專利名稱：一種奶油中達(dá)氟沙星定性快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種奶油中達(dá)氟沙星定性快速檢測(cè)的方法，特別涉及使用萃取技術(shù)結(jié)合達(dá)氟沙星金標(biāo)試紙條的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
達(dá)氟沙星作用機(jī)制為抑制細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶(desoxyribonucleic acid gyrase)， 從而影響DNA的正常形態(tài)與功能，阻礙DNA的正常復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運(yùn)與重組，從而產(chǎn)生快速殺菌作用，長期以來一直被廣泛使用。但食品質(zhì)量安全中，抗生素濫用一直是一個(gè)關(guān)注的焦點(diǎn)ο目前，有多種檢測(cè)達(dá)氟沙星的方法，例如液相質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫法、試紙條法，其中試紙條法檢測(cè)成本最低、操作最簡單且檢測(cè)時(shí)間最短，但是目前只有液相質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫法可以檢測(cè)奶油，試紙條法由于其本身固有的特性，一直無法進(jìn)行奶油中達(dá)氟沙星檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種奶油中達(dá)氟沙星定性快速檢測(cè)的方法，其簡便易行并且適用于規(guī)模化初篩達(dá)氟沙星超標(biāo)的奶油。本發(fā)明提供了一種奶油中達(dá)氟沙星定性快速檢測(cè)方法，其包括
(1)使用純水，或確定不含有達(dá)氟沙星或其分解酶的復(fù)原乳萃取奶油中的達(dá)氟沙星；
(2)使用達(dá)氟沙星試紙條檢測(cè)純水或復(fù)原乳中的達(dá)氟沙星含量。在一種奶油中達(dá)氟沙星定性快速檢測(cè)方法的再一種示意性的實(shí)施方式中，步驟 (1)中首先將奶油置于70°c的水浴鍋中完全熔融為液體，再將純水或復(fù)原乳添加到熔融為液體的奶油中渦旋混勻得到混合液，將混合液放入冷凍離心機(jī)離心得到萃取清液。在一種奶油中達(dá)氟沙星定性快速檢測(cè)方法的另一種示意性的實(shí)施方式中，渦旋混勻的時(shí)間為5秒，渦旋速度為2500轉(zhuǎn)/分。冷凍離心機(jī)的操作條件為5000g，離心6分鐘， 離心溫度4°C。吸取IOOuL的萃取清液用于測(cè)試。在一種奶油中達(dá)氟沙星定性快速檢測(cè)方法的又一種示意性的實(shí)施方式中，復(fù)原乳中奶粉和純水的體積比為1:7。使用一種奶油中達(dá)氟沙星定性快速檢測(cè)的方法，操作簡單，檢測(cè)時(shí)間短，成本低， 適合于企業(yè)大規(guī)模使用。
具體實(shí)施例方式一種奶油中達(dá)氟沙星定性快速檢測(cè)方法，其包括
(1)使用純水，或確定不含有達(dá)氟沙星或其分解酶的復(fù)原乳萃取奶油中的達(dá)氟沙星；
(2)使用達(dá)氟沙星試紙條檢測(cè)純水或復(fù)原乳中的達(dá)氟沙星含量。使用純水萃取奶油中達(dá)氟沙星
由于達(dá)氟沙星的水溶性好于脂溶性，且達(dá)氟沙星是為數(shù)不多的熱穩(wěn)定性抗生素，因此決定使用70°C純水從奶油中抽提達(dá)氟沙星，具體步驟如下
A.分別吸取0.5mL奶油的樣品到1. 5mL離心管中，同時(shí)加入0. 5mL70°C純水；
B.渦旋混勻5秒，渦旋轉(zhuǎn)速2500轉(zhuǎn)/分，再放入70°C水浴鍋中，讓離心管中實(shí)驗(yàn)樣品始終保持在70°C左右；
C.在5分鐘內(nèi)，重復(fù)B操作3-5次，使純水與熔融的奶油充分混勻得到混合液，并讓 70°C純水將達(dá)氟沙星從奶油中充分抽提出來；
D.放入冷凍離心機(jī)，5000g，6分鐘，4°C離心；
E.去除上層奶油，得到萃取清液，吸取萃取清液IOOyL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用達(dá)氟沙星金標(biāo)試紙條檢測(cè)
