專利名稱：天冬酰胺結(jié)合型糖蛋白的核心糖鏈的合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖鏈的化學(xué)合成領(lǐng)域、尤其是涉及化學(xué)合成糖蛋白的糖鏈的簡便方法及其合成中間體。
背景技術(shù)：
糖蛋白是指含有稱為糖鏈的寡糖部分的蛋白質(zhì)。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，糖蛋白與細(xì)胞粘附或信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程密切相關(guān)，而且已逐漸知道觸發(fā)不同生物學(xué)過程的糖鏈結(jié)構(gòu)。然而，僅少量糖蛋白在活體內(nèi)表達(dá)為糖鏈，以介導(dǎo)生物學(xué)過程，而且獲得足夠量的純的糖蛋白以測定糖鏈的理化性質(zhì)是非常困難的。
天冬酰胺結(jié)合型糖蛋白是一種在人血清或卵清蛋白中廣泛存在的糖蛋白。按照糖鏈的分枝和/或組成糖的特征，天冬酰胺結(jié)合型糖蛋白可分為高甘露糖型、復(fù)合型和混合型。所有這些類型都具有共同的五糖核心糖鏈結(jié)構(gòu)，該五糖在鏈的還原端包含3分子甘露糖和2分子N-乙酰葡糖胺； 天冬酰胺結(jié)合型糖蛋白的核心糖鏈結(jié)構(gòu)因此，上式所示的核心糖鏈結(jié)構(gòu)的化學(xué)合成，為天冬酰胺結(jié)合型糖鏈的功能研究提供了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
然而，尚不知道合成天冬酰胺結(jié)合型糖鏈的核心糖鏈結(jié)構(gòu)的有效方法。原因之一是因?yàn)楹诵奶擎溄Y(jié)構(gòu)含有很難化學(xué)合成的部分。
在核心糖鏈結(jié)構(gòu)的化學(xué)合成中，特別困難的是形成甘露糖β-糖苷鍵，該鍵是β-甘露-糖苷鍵(Manβ1→4-GlcNAc)。這是由于以下事實(shí)所致鄰基效應(yīng)是無用的，因?yàn)楦事短堑?-OH基團(tuán)連接在直立位置(axial position)上，而β-甘露糖苷鍵給糖中常見的端基異構(gòu)效應(yīng)帶來電不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。Kunz等公開了制備β-甘露糖苷結(jié)構(gòu)的化學(xué)方法，該方法包括一個復(fù)雜的過程，而且耗時、成本高(Kunz，H.和Gunther，W.(1988)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.27，1086-1087)。
之所以難以形成β-甘露糖苷鍵(Manβ1→4-GlcNAc)的其它原因是糖苷化反應(yīng)的受體是N-乙酰葡糖胺，其在反應(yīng)介質(zhì)中的溶解度低，而且4-OH基團(tuán)的活性要比其它OH基團(tuán)的活性低(OH基團(tuán)的活性1-OH＞＞6-OH＞＞2-OH＞3-OH＞4-OH)。
此外，在天冬酰胺結(jié)合型糖鏈的核心糖鏈結(jié)構(gòu)的化學(xué)合成中，GlcNAcβ1→4GlcNAc結(jié)構(gòu)的合成存在一些困難。
如上所述，在天冬酰胺結(jié)合型糖鏈的核心糖鏈結(jié)構(gòu)的化學(xué)合成中，三糖(Manβ1→GlcNAcβ1→4GlcNAc)在還原端的合成尤其存在很大困難。為了合成核心糖鏈結(jié)構(gòu)，尤其是怎樣有效合成β-甘露糖苷鍵，這是一個有待解決的問題。
本發(fā)明的發(fā)明人將注意力集中在具有甘露糖苷β1→4鍵結(jié)構(gòu)的天然多糖(尤其是具有甘露糖苷β1→4鍵的半乳甘露聚糖、瓜爾膠和甘露聚糖)上。
本發(fā)明的目的是通過使用在天然多糖結(jié)構(gòu)中包含Manβ1→4Man的二糖單元，解決合成核心糖鏈結(jié)構(gòu)、尤其是形成β-甘露-糖苷鍵的問題，并且建立合成核心糖鏈結(jié)構(gòu)的有效方法。
因此，本發(fā)明涉及包括下述步驟的方法(1)制備下式(I)所示的甘露糖二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的步驟 其中P1是OH保護(hù)基，波浪線表示-OP1連接在直立或平伏位置(equatorial position)或兩者的混合，即通過水解具有甘露糖β-1，4-鍵的多糖，優(yōu)選具有甘露糖β-1，4-鍵的半乳甘露聚糖、瓜爾膠或甘露聚糖，更優(yōu)選下式(V)所示的半乳甘露聚糖衍生物 (n為50以上的整數(shù))或者下式(VI)所示的甘露聚糖衍生物 (n為50以上的整數(shù))并且保護(hù)所得化合物的羥基，(2)將所得的甘露糖二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)轉(zhuǎn)化成烯糖(glycal)化合物的各步驟，其中通過鹵化并還原甘露糖二糖，將甘露糖二糖化合物還原端的甘露糖轉(zhuǎn)化成烯糖，和(3)通過上述烯糖化合物的疊氮化硝化反應(yīng)(azidenitrationreaction)，制備下式(II)所示的疊氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)，其中甘露糖還原端的2-疊氮基連接在平伏位置； 