專利名稱：乙型肝炎病毒表面抗原呈陽性的確認方法和試劑盒的制作方法
乙型肝炎病毒表面抗原呈陽性的確認方法和試劑盒
技術領域：
本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒表面抗原Ofepatitis Virus B SurfaceAnti gen， HBsAg)免疫檢測領域，特別涉及一種使HBsAg化學發(fā)光免疫測定呈有反應性或在“灰區(qū)”范 圍內的樣本檢測結果得到確認的檢測方法與試劑盒。
背景技術：
乙型肝炎病毒Ofepatitis Virus B, HBV)是乙型肝炎的病原體。HBsAg是HBV感 染的重要血清學標志。在血清(或其他體液)中存在HBsAg表明受檢者感染HBV。HBsAg 實驗室檢測方法主要為免疫測定，常用的是放射性免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫測定(ELISA)和 化學發(fā)光免疫檢測(CLIA)?；瘜W發(fā)光免疫分析是近十年來在世界范圍內發(fā)展非常迅速的非 放射性免疫分析。它具有高靈敏度、檢測范圍寬、操作簡便快速、標記物穩(wěn)定性好、無污染、 儀器簡單經(jīng)濟等優(yōu)點。CLIA發(fā)展迅猛，已占各種免疫分析的首位，是目前放射免疫分析和 酶聯(lián)免疫分析最佳的取代者。靈敏度高是化學發(fā)光免疫分析關鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可達 10-16mol/L(RIA為10-12mol/L)。化學發(fā)光免疫分析能夠檢出酶聯(lián)免疫分析方法無法檢出 的物質，對疾病的早期診斷具有十分重要的意義。CLIA發(fā)光強度在4 6個量級之間與測 定物質濃度間呈線性關系，這與顯色的酶免疫分析吸光度(0D值)為2.0的范圍相比，優(yōu)勢 明顯。HBsAg化學發(fā)光免疫檢測的基本原理和操作步驟如下(參見圖1)在聚苯乙 烯微孔板的反應孔內包被針對HBsAg的特異性抗體(抗-HBs)，在反應孔中加入待測樣 本，保溫反應、洗滌后加入酶標記的抗-HBs，如果樣本中含有HBsAg，則在反應孔中形成 抗-HBs-HBsAg-抗-HBs ·酶復合物。在酶的催化作用下，發(fā)光底物發(fā)生化學反應并釋放出 大量的能量，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的中間體，當中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時，可同時發(fā)射出光子。利用 發(fā)光信號測量儀器即可測量RLU (Relative LightUnit，相對光單位)，該RLU與樣品中的待 測物質的量成正比。樣本的RLU值大于Cutoff值(臨界值)為陽性，小于Cutoff值為陰 性。在HBsAg的化學發(fā)光免疫檢測中，很多原因可導致假陽性反應。如樣本中可能存 在非特異性干擾物質如嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導的抗鼠IgG抗體和交 叉反應物質等。另外一些外源性干擾物質或操作不當均能引起假陽性反應。為了簡化檢測 步驟和縮短檢測時間，國產(chǎn)的HBsAg化學發(fā)光免疫檢測試劑多采用一步法，即樣本和酶標 記抗-HBs同時加入，如圖2所示。