合物可以例如以固體、半固體或液體形式，如以片齊U、丹劑、膠囊劑、溶液劑、乳劑、混懸劑、陰道凝膠劑和軟膏劑、陰道栓劑等形式使用。優(yōu)選地，該組合物用于口服施用或用于腸道施用。
除本發(fā)明的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)之外，藥物組合物還可以包含益生元，可藥用載體(例如水、葡萄糖或乳糖)、佐劑、賦形劑、輔助賦形劑、殺菌劑、穩(wěn)定劑、增稠劑或著色劑、香料、粘合劑、填充劑、潤滑劑、懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑、凝膠劑、抗氧化劑、防腐劑、緩沖齊U、PH調(diào)節(jié)劑、濕潤劑或相應(yīng)產(chǎn)品中通常存在的組分。本發(fā)明的產(chǎn)品或藥物組合物包含足以產(chǎn)生所希望效果的量的所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)。 商業(yè)地獲得或通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)制備所述產(chǎn)品或藥物組合物的其他成分以及其他特定組分。所述產(chǎn)品或藥物組合物可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法制造。對(duì)產(chǎn)品產(chǎn)生肽或菌毛結(jié)構(gòu)意指該肽或菌毛結(jié)構(gòu)可以例如添加至任何產(chǎn)品或與任何物質(zhì)混合。該肽或菌毛結(jié)構(gòu)也可以在產(chǎn)品中產(chǎn)生，例如，通過適宜條件下表達(dá)。在成品完成期間，可以與制備過程中或在其之后添加或混合肽或菌毛結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，將本發(fā)明的肽或菌毛結(jié)構(gòu)添加至產(chǎn)品。生產(chǎn)方法本發(fā)明的肽或菌毛結(jié)構(gòu)可以例如通過合成方法(例如，肽合成法)或通過采用基因修飾生物的重組生產(chǎn)法產(chǎn)生。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)是重組的。 如本文中所用，“重組"遺傳材料指一般作為一種或多種遺傳材料(例如各種來源的DNA 鏈)組合的材料，并且它已經(jīng)通過合并或插入所述序列產(chǎn)生。重組產(chǎn)生能夠?qū)蚧蚧虍a(chǎn)物，或者例如基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)特定和/或特別性狀(例如過量表達(dá)或不足表達(dá))。本發(fā)明的多核苷酸可以例如置于任何內(nèi)源或外源調(diào)節(jié)物(如啟動(dòng)子)的控制下。重組蛋白衍生自重組DNA。至少一種目的多核苷酸可以從細(xì)胞分離或合成地產(chǎn)生。可以將這種核苷酸轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞。用于產(chǎn)生本發(fā)明任何肽的合適宿主細(xì)胞可以是任意的真核細(xì)胞或微生物，優(yōu)選地是細(xì)菌，最優(yōu)選地乳酸細(xì)菌如乳桿菌、乳球菌、雙歧桿菌、腸球菌、明串珠菌和鏈球菌，或丙酸桿菌、或酵母。如本文中所用，“轉(zhuǎn)化"指通過外來遺傳材料、優(yōu)選通過DNA遺傳地改變細(xì)胞， 從而導(dǎo)致這種遺傳材料的表達(dá)?？梢栽瓨拥貙?dǎo)入外來遺傳材料或?qū)⑵鋼饺肴魏纹渌z傳材料，如載體、質(zhì)粒等。任何基因工程方法或任何分子克隆方法可以用于以本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。存在多種導(dǎo)入外來材料至真核細(xì)胞中的方法。材料，如聚合物(例如， DEAE-葡聚糖或聚乙烯亞胺)、脂質(zhì)體和納米粒子(例如，金)已經(jīng)作為載體用于轉(zhuǎn)化。遺傳材料也可以通過使用例如病毒或載體作為載體導(dǎo)入細(xì)胞。用于導(dǎo)入外來材料至細(xì)胞中的其他方法包括但不限于核轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、接合法、轉(zhuǎn)染法、聲致穿孔法(sonoporation)、 熱休克法和磁轉(zhuǎn)染法(magnetofection)。多種轉(zhuǎn)染試劑(如磷酸鈣或脂轉(zhuǎn)染胺試劑)的使用是本領(lǐng)域熟知的。用于導(dǎo)入外來材料至細(xì)菌細(xì)胞中的優(yōu)選方法是電穿孔法。本發(fā)明的肽或菌毛結(jié)構(gòu)也可以由天然表達(dá)該肽或菌毛結(jié)構(gòu)的細(xì)胞產(chǎn)生。在天然細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞已經(jīng)在適宜條件下產(chǎn)生本發(fā)明的肽后，可以例如從細(xì)胞中純化該肽或可以回收分泌形式的肽，例如，從培養(yǎng)基回收。