吸取IOOul萃取清液和IOOul稀釋液加入加樣槽中，槍頭吹打混均后插入試紙條于加樣槽中，加樣后室溫孵育3分鐘時(shí)觀察結(jié)果。結(jié)果判斷
陰性(-):τ線(測(cè)試線，靠近樣品溶液的一端)比C線(質(zhì)控線)深或一樣深，表示牛奶樣品中達(dá)氟沙星濃度低于檢測(cè)限度(檢測(cè)限度為50μ g/kg)。陽性(+ ) :T線無顯色，表示牛奶中達(dá)氟沙星濃度高于檢測(cè)限度(檢測(cè)限度為 50 μ g/kg)ο無效未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過程或試劑卡已變質(zhì)失效。使用復(fù)原乳萃取奶油中達(dá)氟沙星 1)復(fù)原乳的制備
將奶粉和純水按1-J比例加入，渦旋混勻，得到復(fù)原乳。2)復(fù)原乳不含達(dá)氟沙星及其分解酶的檢測(cè)
在1. 5mL離心管中加入990 μ L復(fù)原乳和10 μ L、10mg/kg濃度達(dá)氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻，得到濃度為100yg/kg復(fù)原樣品。用現(xiàn)有的技術(shù)方法，例如酶聯(lián)免疫法，檢測(cè)復(fù)原樣品中達(dá)氟沙星的含量。結(jié)果判定
如果檢測(cè)到復(fù)原樣品中達(dá)氟沙星的含量大于100 μ g/kg，說明復(fù)原乳中含有達(dá)氟沙星， 此種奶粉及其復(fù)原乳不可用；
如果檢測(cè)到復(fù)原樣品中達(dá)氟沙星的含量小于100 μ g/kg，說明復(fù)原乳中含有達(dá)氟沙星分解酶，此種奶粉及其復(fù)原乳不可用；
如果檢測(cè)到復(fù)原樣品中達(dá)氟沙星的含量等于100 μ g/kg，說明復(fù)原乳中不含達(dá)氟沙星或達(dá)氟沙星分解酶，可以作為萃取奶油中的復(fù)原乳使用。3)萃取步驟
A.分別吸取0.5mL奶油的樣品到1. 5mL離心管中，同時(shí)加入0. 5mL70°C復(fù)原乳；
B.渦旋混勻5秒，渦旋轉(zhuǎn)速2500轉(zhuǎn)/分，再放入70°C水浴鍋中，讓離心管中實(shí)驗(yàn)樣品始終保持在70°C左右；
C.在5分鐘內(nèi)，重復(fù)B操作3-5次，使復(fù)原乳與熔融的奶油充分混勻得到混合液，并讓 70°C純水將達(dá)氟沙星從奶油中充分抽提出來；
D.放入冷凍離心機(jī)，5000g，6分鐘，4°C離心；
E.去除上層奶油，得到萃取清液，吸取萃取清液100μ L進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
4)使用達(dá)氟沙星金標(biāo)試紙條檢測(cè)
吸取IOOul萃取清液和IOOul稀釋液加入加樣槽中，槍頭吹打混均后插入試紙條于加樣槽中，加樣后室溫孵育3分鐘時(shí)觀察結(jié)果。5)結(jié)果判斷
陰性(-):τ線(測(cè)試線，靠近樣品溶液的一端)比C線(質(zhì)控線)深或一樣深，表示牛奶樣品中達(dá)氟沙星濃度低于檢測(cè)限度(檢測(cè)限度為50μ g/kg)。陽性(+ ) :T線無顯色，表示牛奶中達(dá)氟沙星濃度高于檢測(cè)限度(檢測(cè)限度為 50 μ g/kg)ο無效未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過程或試劑卡已變質(zhì)失效。檢測(cè)奶油中達(dá)氟沙星靈敏度實(shí)驗(yàn) 1)配置達(dá)氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液
稱取達(dá)氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度0. 999)粉末0. Olg,加入IOmL純水，配制成1000mg/kg濃度的達(dá)氟沙星溶液，依次10倍稀釋得到100mg/kg、10mg/kg和lmg/kg濃度達(dá)氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。2)制備梯度待測(cè)樣品
將確定不含有達(dá)氟沙星及其分解酶的奶油置于70°C水浴鍋中，完全融化為液體，添加達(dá)氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液到奶油中，制備得到濃度分別為0 μ g/kg、15 μ g/kg、25 μ g/kg、50 μ g/ kg、100 μ g/kg、200 μ g/kg、500 μ g/kg和1000 μ g/kg的待測(cè)樣品，將上述待測(cè)樣品渦旋混勻10秒。3)使用純水和復(fù)原乳萃取待測(cè)樣品中的達(dá)氟沙星
