專(zhuān)利名稱：一種血清鐵含量的檢測(cè)方法及其專(zhuān)用標(biāo)準(zhǔn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血清鐵含量的檢測(cè)方法及其專(zhuān)用標(biāo)準(zhǔn)品。
背景技術(shù)：
鐵是人體正常生理過(guò)程中不可缺少的物質(zhì)，幾乎任何組織都含有鐵。缺鐵性貧血 是鐵缺乏最嚴(yán)重的疾病，血清鐵的檢測(cè)在臨床診斷過(guò)程起著重要的作用。早在1966年，國(guó) 際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(International Committee of Standardization inHaematology ICSH)開(kāi)始推進(jìn)血清鐵檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，1970年8月在慕尼黑ICSH第8次會(huì)議上達(dá)成 一致，隨后發(fā)表了血清鐵的推薦方法，推薦一種使用Bathophenanthroline sulfonate為 色原的參考方法，三氯乙酸為蛋白沉淀劑，鐵的標(biāo)準(zhǔn)濃度為ang/L，分光光度計(jì)上在535nm 波長(zhǎng)比色。1978年ICSH對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，蛋白沉淀的鹽酸濃度由1971年提出的2mol/ L降低為lmol/L，避免沉淀上清發(fā)生渾濁的情況發(fā)生。大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于色原 Bathophenanthroline sulfonate 來(lái)說(shuō)，亞鐵嗪(Ferrozine)靈敏度高 25%, Ferene 靈敏 度高50%。1990年ICSH推薦使用亞鐵嗪或i^erene做為色原，亞鐵嗪使用562nm波長(zhǎng)下比 色，F(xiàn)erene使用593nm波長(zhǎng)比色。美國(guó)臨床禾口實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)、會(huì)(clinical and laboratory standards instituet, CLSI))在1990年提出了使用亞鐵嗪為色原的分光光度法做為推薦標(biāo)準(zhǔn)方法，1998年確認(rèn) 將其做為標(biāo)準(zhǔn)方法。CLSI的標(biāo)準(zhǔn)方法與ICSH參考方法相同點(diǎn)是使用了相同的色原亞鐵嗪， 兩個(gè)機(jī)構(gòu)的方法均設(shè)置了蛋白沉淀的步驟。CLSI參考方法試劑組成與ICSH參考方法比較， 增加了兩個(gè)主要成分。其一是硫脲，作用是去除銅的干擾，其二是抗壞血酸，用于去除血紅 蛋白的干擾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種血清鐵含量的檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)A、通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和所需質(zhì)量的蛋白沉淀試 劑，將所需質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與所需質(zhì)量的蛋白沉淀試劑混勻，放置；離心，收集上清液，記 作上清液I ；B、通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的上清液I和所需質(zhì)量的色原試劑，將所需 質(zhì)量的上清液I與所需質(zhì)量的色原試劑混勻，離心，取上清液，記作上清液II ；C、在562nm波長(zhǎng)下檢測(cè)上清液II的吸光度值；D、以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，建立一元線性 回歸曲線，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的待測(cè)樣品，用所需質(zhì)量的待測(cè)樣品替換步 驟1)中的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照步驟1)中A-C的方法進(jìn)行檢測(cè)，得到待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的吸光度 值；根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中鐵的含量。
所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液的按照如下方法制備1)通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的鐵和所需質(zhì)量的水，將所需質(zhì)量的鐵用濃 鹽酸溶解后，加入所需質(zhì)量的水，得到高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液，所述鐵離子在所述高濃度鐵標(biāo) 準(zhǔn)貯備液中濃度為1. 0000mg/g ；2)通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的步驟1)得到的高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液和所 需質(zhì)量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶液，將所需質(zhì)量的步驟1)得到的高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備 液和所需質(zhì)量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶液混合，得到中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液，所述鐵離 子在所述中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液中的濃度為50. 