其中P1的定義同上，波浪線表示-NO2連接在直立或平伏位置或兩者的混合；(4)用離去基團(tuán)取代疊氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的硝基的各步驟，優(yōu)選(4-1)用-OP10基團(tuán)(P10為OH保護(hù)基)取代疊氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的硝基，除去P10基團(tuán)后，與三鹵代乙腈反應(yīng)而制備三鹵代乙亞胺酸酯(trihaloacetoimidate)衍生物，或者(4-2)用離去基團(tuán)取代疊氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的硝基，和(5)通過使上述衍生物反應(yīng)，制備下式(III)所示的三糖化合物(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型) 其中P1、P2、P3和P11的定義同上，其中離去基團(tuán)是由氨基-保護(hù)的下式吡喃葡萄糖苷引入的 其中P2和P11為OH保護(hù)基，P3為氨基保護(hù)基，和(6)制備下式(IV)所示的天冬酰胺結(jié)合型三糖化合物(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2)的步驟
其中P1和P2的定義同上，P4和P6獨(dú)立地為氨基保護(hù)基，P5為羧基保護(hù)基，以及當(dāng)在天冬酰胺結(jié)合型糖蛋白的核心糖鏈結(jié)構(gòu)還原端上制備三糖(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2)時，各步驟的方法。
此外，本發(fā)明涉及下式(II)的疊氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)，該化合物在本發(fā)明方法中是有用的合成中間體 其中P1為OH保護(hù)基，波浪線表示-NO2連接在直立或平伏位置或兩者的混合，并且涉及下式(III)所示的三糖化合物 其中P1、P2和P11為OH保護(hù)基，P3為氨基保護(hù)基。
按照本發(fā)明，容易合成天冬酰胺結(jié)合型糖蛋白糖鏈的核心糖鏈結(jié)構(gòu)還原端的三糖部分(Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN)，并且可將其用于闡明引起不同生命過程的天冬酰胺結(jié)合型糖蛋白的功能和結(jié)構(gòu)特征。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式合成本發(fā)明的核心糖鏈結(jié)構(gòu)的新路線概述如下；
其中波浪線表示-OP1或硝基連接在直立或平伏位置或兩者的混合。
首先，具有甘露糖β-1，4-鍵的多糖經(jīng)酸水解并且所得產(chǎn)物乙?；?，得到二糖化合物(I)Manβ1→4Man。然后，將其轉(zhuǎn)化為烯糖衍生物，其中還原端的甘露糖通過化學(xué)方法轉(zhuǎn)化成烯糖，接著通過疊氮化硝化反應(yīng)，得到化合物(II)。在還原端具有平伏2-疊氮基的化合物(II)可轉(zhuǎn)化成核心糖鏈結(jié)構(gòu)的Manβ1→4GlcNAc部分，作為有用的關(guān)鍵中間體。
因此，容易將中間體(II)轉(zhuǎn)化成Manβ1→4GlcNAc部分(該部分通過其它合成方案是難以制備的)，同時容易以合理成本、由化合物(I)大規(guī)模地制備中間體(II)，而化合物(I)可得自半乳甘露聚糖、瓜爾膠或甘露聚糖衍生物。此外，當(dāng)中間體(II)用作糖基供體時，合成容易轉(zhuǎn)化成核心糖鏈結(jié)構(gòu)還原端的三糖(Manβ1→4GlcNAcβ1→4GlcNAc)的三糖化合物(III)。
因此，本發(fā)明的發(fā)明人通過使用廉價(jià)可得的天然多糖，成功地簡化了在核心結(jié)構(gòu)還原端合成三糖的流程。
下面將詳細(xì)說明本發(fā)明方法的各個步驟。
步驟(1)在步驟(1)中，由具有甘露糖β-1，4-鍵的多糖制備甘露糖二糖(ManP1β1→4ManP1)化合物(I)。首先，水解具有甘露糖β-1，4-鍵的多糖，保護(hù)OH基團(tuán)，分離得到所需二糖。
作為原料，使用具有甘露糖β-1，4-鍵的多糖，優(yōu)選具有甘露糖β-1，4-鍵的半乳甘露聚糖、瓜爾膠或甘露聚糖，更優(yōu)選下式(V)的半乳甘露聚糖衍生物 其中n為50以上的整數(shù)；或者下式(VI)的甘露聚糖衍生物 其中n為50以上的整數(shù)。
半乳甘露聚糖(galactomannan)衍生物(也稱為半乳甘露聚糖(galactomannoglycan)廣泛存在于苜?；蛉~草等豆科植物種子中。瓜爾豆(Cyamopsis tetragonolobus)和長角豆或槐豆(Ceratonia siliqua)種子中的半乳甘露聚糖是市售的植物源性樹膠類產(chǎn)品。
從瓜爾豆種子中提取的瓜爾膠是包含一系列甘露糖β-1，4-鍵的直鏈糖鏈的天然多糖，其中半乳糖通過α1→6鍵連接每個甘露糖殘基，作為支鏈。該物質(zhì)的主要用途是食品添加劑，例如各種罐頭食品的增稠劑、品質(zhì)改良劑(防止外形松散)或各種食品的調(diào)味劑，它們?nèi)菀滓苑浅５土膬r(jià)格購得。