為了純化該肽，可以例如通過超聲處理、輻射、加熱、裂解、機(jī)械攪拌(剪切)、酶方法、‘cell pomb'或化學(xué)試劑 (低滲休克、去垢劑和溶劑)或其混合物破壞細(xì)胞。肽或菌毛結(jié)構(gòu)可從正在生長或有代謝活性的生物，即活生物和/或凍干生物，或無活力的生物，例如，熱殺死、照射或裂解的生物獲得。肽或菌毛結(jié)構(gòu)可從死細(xì)胞或活細(xì)胞獲得。肽或菌毛結(jié)構(gòu)可以在一個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生并且隨后展示在相同的細(xì)胞上，或該肽或菌毛結(jié)構(gòu)可以在除了表面上展示該肽或菌毛結(jié)構(gòu)的細(xì)胞之外的另一個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生。任何已知方法如免疫法可以用于產(chǎn)生針對(duì)本發(fā)明肽的抗體?？梢葬槍?duì)所述肽的任何表位或功能域產(chǎn)生抗體并且這些抗體可以單克隆或多克隆的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體是多克隆的(圖3)。如本文中所用，“肽的功能域”指該肽的具有生物學(xué)功能的任何部分。治療細(xì)菌，一大類單細(xì)胞微生物，在真核生物如人、動(dòng)物和植物中引起多種疾病。然而， 僅在近年來菌毛在重要病原體表面上的存在引起研究者當(dāng)中的興趣。因?yàn)镚IT及其小型生物群影響受試者的健康，所以細(xì)菌菌毛的利用強(qiáng)化了新療法。本發(fā)明的肽、菌毛結(jié)構(gòu)或多核苷酸可以用于治療或預(yù)防由微生物如細(xì)菌或病毒所致或由任何其他原因如失衡營養(yǎng)、壓力生活方式或遺傳素質(zhì)所致疾病的方法中?？捎帽景l(fā)明的肽、菌毛結(jié)構(gòu)、多核苷酸或用本發(fā)明藥品預(yù)防或治療的疾病或不適包括但不限于腹瀉如旅行者腹瀉、動(dòng)脈性高血壓、血管病、變態(tài)反應(yīng)、特應(yīng)性疾病、尿道感染、呼吸道感染、齲齒、腸易激綜合征、炎性腸病，以及治療輕微腸不適以及增強(qiáng)/促進(jìn)個(gè)體總體健康。本發(fā)明的組合物也用于預(yù)防和治療胃腸病癥和疾病，并用于促進(jìn)總體健康。所述病癥或疾病優(yōu)選地選自由粘膜炎癥、腸通透性紊亂、IBD、IBS 和其他胃腸病癥組成的組。在本發(fā)明的特別實(shí)施方案中，肽或菌毛結(jié)構(gòu)作為疫苗使用(免疫應(yīng)答)。減少或抑制致病菌黏附于受試者GIT的方法導(dǎo)致預(yù)防或緩解由該病原體所致的癥狀。病原體因本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)的競(jìng)爭從GIT的上皮或表面逐出。本申請(qǐng)的實(shí)施例11 描述了用LGG菌毛蛋白逐出有害致病菌的競(jìng)爭測(cè)定法。待逐出的優(yōu)選病原體包括但不限于大腸桿菌、沙門氏菌、芽孢桿菌、擬桿菌、利斯特菌、葡萄球菌、腸球菌、梭菌和鏈球菌。如本文中所用，“致病菌”指引起任何疾病或任何有害作用的任意細(xì)菌。如本文中所用，“黏附” 指至少兩個(gè)分子或結(jié)構(gòu)因化學(xué)或物理結(jié)合/力或無這些結(jié)合/力情況下彼此錨定。不同類型的黏附，如機(jī)械黏附、化學(xué)黏附、分散性黏附(dispersive adhesion)、靜電黏附和擴(kuò)散黏附，是已知的。黏附可以是可逆或不可逆的事件，但是在生物化學(xué)系統(tǒng)中，黏附通常是可逆的。獎(jiǎng)腸球菌(Enterococcus faecalis)禾口屎腸球菌(Enterococcus faecium)是新出現(xiàn)醫(yī)院內(nèi)感染病原體的腸細(xì)菌，包括高度抵抗臨床重要的抗生素萬古霉素的萬古霉素抗性腸球菌(VRE) (de Regt，M. J.等人，2008，J Antimicrob Chemother. 62 (6) 1401-1406)。這些物種屬于引起住院患者中血液、手術(shù)部位和腸道感染的醫(yī)院內(nèi)感染的前三位細(xì)菌病原體(Richards，M. J 等人，2000，Infect Control Hosp Epide-miol 21: 510-51 。腸球菌可以引起類型廣泛的疾病尿道感染、菌血癥、敗血癥、心內(nèi)膜炎、傷口和組織感染、腹內(nèi)和盆腔感染(Kayser，F(xiàn). H.等人 2003，Int J Food Microbiol88 (2_3) 255- ，并且感染手術(shù)部位，尤其在植入裝置存在的情況下(Baldassarri L等人， 2005，Int J Artif Organs 28(11) :1101-1109)以及引起腦膜炎(Pintado V 等人，2003， Medicine (Baltimore). 