0000 μ g/g ；3)通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的步驟2、得到的中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液和 所需質(zhì)量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶液，用所需質(zhì)量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶 液稀釋所需質(zhì)量的步驟2、得到的中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液；所述鐵離子在 所述標(biāo)準(zhǔn)溶液中的濃度為以下 6 種0. 2500ug/g、0. 5000ug/g、l. 0000ug/gU. 5000ug/g、 2.OOOOug/g 和 3. 000ug/g。所述步驟1)的步驟A中，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的量為2.00士O.Olg，所述蛋白沉淀試劑的量 為 2. 08士0. Olg ；所述步驟1)的步驟B中，上清液I的量為2. 04士0. Olg,所述色原試劑的量為 1. 14士0. Olg ；所述步驟2)中，所述待測(cè)樣品的量為2. 02士0. Olg ；所述步驟1)的步驟A中，所述放置的時(shí)間為15min，所述離心力為1500g，所述離心的時(shí)間為15min ；所述步驟1)的步驟B中，所述離心力為1500g，所述離心的時(shí)間為IOmin。所述蛋白沉淀試劑按照如下方法制備將抗壞血酸、濃度為500g/l的三氯乙酸水 溶液、濃度為6mol/l的鹽酸水溶液和水混合，所述抗壞血酸、所述三氯乙酸和所述濃度為 6mol/l的鹽酸水溶液的配比為5g 500g 33ml ；所述色原試劑按照如下方法制備將亞鐵嗪、濃度為4mol/l的三水醋酸鈉水溶液 和硫脲混合，所述亞鐵嗪、所述三水醋酸鈉和所述硫脲的配比為525mg 544. 4g 15g。所述標(biāo)準(zhǔn)品中，鐵為鐵標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM937。所述待測(cè)樣本為無(wú)HIV疾病、無(wú)梅毒疾病、無(wú)肝炎疾病、無(wú)溶血、無(wú)黃疸且非乳糜 的離體血清。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明提供的標(biāo)準(zhǔn)品，按照如下方法制備1)通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的鐵和所需質(zhì)量的水，將所需質(zhì)量的鐵用濃 鹽酸溶解后，加入所需質(zhì)量的，得到高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液，所述鐵離子在所述高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn) 貯備液中濃度為1. 0000mg/g ；2)通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的步驟1)得到的高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液和所 需質(zhì)量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶液，將所需質(zhì)量的步驟1)得到的高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備 液和所需質(zhì)量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶液混合，得到中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液，所述鐵離 子在所述中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液中的濃度為50. 0000 μ g/g ；
3)通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的步驟幻得到的中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液和 所需質(zhì)量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶液，用所需質(zhì)量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶 液稀釋所需質(zhì)量的步驟幻得到的中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液；所述鐵離子在 所述標(biāo)準(zhǔn)溶液中的濃度為以下 6 種0. 2500ug/g、0. 5000ug/g、l. 0000ug/gU. 5000ug/g、 2.OOOOug/g 和 3. 000ug/g。