甘露聚糖(mannan)衍生物是由D-甘露糖組成的多糖的通稱。象牙果的內(nèi)胚乳或蘭科植物球莖中所含有的植物甘露聚糖衍生物具有支鏈結(jié)構(gòu)，其中D-甘露糖殘基通過β-1，4-鍵連接，并且不溶于水。
上述內(nèi)容詳細(xì)描述于″Comprehensive Dictionary for Utilization ofRegional Biological Resources″，Hiroshi Fujimaki主編，1998，RuralCulture Association；Y.C.Lee等(1977)Analytical Biochem.，79，329-337；和Shiryo Yaga等(1995)Mokuzai Gakkaishi，第41卷，第4期，440-443。
通常，酸水解用于水解具有甘露糖β-1，4-鍵的多糖。為此，使用硫酸、優(yōu)選10-20％硫酸、三氟乙酸或硫酸-乙酸，優(yōu)選的反應(yīng)溫度為50-70℃。
通過分離溶于70％EtOH的半乳甘露聚糖，除去聚合度為9以上的材料。一般而言，聚合水平再升高，則衍生物就會存在不溶性殘基。
為了保護(hù)羥基，通常使用乙?；?、芐基、4-甲氧基芐基、苯甲?；?、甲氧基甲基、四氫吡喃基(tetrahydropiranyl)、三甲基甲硅烷基和三乙基甲硅烷基等。
用硅膠色譜和/或HPLC，進(jìn)行二糖的分離。
步驟2在步驟2中，由甘露糖二糖化合物(I)(ManP1β1→4ManP1型)制備烯糖化合物。首先，通過還原端甘露糖1位的鹵化反應(yīng)、接著通過還原反應(yīng)，由二糖制備烯糖化合物。通常，在室溫下，使用鹵化氫或酰鹵等鹵化甘露糖。使用鋅等金屬進(jìn)行還原反應(yīng)，同時避免反應(yīng)在高溫下進(jìn)行。
步驟3在步驟3中，通過烯糖化合物的疊氮化硝化反應(yīng)，制備還原端甘露糖的2-疊氮基連接在平伏位置的疊氮二糖化合物(II)。
通過同時疊氮化和硝化，進(jìn)行疊氮化硝化反應(yīng)。得到平伏異構(gòu)體和直立異構(gòu)體的混合物，通過純化該混合物，將在還原端甘露糖的平伏位置具有2-疊氮基的化合物分離出來。
步驟4在步驟4中，疊氮二糖化合物中的硝基被離去基團(tuán)取代，該離去基團(tuán)通常包括氟、溴、氯、三氯乙亞胺酸酯基、4-戊烯基、烷硫基和芳硫基。
優(yōu)選疊氮二糖化合物中的硝基被-OP10基團(tuán)取代(P10為OH保護(hù)基)，除去P10基團(tuán)后，通過與三鹵代乙腈反應(yīng)而得到三鹵代亞胺酸酯衍生物，或者通過與鹵化氫反應(yīng)，得到鹵化衍生物?；蛘?，-OP10衍生物或P10-脫保護(hù)的衍生物可轉(zhuǎn)化成具有戊烯基、乙?；蚧蚍剂蚧鹊入x去基團(tuán)的衍生物。
步驟5在步驟5中，使所得具有離去基團(tuán)的衍生物與氨基-保護(hù)的吡喃葡萄糖苷反應(yīng)，制備三糖化合物(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型)。
按照以下流程，可制備氨基-保護(hù)的吡喃葡萄糖苷。

作為氨基保護(hù)基的P3基團(tuán)，通常使用鄰苯二甲酰亞氨基、叔丁氧羰基、芐氧羰基、乙?；?、苯甲酰基或芐基等。
然后，在酸性(路易斯(Lewis)-酸)條件下，使該化合物與上述具有離去基團(tuán)的衍生物反應(yīng)。
步驟6在步驟6中，將三糖化合物與天冬酰胺偶聯(lián)。與天冬酰胺的偶聯(lián)是按照例如以下流程實(shí)施的。
以上制備的三糖可以與所需蛋白質(zhì)的天冬酰胺殘基偶聯(lián)，該糖鏈可以通過添加新糖單元而延伸。另外，也可將通過向三糖添加糖單元而制備的預(yù)先延伸糖鏈引入到所需蛋白質(zhì)上。
或者，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)肽化學(xué)用于天冬酰胺結(jié)合型三糖衍生物的天冬酰胺殘基時，可以延伸蛋白質(zhì)序列。另外，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)碳水化合物化學(xué)用于還原端甘露糖時，可以延伸糖鏈。
實(shí)施例下述實(shí)驗(yàn)將更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制。
實(shí)驗(yàn)所用材料得自以下市售來源。
SANSHO Co.，Ltd.(Food DiVision)瓜爾膠MEYPROGAT 120SKANTO CHEMICAL CO.，INC鋅粉五水硫酸銅(II)(結(jié)晶粉末)硝酸二銨鈰(IV)Wako Pure Chemical Industries，Ltd.
乙酸鈉乙酸酐三氟乙酸疊氮化鈉DBU，1，8-二氮雜雙環(huán)[5，4，0]十一碳-7-烯CCl3CN，三氯乙腈BF3OEt2，三氟化硼乙醚絡(luò)合物乙酸，用于有機(jī)合成吡啶，用于有機(jī)合成四氫呋喃，THF，用于有機(jī)合成CH2Cl2，二氯甲烷，用于有機(jī)合成乙腈，用于有機(jī)合成乙酸乙酯氯仿甲苯無水MgSO4三乙胺Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd.
30％HBr-AcOH，30％溴化氫/乙酸Nacalai Tesque，Inc.