這種一步快速法總體上講也能滿足臨床需要，但由于缺乏 了兩步法中第一步反應后的洗滌，樣本中如有非特異性干擾物存在，測定中可能促發(fā)假陽 性反應。另外，為了縮短時間，快速法試劑成分的改變也增加了非特異性反應出現(xiàn)的可能。由于HBsAg陽性可作為HBV感染的一種依據(jù)，國外對于HBsAg化學發(fā)光免疫檢測 呈陽性的樣本稱為有反應性，一般都要進行確認，排除假陽性后才能報告HBsAg陽性。國外HBsAg化學發(fā)光免疫檢測試劑的實際敏感度一般顯著高于其標示的敏感度， 加之國外試劑的精密度較好(Cutoff值附近的變異系數(shù)小于10% )，因此低于Cutoff的樣本即可判為HBsAg陰性，而高于或等于Cutoff值的樣本則需進行確認以排除假陽性。國內 HBsAg化學發(fā)光免疫檢測試劑的實際敏感度一般與標示的敏感度相近，精密度略差(出廠 時要求變異系數(shù)小于15%，臨床測定中的變異系數(shù)可能更高)，因此測定數(shù)值在Cutoff值 附近一定范圍內的樣本就無法確定其是有反應性還是無反應性，而出現(xiàn)“灰區(qū)”問題。因此， 樣本檢測結果如果在“灰區(qū)”內，HBsAg的確認試驗不僅要確認屬于“有反應性”的樣本是否 為HBsAg陽性，也要排除實際屬于“無反應性的” HBsAg陰性樣本。
發(fā)明內容基于此，有必要提供一種HBsAg呈陽性的確認方法，以進一步確認HBsAg化學發(fā)光 免疫檢測的有反應性的結果，排除傳統(tǒng)的該檢測方法中存在的假陽性。同時，還有必要提供一種HBsAg呈陽性的確認試劑盒。一種HBsAg呈陽性的確認方法，包括如下步驟提供HBsAg化學發(fā)光免疫檢測的 測定結果為有反應性的樣本；向樣本中加入特異性抗-HBs ；另外向樣本中加入不含特異性 抗-HBs的對照試劑作為對照；對加入特異性抗-HBs的樣本及加入對照試劑的樣本分別進 行HBsAg的化學發(fā)光免疫檢測；比較加入特異性抗-HBs的樣本及加入對照試劑的樣本的 RLU,若加入特異性抗-HBs的樣本的RLU比加入對照試劑的樣本的RLU下降至少30%，提示 樣本為HBsAg陽性。優(yōu)選的，上述下降至少為50%時，提示樣本為HBsAg陽性。優(yōu)選的，還包括在進行化學發(fā)光免疫檢測前將樣本用溶劑進行稀釋的步驟。優(yōu)選的，上述稀釋的比例為1 50，1 100,1 1000,1 10000，或在此范圍內
的任意稀釋度。優(yōu)選的，有反應性包括HBsAg化學發(fā)光免疫檢測結果在“灰區(qū)”范圍的情況。優(yōu)選的，“灰區(qū)”范圍的下限為Cutoff值X 0. 7，“灰區(qū)”范圍的上限為Cutoff 值X2。優(yōu)選的，還包括選自以下的能夠使化學發(fā)光免疫檢測結果的RLU提高至高于“灰 區(qū)”上限的步驟1)延長樣本與特異性抗-HBs的反應時間至30min-2h ；2)提高樣本與特異 性抗-HBs的反應溫度至35°C -42°C ；3)樣本與特異性抗-HBs反應后進行洗滌，然后再加 入酶標記抗體；4)延長加入酶標記抗體后的反應時間至30min-4h ；5)提高加入酶標記抗體 后的反應溫度至35°C -42°C ；6)加大樣本的加入量至50-500 μ 1。優(yōu)選的，特異性抗-HBs為來源于人、小鼠、大鼠、豚鼠、馬、兔或羊的抗體。一種HBsAg呈陽性的確認試劑盒，用于對HBsAg化學發(fā)光免疫檢測結果為有反應 性的樣本進行陽性確認，包括特異性抗-HBs抗體試劑、HBsAg化學發(fā)光免疫檢測試劑及說 明權利要求1方法的操作步驟與檢測結果的說明書。優(yōu)選的，加入特異性抗-HBs的樣本的RLU比加入對照試劑的樣本的RLU下降至少 50%，提示樣本為HBsAg陽性。優(yōu)選的，說明書還包括在進行化學發(fā)光免疫檢測前將樣本用溶劑進行稀釋的步驟 并將稀釋樣本進行同樣的化學發(fā)光免疫檢測的說明。優(yōu)選的，稀釋的比例為1 50，1 100,1 1000,1 10000，或在此范圍內的任