所述標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)血清鐵含量中的應(yīng)用。上述濃鹽酸為質(zhì)量百分含量為36% -38%的濃鹽酸。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)品和方法檢測(cè)血清鐵的含量，用血清鐵亞鐵 嗪分光光度比色法SRM3U6a，平均偏倚為0. 39%，混合血清加入SRM3126a的平均回收率為 101. 09%，均在可接受范圍內(nèi)，由此證明目前所復(fù)現(xiàn)的血清鐵亞鐵嗪分光光度比色準(zhǔn)確可罪。在精密度實(shí)驗(yàn)中，本研究選取了 3個(gè)不同濃度水平的混合血清，進(jìn)行批內(nèi)、批間檢 測(cè)，總CV均小于1%，達(dá)到國(guó)際上對(duì)血清鐵亞鐵嗪參考方法的要求。線性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，據(jù)報(bào)道線性達(dá)3. 0mg/L。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果達(dá)到12 μ g/g(即為l^ig/L)， 0. lmol/L鹽酸的密度為lg/L。比色杯空白吸光度相差不超過(guò)0. 001。顯色物質(zhì)亞鐵嗪的穩(wěn)定性高，反應(yīng)10分鐘 內(nèi)無(wú)變化。加樣采用精密分析天平稱量，避免體積加樣的誤差。本發(fā)明的方法檢測(cè)限低，線 性高，精密度、準(zhǔn)確度均能滿足臨床需要，費(fèi)用相對(duì)較低。


圖1為血清鐵亞鐵嗪參考方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2為血清鐵亞鐵嗪參考方法線性范圍
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、一、儀器、設(shè)施1.紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)UVM50 日本島津公司生產(chǎn)。北京市計(jì)量局每年校對(duì)檢 測(cè)一次，每天使用前自檢。2.去離子水凈化裝置北京雙峰純水設(shè)備有限公司，用于去離子水的制備。3.精密天平賽多利斯Sartorius精密分析天平，型號(hào)BSA224S-CW，精度0. Imgo 用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、血清樣品的稱量；參考方法試劑原料稱量；容量瓶的內(nèi)校。北京市計(jì)量局每 年校對(duì)檢測(cè)一次，每月一次內(nèi)校。4. Eppendorf Reference移液器200 μ L, 1000 μ L, 5000 μ L,北京市計(jì)量局每年校對(duì)檢測(cè)一次。5.過(guò)濾器美國(guó)PALL公司生產(chǎn)，25mm直徑。6.過(guò)濾膜Super-450，美國(guó) PALL 公司生產(chǎn)，25mm 直徑，0. 45μπι。7.旋渦混勻器江蘇海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)XW-80A。
8.離心機(jī)常州國(guó)華生產(chǎn)，型號(hào)2500型。二、試劑1.三氯乙酸分析純，鐵含量< 0. 0005%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。2.三水合醋酸鈉，分析純，鐵含量< 0. 0002%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。3.抗壞血酸，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。4.亞鐵嗪，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。5.硫脲，ACS，鐵含量 5mg/kg(0. 0005% )美國(guó) Sigma 公司生產(chǎn)。6.濃鹽酸，分析純，鐵含量< 0. 00005%，北京化工廠生產(chǎn)。7.鐵粒純品美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(National Institute of Mandards&TechnologyNIST)SRM937，純度 99. 9%，購(gòu)自 NIST。8.鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液美國(guó) NIST SRM3U6a，標(biāo)準(zhǔn)值 10. 001mg/g士0. 02;3mg/g，購(gòu)自美國(guó) 標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)MST。9.超純?nèi)ルx子水電阻率彡18ΜΩ。10.血清樣品來(lái)自北京朝陽(yáng)醫(yī)院檢驗(yàn)科。(1)血清樣品的收集完全遵照ISO指 南34及WHO關(guān)于制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)血清原料的收集指南，收集體檢后剩余的血清。所有標(biāo)本除 外HIV陽(yáng)性，梅毒陽(yáng)性，肝炎陽(yáng)性的標(biāo)本，血清應(yīng)澄清透明，除外溶血，黃疸，乳糜等異常標(biāo) 本。每批標(biāo)本收集大于50ml。( 血清樣本的過(guò)濾，將收集好的樣本每批充分混勻，使用 Super-450過(guò)濾膜過(guò)濾。( 血清樣品的保存，過(guò)濾好的樣本立即放入_80°C冰箱保存。使 用前從-80°C冰箱取出，室溫下自然融化，當(dāng)天使用，僅凍融一次。三、玻璃器皿使用的玻璃器皿，容量瓶，量筒，燒杯，均符合國(guó)家A級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。所有與試劑、水、稀釋 液或樣本接觸的玻璃容器做如下清洗(1)使用常規(guī)清洗程序，首先使用含去污劑的水浸 泡30min，然后自來(lái)水沖洗，去離子水沖洗10遍。(2)在2mol/L鹽酸中浸泡過(guò)夜。(3)去離 子水沖洗5-6分鐘。(4)無(wú)塵環(huán)境中倒置自然干燥。四、標(biāo)準(zhǔn)貯備液和稀釋液的配制方法1.空白貯備液及稀釋液0. lmol/L的鹽酸。取干燥潔凈100ml量筒，將0. 9ml濃 鹽酸加入100ml容量瓶中，然后加入去離子水，至100ml刻度，顛倒10次混勻。相同方法做 7次制備7瓶0. lmol/L鹽酸各100ml。