芐胺Japa Alcohol Trading CO.，LTD99％乙醇實(shí)施例11.瓜爾膠的水解和Manβ1→4Man的分離合成流程(1) 1.1.瓜爾膠的水解(小規(guī)模)(A)用TFA水解瓜爾膠，得到溶于70％EtOH的半乳甘露聚糖。
將2.0g瓜爾膠(1)溶于16.6ml 1N TFA中，在油浴中邊攪拌邊加熱至110℃達(dá)90分鐘。將反應(yīng)混合物倒入40ml 99％EtOH中，放在室溫下。用布氏漏斗過濾，除去所得白色沉淀，真空濃縮濾液。將甲苯加入到殘余物中，共沸蒸餾幾次，得到溶于70％EtOH的2.26g半乳甘露聚糖(2)和不溶于70％EtOH的73mg半乳甘露聚糖(3)。
用MALDI-TOFMS對溶于70％EtOH的半乳甘露聚糖(2)進(jìn)行分析表明，其聚合度下降至1-8。
(B)將溶于70％EtOH的半乳甘露聚糖乙?；?，得到O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-1，2，3，6-四-O-乙?；?α-和β-D-吡喃甘露糖苷(4)。
將以上得到的溶于70％EtOH的2.26g半乳甘露聚糖(2)溶于23ml吡啶中，向在冰浴中冷卻的溶液中加入23ml乙酸酐，在10℃攪拌22小時。向反應(yīng)混合物中加入冰水，用氯仿萃取，依次用水、NaHCO3水溶液和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)無水MgSO4干燥。用硅藻土過濾除去MgSO4后，真空濃縮濾液，所得殘余物用硅膠柱色譜法純化(洗脫甲苯/乙酸乙酯＝2/1)，得到450mg所需產(chǎn)物(4)。
樣品；α∶β＝2∶1的混合物；[a]D-0.5(c 0.012，氯仿)；1H NMRδ(CDCl3)1.99～2.19(all s，24H，8COCH3)，3.64(m，1H，H-5’)，3.77(m，1/3H，H-5β)，3.95～4.13(m，2+2/3H，H-5α，H-4β，H-4α和H-6’b)，4.23～4.37(m，3H，H-6bβ，H-6aα，H-6bα，H-6a’和H-6aβ)，4.72(d，1/3H，Jβ1’，2’＝1.1Hz，H-1β’)，4.75(d，2/3H，Jα1’， 2’＝1.1Hz，H-1α’)，5.04(m，1H，H-3’)，5.17～5.25(m，2H，H-4’，H-2α和H-3β)，5.39～5.45(m，2H，H-2’，H-2β和H-3α)，5.81(d，1/3H，Jβ1，2＝1.1Hz，H-1β)，6.03(d，2/3H，Jα1，2＝2.0Hz，H-1α).
C28H38O19的分析計(jì)算值C，49.56；H，5.64；實(shí)測值C，49.34；H，5.67。
HR-FAB MS[M+Na]+C28H38O19Na的計(jì)算值701.191；實(shí)測值709.190。
T.L.C；Rf＝0.30(甲苯/乙酸乙酯＝1∶1)。
1.2.瓜爾膠的水解(大規(guī)模)(A)′用TFA水解瓜爾膠，得到溶于70％EtOH的半乳甘露聚糖。
將200g瓜爾膠(1)溶于1660ml 1N TFA中，在帶有機(jī)械攪拌的油浴中加熱至110℃達(dá)35分鐘。當(dāng)瓜爾膠懸浮時，將混合物超聲處理15分鐘并在110℃機(jī)械攪拌80分鐘。將反應(yīng)混合物在冰浴中冷卻，倒入4升99％EtOH中，放在室溫下。用布氏漏斗過濾，除去所得白色沉淀，真空濃縮濾液。將甲苯加入到殘余物中，共沸蒸餾幾次，得到溶于70％EtOH的200.3g半乳甘露聚糖(2)和不溶于70％EtOH的9.9g半乳甘露聚糖(3)。用MALDI-TOFMS對溶于70％EtOH的半乳甘露聚糖(2)進(jìn)行分析表明，其聚合度下降至1-8。
(B)′將溶于70％EtOH的半乳甘露聚糖乙?；?，得到O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-1，2，3，6-四-O-乙?；?α-和β-D-吡喃甘露糖苷(4)。
將以上得到的溶于70％EtOH的200.3g半乳甘露聚糖(2)溶于2100ml吡啶中，向冰浴冷卻的溶液中加入2100ml乙酸酐，在10℃攪拌22小時。向反應(yīng)混合物中加入冰水，用氯仿萃取，依次用水、NaHCO3水溶液和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)無水MgSO4干燥。用硅藻土過濾除去MgSO4后，真空濃縮濾液，所得殘余物用硅膠柱色譜法部分純化(洗脫甲苯/乙酸乙酯＝2/1)，得到25.2g所需產(chǎn)物(4)。2.O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-1，3，6-三-O-乙酰基-2-疊氮-2-脫氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(8)的合成合成流程(2) (C)溴化O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-2，3，6-三-O-乙酰基-α-D-吡喃甘露糖(5)的合成將2.20g化合物(4)溶于19ml乙酸，向溶液中加入4.6ml 30％HBr-AcOH，將所得混合物在室溫下避光攪拌150分鐘。在T.L.C上證實(shí)反應(yīng)終止后，將冰水加入到反應(yīng)混合物中，所得產(chǎn)物用氯仿萃取，依次用水、NaHCO3水溶液和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)無水MgSO4干燥。用硅藻土過濾除去MgSO4后，真空濃縮濾液，得到含有所需產(chǎn)物(5)的2.21g殘余混合物。
T.L.C；Rf＝0.35(甲苯/AcOEt＝1∶1)。