意稀釋度。
優(yōu)選的，有反應性包括HBsAg化學發(fā)光免疫檢測結果在“灰區(qū)”范圍的情況。優(yōu)選的，“灰區(qū)”范圍的下限為Cutoff值X 0. 7，“灰區(qū)”范圍的上限為Cutoff 值X2。優(yōu)選的，試劑盒的說明書中還包括選自以下的能夠使化學發(fā)光免疫檢測結果的 RLU值提高至高于“灰區(qū)”上限的步驟的說明1)延長樣本與特異性抗-HBs的反應時間 至30min-2h ；2)提高樣本與特異性抗-HBs的反應溫度至35°C -42°C ；3)樣本與特異性 抗-HBs反應后進行洗滌，然后再加入酶標記抗體；4)延長加入酶標記抗體后的反應時間 至30min-4h ；5)提高加入酶標記抗體后的反應溫度至35°C -42°C;6)加大樣本的加入量至 50-500 μ 1。優(yōu)選的，特異性抗-HBs為來源于人、小鼠、大鼠、豚鼠、馬、兔或羊的抗體。通過對HBsAg化學發(fā)光免疫檢測過程中的有反應性或在“灰區(qū)”范圍內的樣本進 行檢測確認，可以有效排除化學發(fā)光免疫檢測過程中存在的假陽性對結果的判斷。
圖1為兩步法CLIA測定HBsAg的示意圖。圖2為一步快速法CLIA測定HBsAg的示意圖。
具體實施方式以下主要結合實施方案及具體實施例對本發(fā)明的HBsAg呈陽性的確認方法和試 劑盒作進一步的說明。本發(fā)明是在HBsAg化學發(fā)光免疫檢測試劑盒與檢測方法的基礎上開發(fā)的新產(chǎn)品 與新方法。目的是使HBsAg化學發(fā)光免疫檢測試劑盒檢測結果呈有反應性的或在“灰區(qū)”范 圍內的樣本得到確認。本發(fā)明的實施方案中，通常采用一般操作程序，該一般操作程序適合樣本RLU值 > Cutoff值X 2時的檢測；當樣本RLU值介于Cutoff值X0. 7和Cutoff值X 2之間時，可 采用“灰區(qū)”操作程序。在不同的地區(qū)、不同的實驗室及使用不同的HBsAg CLIA Kit (HBsAg 化學發(fā)光免疫檢測試劑盒)時，“灰區(qū)”范圍可能有所不同。本發(fā)明的實施方案中的一般操作程序，包括如下步驟向樣本中加入特異性抗-HBs (檢測孔)或不含特異性抗-HBs的對照試劑；對所述加入特異性抗-HBs的樣本及加入對照試劑的樣本分別進行HBsAg免疫檢 測；對加入特異性抗-HBs的樣本檢測結果及加入對照試劑的樣本檢測結果進行比 較；如果加入特異性抗-HBs的樣本檢測結果比加入對照試劑的樣本檢測結果下降至 少50%，可確認樣本為HBsAg陽性。本領域技術人員應理解，由于加入特異性抗-HBs的目 的是與HBsAg酶標記抗體競爭結合HBsAg，因此降低50%是比較安全的檢測值，但是低于此 降低值的其他能夠說明有競爭性關系的降低值也是本發(fā)明的范圍，例如至少30%。本發(fā)明實施方案中，包括對陽性對照進行檢測。陽性對照對照孔RLU值應大于 Cutoff值X10，且抑制率必須大于80%，否則實驗結果無效。所述陽性對照為HBsAg強陽性以及anti-HIV、anti-HCV、anti-TP陰性的血清，經(jīng)滅活后稀釋制得，含HBsAg約5ng/ml。