82 (5) :346-64)、慢性根尖牙周炎(Hancock H. H 等人，2001. Oral Surg Oral Med Oral pathol91 :579-586)和尖周損害(Sunde PT 等人，2002，J Endod 28 304-310)。近來，已經(jīng)描述屎腸球菌分離株含有位于表面的菌毛，并且值得注意地，絕大部分 (71%)的醫(yī)院獲得的屎腸球菌菌株和重要部分(43%)的非醫(yī)院的屎腸球菌菌株含有菌毛基因(Hendricks AP 等人，2008，Microbiologyl54 :3212-3223)。在一項(xiàng)雙盲和安慰劑作對(duì)照的研究中，已經(jīng)描述鼠李糖乳桿菌GG的消費(fèi)有效地清除來自VRE陽性患者中感染的腸球菌(Manley K. J等人，2007 Med J Aust. 186(9) =454-457) 含有菌毛的鼠李糖乳桿菌GG 與VRE之間競(jìng)爭的分子證據(jù)源自結(jié)合研究，該研究表明鼠李糖乳桿菌對(duì)人胃腸黏液的結(jié)合作用比抗萬古霉素的屎腸球菌高20-130倍(Pultz N. J等人，2006Curr Microbiol. 52(3) 221-224)。令人驚奇地，在本發(fā)明的結(jié)合測(cè)定法中，純化的His標(biāo)簽標(biāo)記的LGG蛋白SpaA、 SpaB和SpaC抑制病原體例如抗萬古霉素屎腸球菌與黏液的結(jié)合。減低或抑制致病菌對(duì)受試者胃腸道、對(duì)其上皮或?qū)ζ湔骋吼じ降姆椒梢园ㄒ韵虏襟Ei)產(chǎn)生至少一種本發(fā)明肽或其片段或菌毛結(jié)構(gòu)；ii)在細(xì)胞或黏液上展示該肽、片段和/或菌毛結(jié)構(gòu)。除減少有害或致病菌的粘附之外，本發(fā)明還提供促進(jìn)有益細(xì)胞或其他物質(zhì)如酶、 重組細(xì)胞、微膠囊、納米膠囊或藥物與GIT黏附的可能性。促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞與黏液和與GIT黏附的方法或本發(fā)明肽或菌毛結(jié)構(gòu)用于促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞黏附于腸粘液的用途涉及新肽或菌毛結(jié)構(gòu)在體內(nèi)、離體或體外黏附于GIT的令人驚奇的能力。所述菌毛肽或菌毛結(jié)構(gòu)作為將細(xì)胞或任何其他物質(zhì)如藥物、酶、微生物、重組細(xì)胞、微膠囊、納米膠囊與GIT連接的工具而發(fā)揮作用。調(diào)節(jié)受試者中免疫應(yīng)答的方法和所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的用途基于出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即本發(fā)明的肽或菌毛結(jié)構(gòu)引起免疫應(yīng)答的變化。免疫應(yīng)答指針對(duì)身體、 離體或體外系統(tǒng)中抗原的應(yīng)答或指針對(duì)另一種調(diào)節(jié)物的應(yīng)答。這種應(yīng)答可以由淋巴細(xì)胞和 /或由特異性抗體識(shí)別抗原所介導(dǎo)。免疫應(yīng)答的一個(gè)目的是摧毀抗原(其通常為外源)或中和之。如本文中所用，“調(diào)節(jié)"指免疫應(yīng)答的任何變動(dòng)，如增加或減少。免疫應(yīng)答的變動(dòng)可以通過任何合適的醫(yī)學(xué)、生理學(xué)或生物學(xué)試驗(yàn)監(jiān)測(cè)，所述的試驗(yàn)包括但不限于這些試驗(yàn)，它們基于檢測(cè)信號(hào)途徑的激活以及檢測(cè)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯水平或蛋白質(zhì)(例如抗體或受體)的量。目前，不存在可用于確定細(xì)胞或生物中免疫應(yīng)答的單一標(biāo)記。然而，優(yōu)選的標(biāo)記包括但不限于腫瘤壞死因子α (TNF-α)、白細(xì)胞介素12(IL_12)、IL_10、IL-I β和干擾素 a (IFN- a )。其他可能的標(biāo)記是 IL-1 a、IL-6、IL-18、IFN- y、IL-4、TGF- β、IL-1 Ra和IL-18BP。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記選自由TNF-α、Thl細(xì)胞因子、IL-10和 IL-12組成的組。TNF-α 是炎性細(xì)胞因子(Bertazza L 和 Mocellin S. 2008, Front Biosci. 13 2736-43)，其激活免疫系統(tǒng)并啟動(dòng)炎癥反應(yīng)以對(duì)抗感染。TNF-α也隨IL-6和INF-γ —起介導(dǎo)炎癥的全身作用，如發(fā)熱和合成急性期蛋白。