專利名稱：一種高效液相色譜-熒光法同時(shí)測(cè)定色氨酸和5-羥色胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及檢測(cè)色氨酸和5-羥色胺的方法，特別涉及用高效液相色譜熒光法同時(shí)測(cè)定色氨酸和其代謝產(chǎn)物5-羥色胺濃度的方法。

背景技術(shù)：
色氨酸(tryptophan，Trp)是人體必需的氨基酸之一，主要用于蛋白質(zhì)合成。在人體內(nèi)部分Trp經(jīng)色氨酸羥化酶作用形成5-羥色氨酸(5-hydroxytryptophan，5-HTP)，5-HTP脫羧形成5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)。高效液相色譜法(HPLC)是一種集分離和測(cè)定于一體的分析技術(shù)，樣本預(yù)處理比較簡(jiǎn)單，靈敏度高，精密性好，特異性佳，樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，在分析Trp和5-HT時(shí)應(yīng)用最為普遍。根據(jù)聯(lián)用的檢測(cè)器不同分為高效液相色譜紫外法(HPLC-UV)、高效液相色譜熒光法(HPLC-FD)和高效液相色譜電化學(xué)法(HPLC-EC)。高效液相色譜紫外法靈敏度較低，對(duì)于某些標(biāo)本(如腦脊液)難以達(dá)到檢測(cè)限要求。而高效液相色譜電化學(xué)法雖然靈敏度高，但存在儀器昂貴，技術(shù)要求較高，操作不便等諸方面的不足。國(guó)內(nèi)有使用HPLC-FD單獨(dú)測(cè)定Trp或5-HT的方法，但同時(shí)檢測(cè)的方法未見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)內(nèi)容 本發(fā)明目的是針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，分離快速，流動(dòng)相配制簡(jiǎn)單，能同時(shí)測(cè)定色氨酸和5-羥色胺的高效液相色譜熒光法。
本發(fā)明目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn) 一種使用高效液相色譜熒光法同時(shí)分析Trp和5-HT的方法包括以下步驟 a.色譜柱選用Hypersil C18柱(250mm×4.6mm i.d.，7μm)作為色譜固定相； b.用0.1mol/L磷酸二氫鉀和甲醇的體積比為85∶15溶液作為色譜流動(dòng)相； c.流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為20μL，室溫下測(cè)定； d、熒光檢測(cè)器掃描確定檢測(cè)兩種物質(zhì)的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)；測(cè)定過(guò)程中波長(zhǎng)設(shè)定為在0-6min激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為278nm和338nm，6-10min激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別變換為280nm和340nm； e、分別配制色氨酸和5-羥色胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)液； f、混合標(biāo)準(zhǔn)液和血清樣本的檢測(cè)； g、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線、定性定量方法、精密度的評(píng)價(jià)、回收率的考察和干擾試驗(yàn)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下 1、本發(fā)明首次使用可變波長(zhǎng)的高效液相色譜熒光法測(cè)定色氨酸和5-羥色胺，能滿足同時(shí)測(cè)定上述兩種物質(zhì)的需求。
2、結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，兩種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好(r2≥0.999)，線性范圍寬，靈敏度高；精密度好，日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5％；回收率高，兩者的回收率均在90％左右；苯丙氨酸、酪氨酸、犬尿氨酸和犬尿喹啉酸都不會(huì)對(duì)5-HT與Trp的分離分析產(chǎn)生干擾。
3、本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)，摸索出一套最佳的能同時(shí)測(cè)定待測(cè)樣品中色氨酸和5-羥色胺的條件，包括流動(dòng)相成分，配比、流速、檢測(cè)波長(zhǎng)等等。
4、本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，測(cè)定準(zhǔn)確，分離快速，靈敏度高。



圖1為本發(fā)明混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖； 圖2為本發(fā)明血清樣本的色譜圖。

具體實(shí)施例方式 主要儀器 Waters高效液相色譜儀，包括M510色譜泵、M2475熒光檢測(cè)器；Rheodyne 7725手動(dòng)進(jìn)樣器(帶20μL進(jìn)樣環(huán))；HS2000色譜數(shù)據(jù)工作站。0.45μm濾膜及其抽濾器，Milli-Q純水器，TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，AA-250電子天平，SB2200型超聲去氣儀。
主要試劑 色氨酸(Trp)、5-羥色胺(5-HT)、犬尿氨酸(Kyn)、犬尿喹啉酸(Kyna)、苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)均購(gòu)自Sigma公司；甲醇為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Tedia公司；磷酸二氫鉀為國(guó)產(chǎn)分析純；高氯酸為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純。配制試劑用水為Milli-Q純水器處理的超純水。