(D)O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-3，6-二-O-乙?；?D-糖醇(6)的合成向在冰水浴中冷卻的三頸燒瓶中，依次加入3.8ml乙酸、7.6ml水、2.06g乙酸鈉、0.20g五水硫酸銅和1.65g鋅，同時用機(jī)械攪拌器攪拌。然后，將含有化合物(5)的反應(yīng)混合物溶于7.6ml乙酸中，將其加入到以上在冰水浴中冷卻的反應(yīng)混合物中，將所得混合物在室溫下避光攪拌4小時。在T.L.C上證實(shí)反應(yīng)終止后，通過硅藻土過濾從反應(yīng)混合物中除去鋅，將冰水加入到濾液中。產(chǎn)物用氯仿萃取，依次用水、NaHCO3水溶液和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)無水MgSO4干燥。用硅藻土過濾除去MgSO4后，真空濃縮濾液。殘余物用快速硅膠色譜法純化(洗脫甲苯/乙酸乙酯＝2/1)，得到0.64g所需產(chǎn)物(6)。
由化合物(4)的收率36％。
1H NMRδ(CDCl3).200，2.05，2.08，2.10，2.12 and 2.17(all s，18H，6COCH3)，3.66(ddd，1H，J4’，5’＝9.8Hz，J5’，6a’＝5.8Hz，J5’，6b’＝12.2Hz，H-5’)，4.05(dd，1H，J3，4＝6.0Hz，J4，5＝8.1Hz，H-4)，4.12(dd，1H，J5’，6b’＝2.6Hz，J6a’，6b’＝12.2Hz，H-6b’)，4.13-4.17(m，1H，H-5)，4.23(dd，1H，J5，6b＝5.3Hz，J6a，6b＝12.2Hz，H-6b)，4.30(dd，1H，J5’，6a’＝5.8Hz，J6a’，6b’＝12.2Hz，H-6a’)，4.42(dd，1H，J5，6a＝2.9Hz，J6a，6b＝12.2Hz，H-6a)，4.79(dd，1H，J1，2＝6.1Hz，J2，3＝3.1Hz，H-2)，4.86(d，1H，J1’，2’＝1.1Hz，H-1’)，5.05(dd，1H，J2’，3’＝3.4Hz，J3’，4’＝10.1Hz，H-3’)，5.22(t，1H，J4’，5’＝9.8Hz，H-4’)，5.45(dd，1H，J1’，2’＝1.1Hz J2’，3’＝3.4Hz，H-2’)，5.51(m，1H，H-3)，6.40(dd，1H，J1，2＝6.1Hz，J雙鍵順式＝1.2Hz，H-1)13C NMRδ(CDCl3)20.5-21.0(m，6COCH3)，61.8(C-6)，62.5(C-6’)，65.9(C-4’)，68.5(C-3and C-2’)，70.8(C-3’)，72.6(C-5’)，74.0(C-4)，74.4(C-5)，97.9(C-1’)，99.0(C-2)，145.6(C-1)，169.5-170.6(m，6COCH3)T.L.C；Rf＝0.40(甲苯/乙酸乙酯＝1∶1)。
(E)硝酸O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-3，6-二-O-乙?；?2-疊氮-2-脫氧-α-和β-D-吡喃葡萄糖苷(7)的合成將510mg化合物(6)溶于5.4ml無水乙腈中，在-20℃攪拌。向該溶液中，加入89mg疊氮化鈉(NaN3)，然后每隔15分鐘分4次加入1.50g硝酸二銨鈰(IV)。將反應(yīng)混合物在氦氣氛下、在-20℃攪拌18小時。在T.L.C上證實(shí)反應(yīng)終止后，將冰水加入到反應(yīng)混合物中，所得產(chǎn)物用氯仿萃取，依次用水、NaHCO3水溶液和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)無水MgSO4干燥。用硅藻土過濾除去MgSO4后，真空濃縮濾液，得到含有所需產(chǎn)物(7)的460mg殘余物。
T.L.C；Rf＝0.50(甲苯/AcOEt＝1∶1)。
(F)O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-1，3，6-三-O-乙酰基-2-疊氮-2-脫氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(8)的合成將含有化合物(7)的460mg殘余物溶于2.0ml乙酸中，向該溶液中加入170mg乙酸鈉，在80℃油浴中攪拌75分鐘。在T.L.C上證實(shí)反應(yīng)終止后，將冰水加入到反應(yīng)混合物中，產(chǎn)物用氯仿萃取，依次用水、NaHCO3水溶液和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)無水MgSO4干燥。用硅藻土過濾除去MgSO4后，真空濃縮濾液。殘余物用快速硅膠色譜法純化(洗脫甲苯/乙酸乙酯＝3/2)，得到360mg含有所需產(chǎn)物(8)和O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-1，3，6-三-O-乙?；?2-疊氮-2-脫氧-α-D-吡喃甘露糖苷(9)的殘余物。將混合物加熱溶于少量EtOH中，再在冰水中冷卻，得到晶體。因此得到201mg所需產(chǎn)物。
T.L.C；Rf＝0.39(甲苯/AcOEt＝1∶1)。
由化合物(6)的收率33％。
1H NMRδ(CDCl3)1.99，2.05，2.10，2.12，2.17 and 2.20(all s，21H，7COCH3)，3.51(dd，1H，J1，2＝3.8Hz J2，3＝10.5Hz，H-2)，3.61(ddd，1H，J4’，5’＝9.9Hz，J5’，6a’＝5.0Hz，J5’，6b’＝2.8Hz，H-5’)，3.83(t，1H，J4，5＝10.2Hz，H-4)，3.99(m，1H，H-5)，4.12(dd，1H，J5’，6b’＝2.8Hz J6a’，6b’＝12.3Hz，H-6b’)，4.24(dd，1H，J5，6b＝3.7Hz J6a，6b＝12.5Hz，H-6b)，4.30(dd，1H，J5，6a＝2.8Hz，J6a，6b＝12.5Hz，H-6a)4.38(dd，1H，J5，6a＝2.8Hz，J6a，6b＝12.5Hz，H-6a)，4.66(d，1H，J1’，2’＝0.6Hz，H-1’)，5.03(dd，1H，J2’，3’＝3.2Hz，J3’，4’＝9.9Hz，H-3’)，5.23(t，1H，J4’，5’＝9.9Hz，H-4’)，5.42(dd，1H，J1’2’＝0.6Hz，J2’，3’＝3.2Hz，H-2’)，5.43(dd，1H，J2，3＝10.5Hz，J3，4＝9.3Hz，H-3)，6.24(d，1H，J1，2＝3.8Hz，H-1)13C NMRδ(CDCl3)20.5-20.9(m，6COCH3)，60.3(C-2)，61.9(C-6)，62.2(C-6’)，65.8(C-4’)，68.1(C-2’)，69.7(C-3)，70.4(C-5)，70.7(C-3’)，72.5(C-5’)，74.0(C-4)，89.9(C-1)，97.5(C-1’)，168.6-170.4(m，6COCH3)C26H35O17的分析計(jì)算值C，47.20；H，5.33；N，6.35；實(shí)測值C，46.90；H，5.32；N，6.39。