適宜量的TNF-α以及其他促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生對(duì)于消除感染是重要的。然而，不適宜或過多量的促炎細(xì)胞因子，如TNF-α，已經(jīng)與病理生理狀況如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、椎關(guān)節(jié)炎、眼色素層炎、銀屑病和炎性腸病關(guān)聯(lián)。與IFN-Y 一樣，TNF-α也是Thl型細(xì)胞因子之一，并且因此它激活巨噬細(xì)胞并抑制B細(xì)胞并且因而促進(jìn)Thl型免疫。TNF-α也參與肥大細(xì)胞活化，并且因此參與變態(tài)反應(yīng)。Thl型應(yīng)答導(dǎo)致細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。Thl型應(yīng)答協(xié)調(diào)針對(duì)胞內(nèi)病原體的宿主應(yīng)答并且在激活吞噬細(xì)胞和促進(jìn)微生物殺傷方面發(fā)揮中心作用，這在不同的感染(如呼吸道感染和胃腸感染如腹瀉)中是重要的。Thl型應(yīng)答在也在平衡變態(tài)反應(yīng)中的免疫應(yīng)答方面是重要-在變態(tài)反應(yīng)中，免疫應(yīng)答偏向Th2型應(yīng)答，導(dǎo)致超敏反應(yīng)，并且刺激Thl型免疫應(yīng)答的物質(zhì)可以平衡這種情況?？梢詮娜魏紊飳W(xué)樣品或受試者通過體外、離體或體內(nèi)試驗(yàn)檢查免疫應(yīng)答的變動(dòng)。益生性菌株的特性可以在細(xì)胞培養(yǎng)(體外)中利用例如外周血單核細(xì)胞(PBMC)、人單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞進(jìn)行研究。離體實(shí)驗(yàn)的實(shí)例包括確定嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬作用、突發(fā)性氧化作用，即嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的超氧化物產(chǎn)生、NK細(xì)胞活性、淋巴細(xì)胞增殖和外周血單核細(xì)胞、單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)包括但不限于確定針對(duì)疫苗的應(yīng)答(例如疫苗特異性抗體或疫苗特異性抗體形成細(xì)胞)，遲發(fā)型超敏反應(yīng)和針對(duì)減毒病原體的應(yīng)答。作為益生作用的備選，本發(fā)明的肽或菌毛結(jié)構(gòu)可以在細(xì)胞或受試者中引起任何其他作用。這些其他作用也可以相對(duì)于益生作用單獨(dú)或額外地出現(xiàn)。益生作用可以是其他免疫調(diào)節(jié)物和肽或菌毛結(jié)構(gòu)的組合。在本發(fā)明，用于治療或預(yù)防的受試者可以是任何真核生物，優(yōu)選地是人或動(dòng)物，特別是寵物和生產(chǎn)動(dòng)物。所述動(dòng)物可以選自由生產(chǎn)動(dòng)物和寵物組成的組，如奶牛、馬、豬、山羊、綿羊、家禽、狗、貓、兔、爬行動(dòng)物和蛇。篩選方法本發(fā)明的任何多核苷酸或其任意片段可以用于篩選具有相似菌毛結(jié)構(gòu)的細(xì)菌菌株。在篩選細(xì)菌菌株的方法中，可以例如通過基于PCR的方法，如常規(guī)PCR和測(cè)序法或微型測(cè)序法；雜交方法，如DNA印跡雜交或RNA印跡雜交；使用不同程序及參數(shù)的任何生物信息學(xué)方法；和通過使用針對(duì)本發(fā)明肽的抗體的任何基于抗體的方法、流式細(xì)胞術(shù)、免疫沉淀法、免疫共沉淀法、免疫組織化學(xué)、免疫熒光法、ELISA和ELIS-POT技術(shù)確定至少一種編碼菌毛肽或其片段的多核苷酸或其片段。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用基于LGG菌毛基因設(shè)計(jì)引物，通過PCR篩選具有菌毛結(jié)構(gòu)的新細(xì)菌菌株。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用本發(fā)明LGG基因的擴(kuò)增產(chǎn)物作為探針，通過DNA印跡雜交篩選具有菌毛結(jié)構(gòu)的新細(xì)菌菌株。在用于篩選本發(fā)明多核苷酸的同源序列或片段的方法中優(yōu)選引物或探針的嚴(yán)格雜交條件。如本文中所用，“同源序列”或“具有高同一性的序列”指與另一個(gè)序列可以相同或但不必相同的序列。然而，這些序列是相似的并且它們具有高同一性％?！吧飳W(xué)適合片段”指相似的序列或具有超過35%同一性百分?jǐn)?shù)和超過50個(gè)氨基酸長度的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過計(jì)算方法從現(xiàn)存或新建立的序列表或數(shù)據(jù)庫中篩選具有菌毛結(jié)構(gòu)的新細(xì)菌菌株和聯(lián)種群。