專利名稱：一種制備紹興黃酒成品麥曲中微生物胞外酶雙向電泳樣品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備紹興黃酒成品麥曲中包含各種微生物胞外酶蛋白的方法，特 別涉及一種制備紹興黃酒成品麥曲中包含各種微生物胞外酶蛋白雙向電泳樣品的方法。
背景技術(shù)：
黃酒是世界三大釀造酒之一。“以麥制曲，用曲釀酒”是中國黃酒的特色，傳統(tǒng)的麥 曲生產(chǎn)是以破碎后的小麥為原料，采用天然富集、自然培育微生物的方法制備而來。麥曲在 黃酒釀造中具有極其重要的地位，被喻為“酒之骨”，它不但是黃酒釀造的“粗酶制劑”，而且 麥曲內(nèi)蓄積了多種微生物的代謝產(chǎn)物，賦予了黃酒獨特的風(fēng)味。研究表明，麥曲中微生物的 胞外酶主要是來源于各種霉菌和細(xì)菌分泌的各類水解酶系，包括淀粉酶系、蛋白酶系、纖維 素酶系、半纖維素酶系、脂肪酶系等等。這些復(fù)合酶系共同作用將麥曲中的各種大分子物質(zhì) (淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪等)分解為小分子物質(zhì)，以便微生物的生長、繁殖、產(chǎn)酶、產(chǎn)酒。目前國內(nèi)直接針對黃酒麥曲中微生物胞外酶的研究開展得較少，且主要是利用色 譜技術(shù)對麥曲中單一酶類進行純化及開展酶學(xué)性質(zhì)研究，通過類似方法無法達到全面獲取 麥曲中微生物胞外酶組成，并確定其微生物來源的目的。宏蛋白質(zhì)組學(xué)是最近幾年被提出 的新概念，其定義是指對某一特定環(huán)境中微生物群落的所有蛋白質(zhì)進行大規(guī)模的分析和鑒 定。宏蛋白質(zhì)組的研究策略與經(jīng)典的蛋白質(zhì)組研究策略相似，主要包括環(huán)境總蛋白的提取 制備、蛋白質(zhì)分離以及質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)比對3個步驟。應(yīng)用宏蛋白質(zhì)組學(xué)理論和思想，利用 雙向電泳技術(shù)對從紹興黃酒成品麥曲中浸提出的所有可溶性蛋白(主要是各種微生物分 泌的胞外酶蛋白)進行高分辨率分離，能為后續(xù)通過質(zhì)譜分析手段大規(guī)模鑒定麥曲中的微 生物胞外酶，并進一步弄清其微生物來源奠定基礎(chǔ)。選擇合適的樣品制備方法是雙向電泳成功的關(guān)鍵因素之一，制備方法選擇不當(dāng)， 會造成大量鹽離子和其它干擾物質(zhì)殘留，嚴(yán)重影響等電聚焦，從而影響雙向電泳的效果。麥 曲中的各種微生物分泌所產(chǎn)的胞外酶必須盡可能從固態(tài)麥曲中利用適當(dāng)?shù)木彌_體系浸提 制備出來，同時還要去除多糖、脂類、核酸等干擾雙向電泳的雜質(zhì)，并需盡量避免目標(biāo)蛋白 樣品的降解。迄今為止，還沒有制備紹興黃酒成品麥曲微生物胞外酶雙向電泳樣品的有效 方法和技術(shù)，從而導(dǎo)致利用蛋白組學(xué)技術(shù)進行黃酒麥曲微生物胞外酶的相關(guān)研究一直停滯 不前。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種制備較高質(zhì)量的紹興黃酒成品麥曲中微 生物胞外酶雙向電泳樣品的方法。本發(fā)明所提供的制備紹興黃酒成品麥曲中微生物胞外酶雙向電泳樣品的方法，包 括以下步驟1)稱取一定質(zhì)量的紹興黃酒成品麥曲，加入適當(dāng)體積濃度為0.09-0. 15mol/L，pH3. 8-5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，同時加入1片蛋白酶抑制劑混合片(Roche， complete )，在4°C條件下浸提4-12h ；然后依次用4層紗布和濾紙過濾，得濾液。利用冷凍 高速離心機使濾液在4°C，lOOOOr/min條件下離心30min，收集上清液；2)向步驟1)得到的粗酶提取液中加入4-6倍體積預(yù)冷的丙酮溶液I (其中含 0. 01-0. 03mol/L的二硫蘇糖醇，0. 05-0. 2g/mL的三氯乙酸)，混勻，_20°C放置Ih ；低溫高速 離心收集沉淀，向沉淀中加入2mL預(yù)冷的丙酮溶液II (其中含0. 01-0. 03mol/L的二硫蘇糖 醇)，清洗沉淀，-20°C放置Ih ；低溫高速離心收集沉淀，采用預(yù)冷的丙酮溶液II重復(fù)清洗沉 淀一次；用保鮮膜封蓋裝有蛋白沉淀的離心管管口，-20°C揮發(fā)殘留丙酮。3)將步驟2)中制得的蛋白沉淀加入適量的樣品裂解液(其中含6-8mol/L尿素、 0. 02g/mL的CHAPS、體積百分含量為0. 5_2%的IPG緩沖液、0. 002g/mL的溴酚藍)，室溫下 充分溶解，離心取上清液，此上清液即為紹興黃酒成品麥曲微生物胞外酶雙向電泳樣品；所 述裂解液組成為樣品裂解液為8mol/L尿素、0. 02g/mL的CHAPS、體積百分含量為0. 5%的 IPG緩沖液、0. 