本發(fā)明的另一實施方案還涉及“灰區(qū)”操作程序。該程序與一般操作程序基本相 同，與一般操作程序不同點為加入酶標記物后溫育時間相對延長，如120min。本發(fā)明實施方案中，檢測所需儀器為光譜范圍為300nm 600nm的化學發(fā)光讀數(shù) 儀。以下為具體實施例部分實施例1 一般操作程序A.操作步驟取出確認試劑盒及HBsAg化學發(fā)光免疫檢測試劑盒(麗珠HBsAg CLIAKit)，平衡 (15-20min)至室溫。用生理鹽水1 100稀釋樣本，檢測時需同時測定原倍樣本及稀釋樣本。每次試驗設空白一孔(孔9)，空白孔中僅加入對照試劑100 μ 1。原倍樣本及稀釋樣本需設定對照孔和檢測孔各1孔。每次試驗設陽性對照一份，陰性對照(麗珠HBsAg CLIA Kit組分，為HBsAg陰性 以及anti-HIV、anti-HCV、anti-TP陰性的血清，經(jīng)滅活后使用，陰性對照讀值X2. 1即為 Cutoff值)一份，同樣為其設對照孔和檢測孔各1孔。在對照孔中加入對照試劑50 μ 1，檢測孔中加入特異性抗體試劑50 μ 1 (見表1)。將100倍稀釋樣本加入到1孔對照孔(孔1)和1孔檢測孔(孔2)，每孔50 μ 1 ； 將原倍樣本加入到1孔對照孔(孔3)和1孔檢測孔(孔4)，每孔50 μ 1 (見表1)。將陽性對照加入到1孔對照孔(孔5)和1孔檢測孔(孔6)，每孔50 μ 1 (見表1)。輕拍混勻，或置于振蕩器上混勻，置37°C溫育30min。每孔加入酶標記物(HBsAg CLIA Kit組分)50 μ 1 ；輕拍混勻，或置于振蕩器上混 勻。溫育，參照HBsAg CLIAKit說明書。洗板，參照HBsAg CLIAKit說明書。讀值，參照HBsAg CLIAKit說明書。表 權利要求
一種HBsAg呈陽性的確認方法，其特征在于，包括如下步驟提供HBsAg化學發(fā)光免疫檢測的測定結果為有反應性的樣本；向所述樣本中加入特異性抗 HBs；另外向所述樣本中加入不含特異性抗 HBs的對照試劑作為對照；對所述加入特異性抗 HBs的樣本及加入對照試劑的樣本分別進行HBsAg的化學發(fā)光免疫檢測；比較加入特異性抗 HBs的樣本及加入對照試劑的樣本的RLU，若加入特異性抗 HBs的樣本的RLU比加入對照試劑的樣本的RLU下降至少30％，提示所述樣本為HBsAg陽性。
2.如權利要求1所述的HBsAg呈陽性的確認方法，其特征在于，所述下降至少為50%。
3.如權利要求1或2所述的HBsAg呈陽性的確認方法，其特征在于，還包括在進行化學 發(fā)光免疫檢測前將所述樣本用溶劑進行稀釋的步驟。
4.如權利要求3所述的HBsAg呈陽性的確認方法，其特征在于，所述稀釋的比例為 1 50,1 100,1 1000,1 10000，或在此范圍內的任意稀釋度。
5.如權利要求1所述的HBsAg呈陽性的確認方法，其特征在于，所述有反應性包括 HBsAg化學發(fā)光免疫檢測結果在“灰區(qū)”范圍的情況。
6.如權利要求5所述的HBsAg呈陽性的確認方法，其特征在于，所述“灰區(qū)”范圍的下 限為Cutoff值X0. 7，“灰區(qū)”范圍的上限為Cutoff值X2。