待篩選的樣品可以取自任何生物或任何物質(zhì)，并且可以是例如細(xì)菌培養(yǎng)物、組織樣品、血樣(血清或血漿樣品)、食物樣品或環(huán)境樣品。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，待篩選的細(xì)菌菌株是潛在的益生性細(xì)菌菌株。就本發(fā)明的篩選方法而言，可以檢測(cè)與致病性細(xì)菌菌株或包含已知致病性組分的細(xì)菌菌株相關(guān)的菌株。此類菌株可以包含這樣的序列，其具有在功能上與本發(fā)明序列如與 SEQ ID NO 4(GG00444)相對(duì)應(yīng)的片段，和至少35%至100%序列同一性，或包含本發(fā)明的多核苷酸，如包含SEQ ID N012的多核苷酸或其簡并序列形式，或編碼本發(fā)明的肽。在本發(fā)明中，篩選可以在體內(nèi)、體外、在計(jì)算機(jī)上或離體條件下實(shí)施。本發(fā)明由以下實(shí)施例說明，所述實(shí)施例無論如何不意圖是限制性的。實(shí)施例1.重組LGG菌毛蛋白的克隆、表達(dá)和純化使用側(cè)翼5'-末端和3'末端寡核苷酸引物對(duì)(一條引物含有EcoRI位點(diǎn)(對(duì)于GG02372，&icl位點(diǎn))并且另一條引物帶Biol位點(diǎn)(見表1))從LGG基因組DNA中PCR 擴(kuò)增 SpaA (GG00442)、SpaB (GG00443)、SpaC (GG00444)、SpaD (GG02370)、SpaE (GG02371)和 SpaF(GG02372)的編碼序列，不包括編碼N端信號(hào)肽和C端細(xì)胞壁分選信號(hào)(CWSQ的區(qū)域。 擴(kuò)增的PCR片段用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI (或?qū)τ贕G02372，Sacl)和Biol切割，隨后連接到受T7調(diào)節(jié)的表達(dá)載體pET28b+中的相應(yīng)位點(diǎn)中，并且所得重組質(zhì)粒(對(duì)于GG00442， PKTH5319 ；對(duì)于 GG00443，pKTH5320 ；對(duì)于 GG00444，pKTH5321 ；對(duì)于 GG02370，pKTH5324 ； 對(duì)于GG02371，pKTH5379 ；并且對(duì)于GG02372，pKTH5341)在用于表達(dá)胞內(nèi)C端六組氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)的大腸桿菌菌株BL21(DE3)pLysS中增殖。在使用標(biāo)準(zhǔn)方案的全部DNA操作中使用已建立的方法。為了蛋白質(zhì)生產(chǎn)，將大腸桿菌在37°C于補(bǔ)充有50μ g/ml卡那霉素的 Luria-Bertani培養(yǎng)基中培育至對(duì)數(shù)中期，通過ImM IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)3小時(shí)，通過離心收獲細(xì)胞，并且將細(xì)胞沉淀重懸于裂解緩沖液[50mM NaH2PO4(pH 8. 0), 300mM NaCl,10mM 咪唑]中。通過超聲處理破壞細(xì)胞，通過離心澄清，并且將無細(xì)胞的裂解物通過0.45 μ m濾器。隨后通過Ni2+螯合的親和層析法純化加6組氨酸標(biāo)簽的菌毛蛋白。簡言之，將無細(xì)胞的裂解物分別施加至Ni-NTA瓊脂糖柱(Qiagen)，用洗滌緩沖液[50mM NaH2PO4 (pH 8.0)， 300mM NaCl，20mM咪唑]洗滌，并且蛋白質(zhì)用洗脫緩沖液[50mM NaH2PO4 (pH 8. 0), 300mM NaCl,250mM咪唑]從該柱洗脫。將含有純化蛋白質(zhì)的柱級(jí)分匯集，對(duì)于SpaA(GG00442)、 SpaC (GG00444)、SpaD (GG02370)、SpaE (GG02371)和 SpaF(GG02372)蛋白而言，使用 BioRad EconoPac IODG脫鹽柱針對(duì)IOmM Tris-HCl(pH 8. 0)進(jìn)行緩沖液交換，并且對(duì)于 SpaB(GG00443)蛋白而言，針對(duì)50mM乙酸鈉(pH 5. 1)進(jìn)行緩沖液交換，并且使用30kDa Micros印濾器(Pall Life Sciences)濃縮。通過SDS-PAGE監(jiān)測(cè)重組菌毛蛋白的純度并且通過A28tl量值估計(jì)蛋白質(zhì)濃度。實(shí)施例2.重組LGG菌毛蛋白特異性多克隆抗體的產(chǎn)生牛艮據(jù) Johnston B. Α.等人(1991, Laboratory of Animal Science 41 :15-21)描述的免疫方案產(chǎn)生對(duì) SpaA(GG00442)、SpaB(GG00443)、SpaC(GG00444)、SpaD(GG02370)、 SpaE(GG02371)和SpaF(GG0237》菌毛蛋白特異的兔多克隆抗體。簡述之，起初施用皮下 (SC)注射(lml)400yg純化的重組菌毛蛋白在弗氏完全佐劑中的1 1混合物，隨后以3 周間隔三次加強(qiáng)注射(SC)200yg蛋白質(zhì)在弗氏不完全佐劑中的1 1混合物。最后加強(qiáng)注射后兩周進(jìn)行終末血液收集。使用標(biāo)準(zhǔn)方案實(shí)施從該血液制備抗血清。