用于做空白校準(zhǔn)液或標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。2.高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制理論含量設(shè)計(jì)為lmg/g的高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)液。取一只干燥潔凈小燒杯，用BSA224S-CW精密分析天平稱量，首先清零，稱量 SRM937純鐵粒，實(shí)際稱量值為100. Omg，加入2. 5ml濃鹽酸溶解鐵粒，注意封口，溶解過(guò)程 需緩慢搖動(dòng)，直至完全溶解。取一干燥潔凈100ml容量瓶，在BSA224S-CW精密分析天平上 清零，然后將溶解好的液體小心轉(zhuǎn)入容量瓶中，去離子水沖洗小燒杯10遍分別轉(zhuǎn)入容量瓶 中，加去離子水至IOOg左右，實(shí)際稱量100. 0019g，顛倒混勻10次，實(shí)際濃度為1. OOOOmg/3.中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液配制理論含量設(shè)計(jì)為50 μ g/g的中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)液。使用高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液，0. lmol/L鹽酸稀釋制備高濃度鐵貯備液。取一干燥潔 凈100ml容量瓶，在BSA224S-CW精密分析天平上清零，加入鐵高濃度標(biāo)準(zhǔn)液，實(shí)際稱量值為 5. 0006g，然后加入配制好的0. lmol/L鹽酸，實(shí)際稱量值顯示為100. 0305g，顛倒混勻10次，實(shí)際濃度為49. 9908 μ g/g。4.鐵標(biāo)準(zhǔn)工作液配制理論含量設(shè)計(jì)為0. 25，0. 5，1，1. 5，2，3 μ g/g的鐵標(biāo)準(zhǔn)工作液。使用中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液，0. lmol/L鹽酸稀釋制備中濃度鐵貯備液。取一干燥 潔凈IOOml容量瓶，在BSA224S-CW精密分析天平上清零，加入中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)液，記錄實(shí)際 加入值，然后加入配制好的0. lmol/L鹽酸，記錄實(shí)際稱量值，顛倒混勻10次，計(jì)算實(shí)際鐵 標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度，具體稱量值見(jiàn)表1，得到濃度為0. 2540,0. 4999、1. 0035、1. 5000,2. 0027、 3. 0000ug/g的鐵標(biāo)準(zhǔn)工作液。表1血清鐵亞鐵嗪參考方法鐵標(biāo)準(zhǔn)工作液配制表目標(biāo)濃度中濃度鐵加 入實(shí)際濃度O g/g)標(biāo)準(zhǔn)貯備液加0. lmol/L 鹽酸(u g/g)入量(g)后稱量值(g)0. 25000. 507999. 99960. 25400. 50001. 0009100.00520. 49991. 00002. 0075100.00251. 00351. 50003. 0007100. 00301. 50002. 00004. 006199. 99962. 00273. 00006. 0016100. 00373. 0000五、反應(yīng)原理在酸性條件下，血清鐵從與其結(jié)合的轉(zhuǎn)鐵蛋白上游離出來(lái)，同時(shí)沉淀蛋白。上清中 的三價(jià)鐵被還原為亞鐵離子(二價(jià)鐵)，亞鐵離子與亞鐵嗪反應(yīng)形成紫色復(fù)合物。在560nm 處測(cè)其吸光度變化，吸光度變化與標(biāo)本中的鐵離子濃度成正比。六、所用試劑的配制方法1.三氯乙酸，配制濃度為500g/L。取一干燥潔凈燒杯，稱取50g三氯乙酸，加入去 離子水?dāng)嚢枞芙猓⌒霓D(zhuǎn)入100ml容量瓶中，去離子水沖洗小燒杯10遍分別轉(zhuǎn)入容量瓶中， 加去離子水至刻度100ml，充分顛倒混勻。密封，2-8°C保存穩(wěn)定6個(gè)月。2.三水醋酸鈉，配制濃度為4mol/L(M4. 4g/L)。取一干燥潔凈效燒杯，稱取 27. 22g三氯乙酸，加入去離子水加熱攪拌溶解，小心轉(zhuǎn)入50ml容量瓶中，去離子水沖洗小 燒杯10遍分別轉(zhuǎn)入容量瓶中，加去離子水至刻度50ml，充分顛倒混勻。密封，室溫保存穩(wěn)定 一個(gè)月。3. 6mol/L鹽酸，使用Eppendorf Reference移液器吸取5ml濃鹽酸，加入干燥潔凈 的IOml容量瓶中，用去離子水稀釋至10ml。4.蛋白沉淀試劑的配制，取一干燥潔凈燒杯，稱取0. 5g抗壞血酸，使用20ml配置 好的500g/L的三氯乙酸水溶液溶解，充分溶解后，加入3. 3ml,6mol/L鹽酸，將其轉(zhuǎn)入100ml 干燥潔凈的容量瓶中，去離子水沖洗小燒杯10遍分別轉(zhuǎn)入容量瓶中，加去離子水至刻度 IOOrnl，充分顛倒混勻。密封，2-8°C保存穩(wěn)定一周。