HR-FAB MS[M+H]+C26H36N3O17的計(jì)算值662.205，實(shí)測值662.202。
mp+183.5-184.0℃(來自EtOH)，T.L.C；Rf＝0.39(甲苯/乙酸乙酯＝1∶1)。
3.O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-O-(3，6-二-O-乙?；?2-疊氮-2-脫氧-β-D-葡糖吡喃糖基)-(1→4)-3，6-二-O-芐基-2-脫氧-2-鄰苯二甲酰亞氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷烯丙酯(13)的合成合成流程(3) (G)O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-3，6-二-O-乙酰基-2-疊氮-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖(10)的合成將300mg化合物(8)溶于3.0ml THF中，向在冰水中冷卻的溶液中加入89μl芐胺，在室溫下攪拌48小時。在T.L.C上證實(shí)反應(yīng)終止后，將冰水加入到反應(yīng)混合物中，所得產(chǎn)物用氯仿萃取，依次用水、1N HCl水溶液和NaCl水溶液洗滌，經(jīng)無水MgSO4干燥。用硅藻土過濾除去MgSO4后，真空濃縮濾液。殘余物用快速硅膠色譜法純化(洗脫甲苯/乙酸乙酯＝3/2)，得到257mg所需產(chǎn)物(10)。
由化合物(8)的收率92％。
HR-FAB MS[M+H]+C24H34N3O16的計(jì)算值620.194；實(shí)測值620.192。
T.L.C；Rf＝0.26(甲苯/AcOEt＝1∶1)。
(H)O-(2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-3，6-二-O-乙酰基-2-疊氮-2-脫氧-α-D-葡糖吡喃糖基三氯乙亞胺酸酯(11)的合成將85mg化合物(10)溶于CH2Cl2(550μl)和CCl3CN(275μl)中，向在冰水中冷卻的該溶液中加入10.2μl DBU，在室溫下攪拌2小時。在T.L.C上證實(shí)反應(yīng)終止后，真空濃縮反應(yīng)混合物。所得殘余物用快速硅膠色譜法純化(洗脫甲苯/乙酸乙酯＝3/2)，得到80mg所需產(chǎn)物(11)。
由化合物(10)的收率76％。
1H NMRδ(CDCl3)1.97，2.02，2.07，2.08，2.16 and 2.17(all s，18H，6COCH3)，3.56-3.60(m，1H，H-5’)，3.60(dd，1H，J1，2＝3.4Hz，J2，3＝10.5Hz，H-2)，3.88(t，1H，J4，5＝9.8Hz，H-4)，4.09(dd，1H，J5’，6b’＝2.7Hz，J6a’，6b’＝12.5Hz，H-6b’)，4.09-4.14(m，1H，H-5)，4.21(dd，1H，J5，6b＝3.9Hz，J6a，6b＝12.5Hz，H-6b)，4.33(dd，1H，J5，6a＝2.2Hz，J6a，6b＝12.5Hz，H-6a)，4.33(dd，1H，J5’，6a’＝4.9Hz，J6a，，6b’＝12.5Hz，H-6a’)，4.69(s，1H，H-1’)，5.01(dd，1H，J2’，3’＝3.4Hz，J3’，4’＝10.0Hz，H-3’)，5.20(t，1H，J4’，5’＝9.8Hz，H-4’)，5.38(d，1H，J2’，3’＝3.4Hz，H-2’)，5.51(dd，1H，J2，3＝10.5Hz，J3，4＝9.5Hz，H-3)，6.41(d，1H，J1，2＝3.4Hz，H-1)，8.79(s，1H，NH)13C NMRδ(CDCl3)20.5-20.7(m，6COCH3)，60.8(C-2)，61.9(C-6)，62.3(C-6’)，65.8(C-4’)，68.2(C-2’)，69.3(C-3)，70.7(C-5 and C-3’)，72.6(C-5’)，74.1(C-4)，90.5(C(NH)CCl3)，94.1(C-1)，97.3(C-1’)，160.6(C(NH)CCl3)，169.5-170.4(m，6COCH3)T.L.C；Rf＝0.37(甲苯/乙酸乙酯＝1∶1)。
(I)O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-O-(3，6-二-O-乙?；?2-疊氮-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-3，6-二-O-芐基-2-脫氧-2-鄰苯二甲酰亞氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷烯丙酯(13)的合成將47mg化合物(11)和45mg O-3，6-O-二-芐基-2-脫氧-2-鄰苯二甲酰亞氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷烯丙酯(12)溶于700μl CH2Cl2中，向該溶液中加入70mg MS4A(分子篩)，在氮?dú)夥障?、?20℃攪拌30分鐘。