權(quán)利要求
1.肽，其包含與SEQID NO 4(GG00444)具有至少91 %序列同一性的序列或其片段或變體。
2.肽，其包含與SEQID NO 1 (GG00441)具有至少94%序列同一性的序列或其片段或變體。
3.肽，其包含與SEQID NO 2 (GG00442)具有至少94%序列同一性的序列或其片段或變體。
4.肽，其包含與SEQID NO 3 (GG00443)具有至少84%序列同一性的序列或其片段或變體。
5.肽，其包含與SEQID NO 5 (GG02369)具有至少83%序列同一性的序列或其片段或變體。
6.肽，其包含與SEQID NO 6 (GG02370)具有至少94%序列同一性的序列或其片段或變體。
7.肽，其包含與SEQID NO 7(GG02371)具有至少93%序列同一性的序列或其片段或變體。
8.肽，其包含與SEQID NO 8 (GG02372)具有至少93%序列同一性的序列或其片段或變體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1和3-4和/或6-8任一項(xiàng)所述的肽，其中該肽是菌毛結(jié)構(gòu)的一部分。
10.菌毛結(jié)構(gòu)，其包含根據(jù)權(quán)利要求1和3-4和/或6-10任一項(xiàng)所述的至少一種肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的菌毛結(jié)構(gòu)，其包含根據(jù)權(quán)利要求1和3-4所述的肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的菌毛結(jié)構(gòu)，其包含根據(jù)權(quán)利要求6-8所述的肽。
13.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的肽或菌毛結(jié)構(gòu)，其是重組的。
14.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的肽或菌毛結(jié)構(gòu)，其來自細(xì)菌。
15.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的肽或菌毛結(jié)構(gòu)，其來自鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus)0
16.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的肽或菌毛結(jié)構(gòu)，其來自鼠李糖乳桿菌GG(LGG)菌株。
17.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的肽或菌毛結(jié)構(gòu)，其與胃腸道結(jié)合。
18.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的肽或菌毛結(jié)構(gòu)，其與黏液結(jié)合。
19.產(chǎn)品，包含根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的產(chǎn)品，其是食品或飼料產(chǎn)品。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的食品，其中該食品選自由奶產(chǎn)品、烘焙產(chǎn)品、巧克力和甜食、糖和口香糖、谷物產(chǎn)品、小吃、基于漿果或水果的產(chǎn)品和飲料/飲品組成的組。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的食品，其中該食品選自由乳、酸乳、酸奶、奶酪與spreads、 乳粉、兒童食品、嬰兒食品、學(xué)步兒童食品、嬰兒配方食品、果汁和湯組成的組。
23.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)。
24.產(chǎn)品，其包含作為藥物使用的根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)的產(chǎn)品，其用于預(yù)防或治療腹瀉、動(dòng)脈性高血壓、血管病、變態(tài)反應(yīng)、癌癥、特應(yīng)性疾病、病毒病、傳染病、尿道感染、呼吸道感染、齲齒、腸易激綜合征、炎性腸病、粘膜炎癥、腸通透性紊亂、肥胖癥、代謝綜合征、 氧化性應(yīng)激或腹痛。