5.色原試劑的配制，取一干燥潔凈燒杯，稱取26. 25mg亞鐵嗪，使用少量(約 15ml)配置好的4mol/L的三水醋酸鈉溶液溶解，充分溶解后，用稱量紙稱量0. 75g硫脲，小 心轉(zhuǎn)入上述燒杯中，充分?jǐn)嚢枞芙?，將其轉(zhuǎn)入50ml干燥潔凈的容量瓶中，4mol/L的三水醋 酸鈉溶液沖洗燒杯5遍分別轉(zhuǎn)入容量瓶中，加至刻度50ml，充分顛倒混勻。密封，2-8°C保存穩(wěn)定一周。七、檢測(cè)方法1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲得1)、分別將IOml離心管放到BSA224S-CW精密分析天平清零，分別取2ml濃度為 0. 2540,0. 4999、1. 0035、1. 5000,2. 0027,3. 0000ug/g 的鐵標(biāo)準(zhǔn)工作液加入離心管中，記錄 稱量數(shù)據(jù) 1. 9996，1. 9987，1. 9952，1. 9956，2. 0015，2. 0025g。然后再清零，分別取 2ml 蛋白 沉淀試劑加入離心管中，記錄稱量數(shù)據(jù)2. 0869,2. 0918,2. 0925,2. 0887,2. 0888,2. 0980g, 然后分別與標(biāo)準(zhǔn)液充分混勻。靜置反應(yīng)15min，然后離心機(jī)4000轉(zhuǎn)(約1500g)離心15min 去除蛋白沉淀，分別得到上清液I。以0. lmol/L鹽酸做零值樣本。2)、分別取IOml離心管放到BSA224S-CW精密分析天平清零，分別小心準(zhǔn)確移取 上述步驟1得到的2ml上清液I轉(zhuǎn)入新的IOml離心管中，記錄稱量數(shù)據(jù)2. 0422,2. 0403， 2. 0530，2. 0358，2. 0331,2. 0343g。清零，在裝有上清液I的離心管中加入Iml色原試劑，記 錄稱量數(shù)據(jù) 1. 1499，1. 1523，1. 1419，1. 1477，1. 1466，1. 1416g,充分混勻。離心機(jī)離心，4000 轉(zhuǎn)(約1500g)離心IOmin去除雜質(zhì)，分別得到上清液II。3)、分別取上述步驟2得到的上清液II，加入比色杯中。在分光光度計(jì)上562nm處 讀取吸光度值，并以0. lmol/L鹽酸做為零值樣本(空白工作液)。按照上述方法，測(cè)定最終反應(yīng)在562nm波長(zhǎng)的吸光度(A)值，以A值為縱坐標(biāo)，對(duì) 應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中鐵濃度為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1所示。所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為一元線性 回歸曲線，其自變量為所述鐵標(biāo)準(zhǔn)工作液中鐵的濃度值，因變量為所述鐵標(biāo)準(zhǔn)工作液中鐵 的吸光度值。2、樣品的檢測(cè)1)、將IOml離心管放到BSA224S-CW精密分析天平清零，取2. 0285g(即為^il)血 清樣品加入離心管中。然后再稱取2.0864g(即為aiil)蛋白沉淀試劑加入離心管中，，然后 與血清樣品充分混勻。靜置反應(yīng)15min，然后離心機(jī)4000轉(zhuǎn)(約1500g)離心15min去除蛋 白沉淀，得到上清液I。2)、取IOml離心管放到BSA224S-CW精密分析天平清零，小心準(zhǔn)確移取上述步驟1 得到的2.0438g(即為aiil)上清液轉(zhuǎn)入新的IOml離心管中。清零，在裝有上清液的離心 管中加入1. 1418g(即為Iml)色原試劑，充分混勻。離心機(jī)離心，4000轉(zhuǎn)(約1500g)離心 IOmin去除雜質(zhì)，得到上清液。3)、取上述步驟2得到的上清液，加入比色杯中。在分光光度計(jì)上562nm處讀取吸光度值。使用最小二乘法得到步驟1得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣 本中血清鐵濃度。在標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲得步驟的吸光值讀取后，將比色杯徹底清洗后，充分干燥，檢測(cè)杯 空白的吸光值。漂移應(yīng)小于士0.001，如果發(fā)生漂移，需要重新調(diào)零。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果為漂移小于士0. 001 ；同樣在樣品檢測(cè)時(shí)，漂移也小于士0. 001。實(shí)施例2、方法的鑒定1、線性評(píng)價(jià)根據(jù)CLSI線性判定指南EP6-A文件，將由實(shí)施例1步驟四得到的中 濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液(SRM937)，使用0. lmol/L鹽酸做為稀釋液，得到7個(gè)不同濃度水平的樣 本，具體按照表2配制，1號(hào)樣本選用0. lmol/L鹽酸，7號(hào)樣本的鐵離子濃度達(dá)到12. 10 μ g/ g(即為iang/L)。配制方法與實(shí)施例1中步驟四中所述一致。采用實(shí)施例1中的步驟七的方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定7個(gè)不同濃度水平的樣本的 鐵離子濃度，檢測(cè)結(jié)果也見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。以理論稀釋值為橫坐標(biāo)⑴，實(shí)際測(cè)定值(7個(gè)樣本的鐵離子濃度)為⑴做圖，見(jiàn) 圖2，可觀察到該方法在鐵離子濃度為12. 10μ g/g內(nèi)的線性良好。表2線性范圍評(píng)價(jià)的樣本稀釋比例及測(cè)定結(jié)果49.9908 μ g/g理論值實(shí)測(cè)值酸SRM937 (g)( μ g/g)(μ g/g)(g)樣本11. 9990-0.000. 01樣本20.07661.91661.921. 93樣本30. 15641.80483.993. 96樣本40. 23581.72786.006. 03樣本50. 30221.67987.627. 57樣本60. 38601.61109.669. 65樣本70. 49201.516612.2512. 102、不準(zhǔn)確度首先將NIST鐵標(biāo)準(zhǔn)液SRM3U6a(標(biāo)準(zhǔn)值10. 001mg/g士0. 023mg/g)使用稱重法 用0. lmol/L鹽酸進(jìn)行50倍稀釋?zhuān)缓髮⑾♂尯蟮腟RM3126a溶液分別進(jìn)行50倍和40倍稀 釋?zhuān)鳛榉治鰳颖?，采用?shí)施例1的步驟七的方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定分析樣本中鐵濃度， 其結(jié)果見(jiàn)表3，可以看出，與靶值的平均偏倚分別為0.04% (_0.66% 0.74%)，0.74% (0.96^-0.531%^實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。表3血清鐵亞鐵嗪參考方法測(cè)定SRM3126a不同稀釋濃度SRM3126a 均值(mg/g)靶值(mg/g) 偏倚(％)2500 倍稀釋 9.9959 10.00 0.04 2000 倍稀釋 9. 9256_10. 00_0. 743、回收率