色譜條件 色譜柱HypersilC18柱(250mm×4.6mmi.d.，7μm)；流動(dòng)相0.1mol/L磷酸二氫鉀和甲醇體積比為85∶15溶液；流速1.0mL/min；熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)在0-6min分別為278nm和338nm，6-10min變換為280nm和340nm；進(jìn)樣量20μL；室溫下測(cè)定。
下面以具體實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1色譜條件的建立 1、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取5-HT10.0mg和Trp10.0mg，分別用體積分?jǐn)?shù)為2.5％的高氯酸溶液溶解并稀釋至10.0mL，混勻，制成5-HT(4702μmol/L)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和Trp(4900μmol/L)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分裝后置于20℃冰箱中備用。用前取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加超純水配成含5-HT0.2351μmol/L和Trp 24.5μmol/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。
2、檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取一定濃度的5-HT與Trp標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用手工停流技術(shù)，以流動(dòng)相空白調(diào)零，在M2475熒光檢測(cè)器上，作5-HT與Trp的激發(fā)光譜(范圍200-350nm)和發(fā)射光譜(范圍300-450nm)掃描，得到5-HT的最大激發(fā)光波長(zhǎng)和最大發(fā)射光波長(zhǎng)分別為278nm和338nm；Trp的最大激發(fā)光波長(zhǎng)和最大發(fā)射光波長(zhǎng)分別為280nm和340nm。采用上述波長(zhǎng)分別檢測(cè)5-HT和Trp。
3、流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)的選擇 配制含有不同體積分?jǐn)?shù)(5％，10％，15％，20％)甲醇的流動(dòng)相，以混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和血清作為樣品進(jìn)行分析，在甲醇體積分?jǐn)?shù)為5％時(shí)分離度較好，但峰面積相對(duì)較小，分析時(shí)間較長(zhǎng)，需要將近20分鐘才能完成檢測(cè)；而當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為20％時(shí)，5-HT檢測(cè)圖形中出現(xiàn)重疊峰干擾，分離度不佳，影響其檢測(cè)結(jié)果；甲醇體積分?jǐn)?shù)為15％時(shí)，二者在10min內(nèi)可以較好地分離，分離度好，故采用含體積分?jǐn)?shù)為15％甲醇的流動(dòng)相。
4、流速的選擇 分別以流速0.6，0.8，1.0，1.2，1.4mL/min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，隨著流速的加快，5HT和Trp的保留時(shí)間逐漸縮短，但峰面積也相應(yīng)地減小，色譜系統(tǒng)的壓力增大；流速為0.6mL/min時(shí)，5-HT和Trp保留時(shí)間分別約為10min和17min；流速為1.4mL/min時(shí)，5-HT和Trp保留時(shí)間縮短，但分離度欠佳，并且色譜系統(tǒng)的后壓加大，為了得到合適的分析時(shí)間和響應(yīng)值，選用的流速為1.0mL/min。
實(shí)施例2樣品的檢測(cè) 1、混合標(biāo)準(zhǔn)液的檢測(cè) 取已配置的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液直接進(jìn)樣分析，高效液相色譜條件色譜柱Hypersil C18柱(250mm×4.6mmi.d.，7μm)；流動(dòng)相0.1mol/L磷酸二氫鉀/甲醇(85∶15，V/V)溶液；流速1.0ml/min；熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)在0-6min分別為278nm和338nm，6-10min變換為280nm和340nm；進(jìn)樣量20μL；室溫下測(cè)定。色譜分離效果見(jiàn)圖1。
2、血清樣品的檢測(cè) 取100μL置于Enpendorf管內(nèi)，加入等體積的5％高氯酸溶液，在室溫下放10min后，12000r/min、4℃離心10min，取上清液20μL進(jìn)樣分析。高效液相色譜條件色譜柱HypersilC18柱(250mm×4.6mmi.d.，7μm)；流動(dòng)相0.1mol/L磷酸二氫鉀/甲醇(85∶15，V/V)溶液；流速1.0ml/min；熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)在0-6min分別為278nm和338nm，6-10min變換為280nm和340nm；進(jìn)樣量20μL；室溫下測(cè)定。色譜分離效果見(jiàn)圖2。
3、定性定量分析 Trp和5-HT峰采用峰保留值和峰疊加法定性分析；用外標(biāo)法測(cè)定峰面積進(jìn)行定量；數(shù)據(jù)處理均由HS2000色譜數(shù)據(jù)工作站完成。血清5-HT或Trp