26.根據(jù)權(quán)利要求18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)在制造藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防或治療腹瀉、動(dòng)脈性高血壓、血管病、變態(tài)反應(yīng)、癌癥、特應(yīng)性疾病、病毒病、傳染病、尿道感染、呼吸道感染、齲齒、腸易激綜合征、炎性腸病、粘膜炎癥、腸通透性紊亂、肥胖癥、代謝綜合征、氧化性應(yīng)激或腹痛。
27.多核苷酸，其包含SEQID NOs 9_16任一者的序列或其簡并序列或編碼根據(jù)權(quán)利要求1-9或13-18任一項(xiàng)所述的肽。
28.載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求27所述的多核苷酸。
29.宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求27所述的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的肽。
30.基因簇，其包含根據(jù)權(quán)利要求27所述的至少一種多核苷酸。
31.抗體，其針對(duì)根據(jù)權(quán)利要求1-9或13-18任一項(xiàng)所述的肽的任一種或針對(duì)它們的功能域。
32.用于治療或預(yù)防腹瀉、動(dòng)脈性高血壓、血管病、變態(tài)反應(yīng)、癌癥、特應(yīng)性疾病、病毒病、傳染病、尿道感染、呼吸道感染、齲齒、腸易激綜合征、炎性腸病、粘膜炎癥、腸通透性紊亂、肥胖癥、代謝綜合征、氧化性應(yīng)激或腹痛的方法，包括對(duì)受試者施用根據(jù)權(quán)利要求1-18 任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)。
33.篩選包含SEQID NOs 9_16的至少一種多核苷酸或其片段的細(xì)菌菌株的方法，其中該方法包括i)提供來自細(xì)菌菌株的DNA或RNA;ii)將對(duì)SEQID NOs 9-16的多核苷酸或其片段特異的引物或探針與來自步驟i)的 DNA或RNA雜交并任選地?cái)U(kuò)增該多核苷酸或其片段；iii)檢測(cè)與SEQID NOs 9-16的多核苷酸或其片段同源的至少一種多核苷酸或其片段。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的SEQID NOs 9_16的至少一種多核苷酸或其片段或至少一種抗體用于篩選細(xì)菌菌株的用途。
35.使用根據(jù)權(quán)利要求31的至少一種抗體篩選包含根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)的細(xì)菌菌株的方法，其中該方法包括i)提供細(xì)菌菌株的蛋白質(zhì)； )使用所述一種或多種抗體檢測(cè)至少一種多肽、菌毛結(jié)構(gòu)或其片段。
36.根據(jù)權(quán)利要求33或35所述的方法或根據(jù)權(quán)利要求34所述的用途，其中細(xì)菌菌株是益生性的。
37.減低或抑制致病菌對(duì)受試者胃腸道、對(duì)其上皮或?qū)ζ漯ひ吼じ降姆椒?，其中該方法包括?duì)受試者施用根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽和/或菌毛結(jié)構(gòu)。
38.根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽和/或菌毛結(jié)構(gòu)用于減低或抑制致病菌對(duì)受試者胃腸道、對(duì)其上皮或?qū)ζ漯ひ吼じ降挠猛尽?br> 39.促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞黏附于或任何其他物質(zhì)黏附于黏液或上皮的方法，其中該方法包括i)產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)或其片段； )在細(xì)菌細(xì)胞上或任何其他物質(zhì)上展示該肽、菌毛結(jié)構(gòu)和/或其片段； iii)使所述細(xì)菌細(xì)胞或任何其他物質(zhì)與黏液或上皮接觸。
40.根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)用于促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞或任何其他物質(zhì)黏附于黏液或上皮的用途。
41.調(diào)節(jié)受試者中免疫應(yīng)答的方法，其中該方法包括i)產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)或其片段； )在宿主細(xì)胞上展示該肽、菌毛結(jié)構(gòu)和/或其片段； iii)任選地使該宿主細(xì)胞與另一個(gè)宿主細(xì)胞接觸。