4、不精密度評(píng)價(jià)選取3個(gè)不同鐵濃度的混合血清樣本(預(yù)實(shí)驗(yàn)首先測(cè)得濃度分別為0. 9004 μ g/g, 1. 0567 μ g/g、2. 0927 μ g/g)進(jìn)行批內(nèi)和批間不精密度測(cè)定，每個(gè)樣本分為3瓶，每瓶即為 一批，每批測(cè)定10次，計(jì)算批內(nèi)、批間與總CV。采用實(shí)施例1的步驟七的方法，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲 線確定各樣本中血清鐵濃度，結(jié)果見(jiàn)表5。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。表5血清鐵亞鐵嗪參考方法精密度(μ g/g) 表6血清鐵亞鐵嗪參考方法的檢測(cè)低限
權(quán)利要求
1.一種血清鐵含量的檢測(cè)方法，包括如下步驟1)A、通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和所需質(zhì)量的蛋白沉淀試劑，將 所需質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與所需質(zhì)量的蛋白沉淀試劑混勻，放置；離心，收集上清液，記作上 清液I ；B、通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的上清液I和所需質(zhì)量的色原試劑，將所需質(zhì)量 的上清液I與所需質(zhì)量的色原試劑混勻，離心，取上清液，記作上清液II ；C、在562nm波長(zhǎng)下檢測(cè)上清液II的吸光度值；D、以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，建立一元線性回歸 曲線，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線;2)通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的待測(cè)樣品，用所需質(zhì)量的待測(cè)樣品替換步驟 1)中的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照步驟1)中A-C的方法進(jìn)行檢測(cè)，得到待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的吸光度值; 根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中鐵的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液的按照如下方法制備1)通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的鐵和所需質(zhì)量的水，將所需質(zhì)量的鐵用濃鹽酸 溶解后，加入所需質(zhì)量的水，得到高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液，所述鐵離子在所述高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯 備液中濃度為1. 0000mg/g ；2)通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的步驟1)得到的高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液和所需質(zhì) 量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶液，將所需質(zhì)量的步驟1)得到的高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液和 所需質(zhì)量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶液混合，得到中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液，所述鐵離子在 所述中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液中的濃度為50. 0000 μ g/g ；3)通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的步驟幻得到的中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液和所需質(zhì) 量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶液，用所需質(zhì)量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶液稀釋所 需質(zhì)量的步驟幻得到的中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液；所述鐵離子在所述標(biāo)準(zhǔn)溶 液中的濃度為以下 6 種0. 2500ug/g、0. 5000ug/g、l. 0000ug/gU. 5000ug/g、2. OOOOug/g 和 3.000ug/g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟1)的步驟A中，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的量為2. 00士O.Olg，所述蛋白沉淀試劑的量為 2. 08士0. Olg ；所述步驟1)的步驟B中，上清液I的量為2.04士0.0^，所述色原試劑的量為 1. 14士0. Olg ；所述步驟2)中，所述待測(cè)樣品的量為2. 02士0. Olgo