然后，加入2.3μl BF3OEt2，將所得混合物在氮?dú)夥障?、?20℃攪拌24小時。在T.L.C上證實(shí)反應(yīng)終止后，加入三乙胺(TEA)中和反應(yīng)混合物，通過硅藻土過濾除去MS4A，真空濃縮濾液。所得殘余物用快速硅膠色譜法部分純化(洗脫甲苯/乙酸乙酯＝5/2)，得到32mg含有所需化合物(13)和O-(2，3，4，6-四-O-乙?；?β-D-吡喃甘露糖基)-(1→4)-O-(3，6-二-O-乙酰基-2-疊氮-2-脫氧-α-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-3，6-二-O-芐基-2-脫氧-2-鄰苯二甲酰亞氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷烯丙酯(α∶β＝1∶2)的殘余混合物。進(jìn)一步用HPLC純化(洗脫己烷/乙醇＝12/1)，得到21mg所需產(chǎn)物(13)。
由化合物(11)的收率31％。
1H NMRδ(CDCl3)1.90，1.92，1.96，2.00，2.07，2.15(all s，18H，6COCH3)，3.08(m，1H，H-5’)，3.27(dd，1H，J1’，2’＝8.1Hz，J2’，3’＝10.2Hz，H-2’)，3.46(ddd，1H，J4″，5″＝9.9Hz，J5″，6a″＝4.8Hz，J5″，6b″＝2.6Hz，H-5″)，3.51-3.56(m，1H，H-5)，3.56(t，1H，J4’，5’＝9.8Hz，H-4’)，3.76(dd，1H，J5，6b＝1.4Hz，J6a，6b＝10.9Hz，H-6b)，3.87(dd，1H，J5，6a＝2.9Hz，J6a，6b＝10.9Hz，H-6a)，3.91(dd，1H，J＝6.3Hz，J＝13.0Hz，CHH’CH＝CH2)，3.98-4.20(m，7H，H-6b″，H-6b’，H-4，H-2，H-6a’，H-3，CHH’CH＝CH2)，4.27(dd，1H，J5″， 6a″＝4.8Hz，J6a″，6b″＝12.3Hz，H-6a″)，4.27 and 4.66(ABq，2H，J＝12.5Hz，PhCH2)，4.30(d，1H，J1’，2’＝8.1Hz，H-1’)，4.42和4.73(ABq，2H，J＝12.0Hz，PhCH2)，4.45(s，1H，H-1″)，4.76(dd，1H，J2’，3’＝3.4Hz，J3’，4’＝9.9Hz，H-3’)，4.92(dd，1H，J2″，3″＝3.4Hz，J3″，4″＝9.9Hz，H-3″)，4.93(dd，1H，J＝1.5Hz，J反式＝10.4Hz，CH＝CH反式H)，4.93(dd，1H，J＝1.5Hz，J順式＝17.2Hz，CH＝CHHcis)，5.06(d，1H，J1，2＝8.4Hz，H-1)，5.14(t，1H，J4″， 5″＝9.9Hz，H-4″)，5.30(d，1H，J2″，3″＝3.4Hz，H-2″)，5.60(m，1H，CH＝CH2)，6.70-7.58(m，14H，Ar-H)
13C NMRδ(CDCl3)20.5-20.6(m，6COCH3)，55.5(C-2)，62.2(C-6’和C-6″)，64.5(C-2’)，65.9(C-4″)，67.8(C-6)，68.1(C-2″)，69.7(CH2CH＝CH2)，70.7(C-3″)，71.9(C-3’)，72.0(C-5’)，72.5(C-5″)，73.5和74.3(2PhCH2)，74.6(C’-4和C-5)，78.2(C-4)，97.3(C-1和C-1″)，100.8(C-1’)，117.3(CH2CH＝CH2)，127.0-133.7(m，18Ar-C)，137.9(CH2CH＝CH2)，169.6-170.4(m，8C＝O)HR-FAB MS[M+Na]+C55H62N4O22Na的計(jì)算值1153.375，實(shí)測值1153.374T.L.C；Rf＝0.53(甲苯/乙酸乙酯＝1∶1)。
(J)(糖基受體的數(shù)據(jù))O-3，6-二-O-芐基-2-脫氧-2-鄰苯二甲酰亞氨基-β-D-吡喃葡萄糖苷烯丙酯(12)按照以下合成流程，合成氨基-保護(hù)的吡喃葡萄糖苷(12)。

1H NMRδ(CDCl3)3.63(m，1H，H-5)，3.76-3.85(m，3H，H-4，H-6a and H-6b)，3.97(dd，1H，J＝13.1Hz，J＝6.1Hz，CHH’CH＝CH2)，4.15-4.26(m，3H，H-2，H-3和CHH’CH＝CH2)，4.52and 4.73(ABq，2H，J＝12.2Hz，PhCH2)，4.58和4.64(ABq，2H，J＝11.9Hz，PhCH2)，4.99(dd，1H，J＝1.3Hz，J反式＝10.3Hz，CH＝CH順式H反式)，5.07(dd，1H，J＝1.3Hz，J順式＝17.2Hz，CH＝CH順式H反式)，5.17(d，1H，J1，2＝8.1Hz，H-1)，5.61-5.70(m，1H，CH＝CH2)，6.93-7.67(m，14H，Ar-H)13C NMRδ(CDCl3)55.3(C-2)，69.7(C-C＝C)，70.7(C-6)，73.5(C-5)，73.8and 74.3(Ph-C)，74.5(C-4)，78.7(C-3)，97.4(C-1)，117.3(C-C＝C)，127.4-128.5(m，Ar-C)，133.6(C-C＝C)，137.6和138.2(C＝O)HR-FAB MS[M+H]+C31H32NO7的計(jì)算值530.218，實(shí)測值530.215。
T.L.C；Rf＝0.72(甲苯/乙酸乙酯＝1∶1)。
工業(yè)實(shí)用性糖基轉(zhuǎn)移酶和添加的糖單元通常用于糖鏈的自動合成儀，因?yàn)楫?dāng)糖鏈通過加入新的糖而延伸時，糖基轉(zhuǎn)移酶是方便的。然而，尚未發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶能制備天冬酰胺結(jié)合型糖蛋白的核心糖鏈結(jié)構(gòu)還原端的三糖部分(Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN)，化學(xué)合成法是制備它的唯一制備方法。
本發(fā)明通過利用以合理價(jià)格容易購得的半乳甘露聚糖、瓜爾膠和/或甘露聚糖衍生物等天然多糖，提供了制備核心糖鏈還原端的三糖部分的簡便方法。
權(quán)利要求