42.根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)用于調(diào)節(jié)受試者中免疫應(yīng)答的用途。
43.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求19-22任一項(xiàng)所述的產(chǎn)品的方法，其中該方法包括對(duì)該產(chǎn)品產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)的步驟。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中該方法包括添加根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)至該產(chǎn)品。
45.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)的方法，其中該方法包括以下步驟i)提供根據(jù)權(quán)利要求27所述的至少一種多核苷酸； )用所述多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；iii)培養(yǎng)來自步驟ii)的宿主細(xì)胞以產(chǎn)生所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)；iv)任選地回收所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)。
46.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)的方法，其中該方法包括以下步驟i)破壞產(chǎn)生或包含根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽或菌毛結(jié)構(gòu)的細(xì)胞； )任選地回收所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述細(xì)胞是死細(xì)胞或活細(xì)胞。
48.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-9或13-18任一項(xiàng)所述的至少一種肽的方法，其中該方法包括以下步驟i)提供氨基酸； )通過合成至少一種肽從步驟i)的氨基酸制造本發(fā)明的至少一種肽。
49.通過使用生物信息學(xué)方法檢測(cè)潛在的益生性細(xì)菌菌株的方法，其中該方法包括以下步驟i)提供根據(jù)權(quán)利要求1-9、13-18或27所述的至少一種肽、多核苷酸或其片段的序列； )將步驟i)的序列針對(duì)序列集合的序列進(jìn)行比較； iii)檢測(cè)與步驟i)的序列具有生物學(xué)適合片段的序列。
50.通過使用生物信息學(xué)方法檢測(cè)根據(jù)權(quán)利要求1-18所述的肽或菌毛結(jié)構(gòu)有效針對(duì)的病原菌株的方法，其中該方法包括i)提供根據(jù)權(quán)利要求1-9、13-18或27所述的至少一種肽、多核苷酸或其片段的序列； )將步驟i)的序列針對(duì)序列集合的序列進(jìn)行比較；iii)檢測(cè)與步驟i)的序列具有生物學(xué)適合片段的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及生命科學(xué)和食品、飼料或制藥工業(yè)。具體而言，本發(fā)明涉及新的肽、菌毛結(jié)構(gòu)、多核苷酸以及包含所述多核苷酸、肽或菌毛結(jié)構(gòu)的載體、宿主細(xì)胞、產(chǎn)品和藥物組合物。本發(fā)明也涉及基因簇和抗體。另外，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)或產(chǎn)生包含所述肽或菌毛結(jié)構(gòu)的產(chǎn)品的方法。另外，本發(fā)明涉及用于篩選細(xì)菌菌株、用于減低或抑制致病菌黏附、促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞黏附于黏液和用于調(diào)節(jié)受試者中免疫應(yīng)答的治療以及用途和方法。再者，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)益生細(xì)菌菌株或病原菌株的方法。
文檔編號(hào)G01N33/48GK102317311SQ201080006238
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2010年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月2日
發(fā)明者A·帕爾瓦, I·馮奧索夫斯基, I·帕爾瓦, J·雷烏納寧, M·坎凱寧, R·薩托卡里, S·廷屈寧, S·韋斯特隆德, T·薩盧斯耶爾維, W·M·德福斯 申請(qǐng)人:維利奧有限公司