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)的步驟A中，所述 放置的時(shí)間為15min，所述離心力為1500g，所述離心的時(shí)間為15min ；所述步驟1)的步驟B中，所述離心力為1500g，所述離心的時(shí)間為IOmin。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述蛋白沉淀試劑按照如下方法制備將抗壞血酸、濃度為500g/l的三氯乙酸水溶 液、濃度為6mol/l的鹽酸水溶液和水混合，所述抗壞血酸、所述三氯乙酸和所述濃度為 6mol/l的鹽酸水溶液的配比為5g 500g 33ml ；所述色原試劑按照如下方法制備將亞鐵嗪、濃度為4mol/l的三水醋酸鈉水溶液和硫 脲混合，所述亞鐵嗪、所述三水醋酸鈉和所述硫脲的配比為525mg 544. 4g 15g。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)品中，所述鐵為鐵標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM937。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述待測(cè)樣本為無(wú)HIV疾病、無(wú)梅毒疾病、無(wú)肝炎疾病、無(wú)溶血、無(wú)黃疸且非乳糜的離 體血清。
8.—種標(biāo)準(zhǔn)品，按照如下方法制備1)通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的鐵和所需質(zhì)量的水，將所需質(zhì)量的鐵用濃鹽酸 溶解后，加入所需質(zhì)量的水，得到高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液，所述鐵離子在所述高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯 備液中濃度為1. 0000mg/g ；2)通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的步驟1)得到的高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液和所需質(zhì) 量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶液，將所需質(zhì)量的步驟1)得到的高濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液和 所需質(zhì)量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶液混合，得到中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液，所述鐵離子在 所述中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液中的濃度為50. 0000 μ g/g ；3)通過(guò)稱量質(zhì)量的方法得到所需質(zhì)量的步驟幻得到的中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液和所需質(zhì) 量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶液，用所需質(zhì)量的濃度為0. lmol/L的鹽酸水溶液稀釋所 需質(zhì)量的步驟幻得到的中濃度鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液；所述鐵離子在所述標(biāo)準(zhǔn)溶 液中的濃度為以下 6 種0. 2500ug/g、0. 5000ug/g、l. 0000ug/gU. 5000ug/g、2. OOOOug/g 和 3.000ug/g。
9.權(quán)利要求8所述標(biāo)準(zhǔn)品在檢測(cè)血清鐵含量中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種血清鐵含量的檢測(cè)方法及其專(zhuān)用標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)A、將所需質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液與所需質(zhì)量的蛋白沉淀試劑混勻，放置；離心，收集上清液，記作上清液I；B、將所需質(zhì)量的上清液I與所需質(zhì)量的色原試劑混勻，離心，取上清液，記作上清液II；C、在562nm波長(zhǎng)下檢測(cè)上清液II的吸光度值；D、得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)按照步驟1)中A-C的方法進(jìn)行檢測(cè)，得到待測(cè)樣品中鐵的含量。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，用本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)品和方法檢測(cè)血清鐵的含量，具有檢測(cè)限低，線性高，精密度、準(zhǔn)確度均能滿足臨床需要，費(fèi)用相對(duì)較低。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102053068SQ20101053290
公開(kāi)日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月2日
發(fā)明者張建平, 徐靜, 王清濤, 馬懷安, 黃妍 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院