Au為血清中5-HT或Trp峰面積，As為混合標(biāo)準(zhǔn)液中5-HT或Trp峰面積，Cs為混合標(biāo)準(zhǔn)液中5-HT或Trp濃度。
4、標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限的確定 取5-HT與Trp標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用超純水配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液(5-HT濃度為0.001～4.702μmol/L，Trp濃度為0.012～98μmol/L)，每個(gè)濃度樣品進(jìn)樣3次，取其平均值用最小二乘法進(jìn)行相關(guān)與回歸分析，其中，Y為峰面積(μV·s)，X為被分析物的進(jìn)樣濃度(μmol/L)。以流動(dòng)相為空白，按信噪比為3確定檢測(cè)限。結(jié)果5-HT的回歸方程為Y＝4223461X 35303.9，線性范圍為0.003～4.702μmol/L，相關(guān)系數(shù)為0.999，檢測(cè)限為0.001μmol/L；Trp的回歸方程為Y＝421314X+38292.9，線性范圍為0.0245～98.0，相關(guān)系數(shù)為0.999，檢測(cè)限為0.007μmol/L；結(jié)果表明線性范圍寬，靈敏度高。
5、精密度試驗(yàn) 取混合血清樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行日內(nèi)和日間精密度試驗(yàn)。5-HT標(biāo)準(zhǔn)液濃度分別取0.2351、0.4702、2.351μmol/L，Trp標(biāo)準(zhǔn)液濃度分別取12.25、49、245μmol/L低、中、高3個(gè)濃度水平，日內(nèi)進(jìn)行5組平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算日內(nèi)精密度，每份樣品連續(xù)測(cè)定5天，計(jì)算日間精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。
表15-HT和Trp的精密度
6、回收率測(cè)定 取混合血清樣品1.6mL平均分為4組，每組3份。第1組每份加入2.5％的高氯酸溶液0.1mL作為基礎(chǔ)樣品；后3組每份分別加入高、中、低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.1mL；每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定三次取其平均值計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2，3。
表25-HT回收率
表3Trp回收率
7、干擾試驗(yàn) 先將混合血清去蛋白后取上清液進(jìn)樣分析，然后用體積分?jǐn)?shù)為2.5％的高氯酸溶液分別配制605.4μmol/L苯丙氨酸(Phe)、55.19μmol/L酪氨酸(Tyr)、19.60μmol/L犬尿氨酸(Kyn)和1.05μmol/L犬尿喹啉酸(Kyna)的標(biāo)準(zhǔn)液，先單獨(dú)進(jìn)樣分析，再分別與混合血清混合，去蛋白后取上清液進(jìn)樣分析，結(jié)果表明以上物質(zhì)都不會(huì)對(duì)5HT與Trp的分離分析產(chǎn)生干擾(見(jiàn)表4)。
表4干擾試驗(yàn)結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種高效液相色-譜熒光法同時(shí)測(cè)定色氨酸和5-羥色胺的方法，其特征在于，包括以下步驟
a.色譜柱選用Hypersil C18柱250mm×4.6mm i.d.，7μm作為色譜固定相；
b.用0.1mol/L磷酸二氫鉀和甲醇的體積比為85∶15溶液作為色譜流動(dòng)相；
c.流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為20μL，室溫下測(cè)定；
d、熒光檢測(cè)過(guò)程中波長(zhǎng)設(shè)定在06min時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為278nm和338nm，6-10min激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別變換為280nm和340nm。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種高效液相色譜-熒光法同時(shí)測(cè)定色氨酸和5-羥色胺的方法，包括以下步驟a.色譜柱選用Hypersilc18柱250mm×4.6mmi.d.，7μm作為色譜固定相；b.用0.1mol/L磷酸二氫鉀和甲醇的體積比為8515溶液作為色譜流動(dòng)相；c.流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為20μL，室溫下測(cè)定；d.熒光檢測(cè)過(guò)程中波長(zhǎng)設(shè)定在0-6min時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為278nm和338nm，6-10min激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別變換為280nm和340nm。該方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，分離快速，流動(dòng)相配制簡(jiǎn)單；能滿足同時(shí)測(cè)定色氨酸和5-羥色胺的需求。
文檔編號(hào)G01N30/00GK101762662SQ20101030055
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2010年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月21日
發(fā)明者唐愛(ài)國(guó), 周前選, 項(xiàng)忠元, 任亞萍 申請(qǐng)人:中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院