1.天冬酰胺結(jié)合型糖蛋白的核心糖鏈結(jié)構(gòu)還原端的三糖Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN的制備方法，該方法包括下述步驟(1)通過水解具有甘露糖β-1，4-鍵的多糖并保護(hù)所得水解產(chǎn)物的OH基團(tuán)，制備下式(I)的甘露糖二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的步驟 其中P1為OH保護(hù)基，波浪線表示-OP1連接在直立或平伏位置或兩者的混合。
2.權(quán)利要求1的天冬酰胺結(jié)合型糖蛋白的核心糖鏈結(jié)構(gòu)還原端的三糖Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN的制備方法，該方法還包括下述各步驟(2)制備烯糖化合物的步驟，其中甘露糖二糖還原端的甘露糖通過甘露糖二糖(ManP1β1→4ManP1型)的鹵化和還原反應(yīng)轉(zhuǎn)化為烯糖，和(3)通過上述烯糖化合物的疊氮化硝化反應(yīng)，制備下式(II)所示的疊氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的步驟，其中還原端甘露糖的2-疊氮基連接在平伏位置； 其中P1的定義同上，波浪線表示-NO2連接在直立或平伏位置或兩者的混合。
3.權(quán)利要求2的天冬酰胺結(jié)合型糖蛋白的核心糖鏈結(jié)構(gòu)還原端的三糖Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN的制備方法，該方法還包括下述步驟(4)用離去基團(tuán)取代疊氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的硝基的步驟，和(5)制備下式(III)所示的三糖化合物(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型)的步驟 其中P1、P2、P3和P11的定義同上，所述步驟通過使具有離去基團(tuán)的產(chǎn)物與下式所示的氨基-保護(hù)的吡喃葡萄糖苷反應(yīng)而實(shí)施 其中P2為OH保護(hù)基，P3為氨基保護(hù)基，P11為OH保護(hù)基。
4.權(quán)利要求3的天冬酰胺結(jié)合型糖蛋白的核心糖鏈結(jié)構(gòu)還原端的三糖Manβ1→4GlcNβ1→4GlcN的制備方法，該方法還包括下述步驟(6)通過將上述三糖化合物還原端與保護(hù)的天冬酰胺衍生物偶聯(lián)，制備下式(IV)所示的天冬酰胺結(jié)合型三糖Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2化合物的步驟 其中P1和P2的定義同上，P4和P6獨(dú)立地為氨基保護(hù)基，P5為羧基保護(hù)基。
5.下式(I)所示的甘露糖二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的制備方法 其中P1為OH保護(hù)基，波浪線表示-OP1連接在直立或平伏位置或兩者的混合，所述方法通過水解具有甘露糖β-1，4-鍵的多糖并保護(hù)所得水解產(chǎn)物的OH基團(tuán)而實(shí)施。
6.下式(II)所示的疊氮二糖(ManP1β1→4ManP1型)的制備方法，其中還原端甘露糖的2-疊氮基連接在平伏位置 其中P1為OH保護(hù)基，波浪線表示-NO2連接在直立或平伏位置或兩者的混合；所述方法包括制備烯糖化合物的步驟，其中通過下式(I)所示的甘露糖二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的鹵化和還原反應(yīng)，將所述甘露糖二糖還原端的甘露糖轉(zhuǎn)化為烯糖，隨后使所述烯糖化合物進(jìn)行疊氮化硝化反應(yīng) 其中P1的定義同上，波浪線表示-OP1連接在直立或平伏位置或兩者的混合。
7.下式(III)所示的三糖化合物的制備方法 其中P1、P2、P3和P11的定義同上，所述方法包括用離去基團(tuán)取代下式(II)所示的疊氮二糖化合物(ManP1β1→4ManP1型)的硝基的步驟 其中P1的定義同上，波浪線表示-NO2連接在直立或平伏位置或兩者的混合；還原端甘露糖的2-疊氮基連接在平伏位置，然后，使所述具有離去基團(tuán)的取代化合物與下式氨基-保護(hù)的吡喃葡萄糖苷反應(yīng) 其中P2為OH保護(hù)基，P3為氨基保護(hù)基，P11為OH保護(hù)基。
8.下式(IV)所示的天冬酰胺結(jié)合型三糖化合物Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2的制備方法 其中P1和P2的定義同上，P4和P6獨(dú)立地為氨基保護(hù)基，P5為羧基保護(hù)基，所述方法包括使以下三糖化合物(III)的還原端與保護(hù)的天冬酰胺衍生物偶聯(lián) 其中P1、P2、P3和P11的定義同上。
9.下式(II)所示的疊氮二糖(ManP1β1→4ManP1型)化合物 其中P1為OH保護(hù)基，波浪線表示-NO2連接在直立或平伏位置或兩者的混合。
10.下式(III)所示的三糖化合物(Manβ1→4GlcNP1β1→4GlcNP2型) 其中P1、P2和P11為OH保護(hù)基，P3為氨基保護(hù)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及化學(xué)合成天冬酰胺結(jié)合型糖蛋白的核心糖鏈結(jié)構(gòu)還原端的三糖部分。利用非常廉價(jià)的具有甘露糖β－1，4－鍵的天然多糖為原料，形成甘露糖的β1→4糖苷鍵。
文檔編號C07H1/08GK1918174SQ200480041979
公開日2007年2月21日 申請日期2004年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月26日
發(fā)明者西村紳一郎, 武川泰啟 申請人:鹽野義制藥株式會社