7.如權利要求1所述的HBsAg呈陽性的確認方法，其特征在于，還包括選自以下的能夠 使化學發(fā)光免疫檢測結果的RLU值提高至高于“灰區(qū)”上限的步驟1)延長所述樣本與所述 特異性抗-HBs的反應時間至30min-2h ；2)提高所述樣本與所述特異性抗-HBs的反應溫度 至35°C -42°C ；3)所述樣本與所述特異性抗-HBs反應后進行洗滌，然后再加入所述酶標記 抗體；4)延長加入所述酶標記抗體后的反應時間至30min-4h ；5)提高加入所述酶標記抗體 后的反應溫度至35°C -42°C ；6)加大所述樣本的加入量至50-500 μ 1。
8.如權利要求1-7任意一項所述的HBsAg呈陽性的確認方法，其特征在于，所述特異性 抗-HBs為來源于人、小鼠、大鼠、豚鼠、馬、兔或羊的抗體。
9.一種HBsAg呈陽性的確認試劑盒，用于對HBsAg化學發(fā)光免疫檢測結果為有反應性 的樣本進行陽性確認，包括特異性抗-HBs抗體試劑、HBsAg化學發(fā)光免疫檢測試劑及說明 權利要求1或2所述HBsAg呈陽性的確認方法的操作步驟與檢測結果的說明書。
10.如權利要求9所述的HBsAg呈陽性的確認試劑盒，其特征在于，所述加入特異性 抗-HBs的樣本的RLU比加入對照試劑的樣本的RLU下降至少50%，提示所述樣本為HBsAg 陽性。
11.如權利要求9或10所述的HBsAg呈陽性的確認試劑盒，其特征在于，所述說明書中 還包括在進行化學發(fā)光免疫檢測前將所述樣本用溶劑進行稀釋的步驟并將稀釋后樣本進 行同樣的化學發(fā)光免疫檢測的說明。
12.如權利要求11所述的HBsAg呈陽性的確認試劑盒，其特征在于，所述稀釋的比例為 1 50,1 100,1 1000,1 10000，或在此范圍內的任意稀釋度。
13.如權利要求9所述的HBsAg呈陽性的確認方法，其特征在于，所述有反應性包括 HBsAg化學發(fā)光免疫檢測結果在“灰區(qū)”范圍的情況。
14.如權利要求13所述的HBsAg呈陽性的確認試劑盒，其特征在于，所述“灰區(qū)”范圍的下限為Cutoff值X0. 7，“灰區(qū)”范圍的上限為Cutoff值X 2。
15.如權利要求9所述的HBsAg呈陽性的確認試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的說明 書中還包括選自以下的能夠使化學發(fā)光免疫檢測結果的RLU值提高至高于“灰區(qū)”上限的 步驟的說明1)延長所述樣本與所述特異性抗-HBs的反應時間至30min-2h ；2)提高所述 樣本與所述特異性抗-HBs的反應溫度至35°C -42°C ；3)所述樣本與所述特異性抗-HBs反 應后進行洗滌，然后再加入所述酶標記抗體；4)延長加入所述酶標記抗體后的反應時間至 30min-4h ；5)提高加入所述酶標記抗體后的反應溫度至35°C -42°C ；6)加大所述樣本的加 入量至50-500 μ 1。
16.如權利要求9-15任意一項所述的HBsAg呈陽性的確認試劑盒，其特征在于，所述特 異性抗-HBs為來源于人、小鼠、大鼠、豚鼠、馬、兔或羊的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種HBsAg呈陽性的確認方法和試劑盒，通過對HBsAg化學發(fā)光免疫檢測過程中的有反應性或在“灰區(qū)”范圍內的樣本進行檢測確認，可以有效排除化學發(fā)光免疫檢測過程中存在的假陽性對結果判斷的影響。
文檔編號G01N21/76GK101943700SQ20101027927
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月10日 優(yōu)先權日2010年9月10日
發(fā)明者胡大銀 申請人:珠海麗珠試劑股份有限公司