各達(dá)氟沙星濃度的待測(cè)樣品的萃取過程與實(shí)施例1和實(shí)施例2相同，在此不再贅述。4)使用達(dá)氟沙星金標(biāo)試紙條檢測(cè)及結(jié)果判斷
各達(dá)氟沙星濃度的待測(cè)樣品使用達(dá)氟沙星金標(biāo)試紙條的檢測(cè)過程與實(shí)施例1和實(shí)施例2相同，在此不再贅述。5)檢測(cè)結(jié)果
使用純水萃取奶油中的達(dá)氟沙星，其檢出限為50μ g/kg;使用復(fù)原乳萃取奶油中的達(dá)氟沙星，其檢出限為100yg/kg。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，純水或復(fù)原乳與達(dá)氟沙星試紙條的反應(yīng)特性不同。由于復(fù)原乳中含有大量的蛋白質(zhì)成分且這些蛋白成分會(huì)減緩復(fù)原乳與達(dá)氟沙星試紙條之間的反應(yīng)，由此導(dǎo)致在規(guī)定的檢測(cè)時(shí)間內(nèi)檢出限偏高。采用70°C純水萃取，奶油中達(dá)氟沙星檢出限為50 μ g/kg ；采用復(fù)原乳萃取，奶油中達(dá)氟沙星檢出限為100 μ g/kg。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定，奶油中達(dá)氟沙星殘留限量是100 μ g/kg。因此，以上兩種方法都符合國家標(biāo)準(zhǔn)，適合大量初篩奶油中達(dá)氟沙星。在本文中，“示意性”表示“充當(dāng)實(shí)例、例子或說明”，不應(yīng)將在本文中被描述為“示意性”的任何圖示、實(shí)施方式解釋為一種更優(yōu)選的或更具優(yōu)點(diǎn)的技術(shù)方案。 上文所列出的一系列的詳細(xì)說明僅僅是針對(duì)本發(fā)明的可行性實(shí)施例的具體說明， 它們并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實(shí)施例或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種奶油中達(dá)氟沙星定性快速檢測(cè)方法，其包括(1)使用純水，或確定不含有達(dá)氟沙星或其分解酶的復(fù)原乳萃取奶油中的達(dá)氟沙星；(2)使用達(dá)氟沙星試紙條檢測(cè)所述純水或所述復(fù)原乳中的達(dá)氟沙星含量。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其中所述步驟(1)中首先將所述奶油置于70°C的水浴鍋中完全熔融為液體，再將所述純水或所述復(fù)原乳添加到熔融為液體的所述奶油中渦旋混勻得到混合液，將所述混合液放入冷凍離心機(jī)離心得到萃取清液。
3.如權(quán)利要求2中所述的檢測(cè)方法，其中所述渦旋混勻的時(shí)間為5秒，渦旋速度為 2500轉(zhuǎn)/分。
4.如權(quán)利要求2中所述的檢測(cè)方法，其中所述冷凍離心機(jī)的操作條件為5000g離心6 分鐘、離心溫度4°C。
5.如權(quán)利要求2中所述的檢測(cè)方法，其中吸取IOOuL的所述萃取清液用于測(cè)試。
6.如權(quán)利要求1中所述的檢測(cè)方法，其中所述復(fù)原乳中奶粉和純水的體積比為1:7。
全文摘要
一種奶油中達(dá)氟沙星定性快速檢測(cè)方法，包括(1)使用純水、或確定不含有達(dá)氟沙星或其分解酶的復(fù)原乳萃取奶油中的達(dá)氟沙星；(2)使用達(dá)氟沙星試紙條檢測(cè)所述純水或所述復(fù)原乳中的達(dá)氟沙星含量。使用一種奶油中達(dá)氟沙星定性快速檢測(cè)的方法，操作簡單，檢測(cè)時(shí)間短，成本低，適合于企業(yè)大規(guī)模使用。
文檔編號(hào)G01N1/34GK102478576SQ201010564298
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者劉衛(wèi)星, 劉志楠, 劉曉川, 喻東威, 李梅, 薛志清, 趙源 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司