002g/mL的溴酚藍。所述步驟1)中紹興黃酒成品麥曲用量為20g-30g/50mL，優(yōu)選為25g/50mL。所述步驟1)乙酸-乙酸鈉緩沖溶液為pH5. 0，濃度為0. 09mol/L。所述步驟1)中在4°C條件下浸提麥曲12h。所述步驟2)中，所述丙酮溶液I為4倍體積。所述丙酮溶液I中含0. 02mol/L的二硫蘇糖醇，0. lg/mL的三氯乙酸。所述步驟2)丙酮溶液II中含0. 02mol/L的二硫蘇糖醇。所述步驟3)中，制得的蛋白沉淀與樣品裂解液的質(zhì)量體積比為 100mg/400 μ L-150mg/400 μ L,優(yōu)選為 150mg/400 μ L。所述紹興黃酒成品麥曲為紹興黃酒成品機制曲、腳踏曲或熟曲。所述紹興黃酒成品麥曲為紹興黃酒成品機制曲。為了使樣品中殘留的丙酮既能完全揮發(fā)，又不影響樣品的制備質(zhì)量，所述步驟2) 中最后用保鮮膜封蓋裝有蛋白沉淀的離心管管口，置于-20°C環(huán)境的優(yōu)選時間為48h。發(fā)明人通過長時間的科學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)具有較低離子強度的弱酸性緩沖液提取紹興 黃酒成品麥曲中微生物胞外酶總蛋白，能最大限度地提取出含有目標(biāo)蛋白的樣品。采用三 氯乙酸-丙酮法沉淀蛋白質(zhì)，可以有效地去除鹽離子、多糖、脂類、核酸等干擾電泳效果的 物質(zhì)。另外，本研究在提取蛋白的過程中，增加了丙酮清洗的次數(shù)，從而能夠更徹底地去除 上述雜質(zhì)。使用的樣品裂解液中，尿素作為變性劑能破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，打斷非共價連 接。CHAPS是一種兼性去污劑，它能打斷蛋白質(zhì)分子或亞基間的疏水作用，增加蛋白質(zhì)的溶 解性。加入二硫蘇糖醇是為了打斷二硫鍵，并使所有蛋白質(zhì)處于還原狀態(tài)。IPG緩沖液能通 過電荷與電荷之間的反應(yīng)減少蛋白質(zhì)結(jié)合，從而增加蛋白質(zhì)的可溶性。本發(fā)明制備紹興黃酒成品麥曲中微生物胞外酶雙向電泳樣品的方法快速可靠、簡 單易行，可獲得較高質(zhì)量且重復(fù)性較好的雙向電泳圖譜，便于后續(xù)的生物質(zhì)譜分析鑒定蛋 白，具有較大的實際應(yīng)用價值。


圖1為紹興黃酒成品機制麥曲微生物胞外酶的雙向電泳圖譜
具體實施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常 理解的含義。在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。實施例11、樣品制備1)稱取25g浙江紹興市某黃酒廠成品機制麥曲，加入50mL濃度為0.09mol/L， PH5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，同時加入1片蛋白酶抑制劑混合片，在4°C條件下浸提 12h。然后依次用4層紗布和濾紙過濾，得濾液。利用冷凍高速離心機使濾液在4°C，IOOOOr/ min條件下離心30min，收集上清液，此上清液為粗酶提取液。2)在步驟1)得到的粗酶提取液中加入4倍體積預(yù)冷的丙酮溶液I (其中含 20mmol/L的二硫蘇糖醇，0. lg/mL的三氯乙酸)，顛倒數(shù)次混勻后，_20°C放置Ih用以沉淀蛋 白；接著4°C，12000r/min離心30min，棄去上清，收集沉淀。在收集的沉淀中加入2mL預(yù)冷 的丙酮溶液II (其中含20mmol/L的二硫蘇糖醇)，輕輕搖晃，用以清洗沉淀，_20°C放置lh， 接著4°C，12000r/min離心15min。接著再利用預(yù)冷的丙酮溶液II，采用相同步驟重復(fù)清洗 沉淀一次，最后用保鮮膜封蓋裝有沉淀的離心管管口，置于-20°C環(huán)境48h，使沉淀中殘留 的丙酮完全揮發(fā)。3)將步驟2)中制得的蛋白質(zhì)沉淀加入300 μ L的樣品裂解液(其中含8mol/L尿 素，0. 02g/mL的CHAPS，體積百分含量為0. 5%的IPG緩沖液，0. 002g/mL的溴酚藍)，室溫下 充分溶解，然后12000r/min離心lOmin，取上清液，此上清液即為紹興黃酒成品麥曲微生物 胞外酶雙向電泳樣品。2、電泳檢測1)按照《雙向電泳操作手冊》進行水化上樣和等電聚焦。在Immobiline干膠條 再泡脹盤中加入含100 μ g蛋白的樣品液，將IPG干膠條(7cm，pH3-10)水平放入其中，加入 少量IPG覆蓋液，水化過夜。水化過夜后的膠條轉(zhuǎn)移到Ettan IPGphor膠條槽中，進行等電 聚焦。等電聚焦程序設(shè)置為①St印，300VX2h ；②Gradient，1000VX0. 5h ；③Gradient， 5000VX 1. 5h ；④ Step, 5000V, 2500vh。2)等電聚焦結(jié)束后，立即進行平衡。采用兩步平衡法，先將IPG膠條放入3mL平衡 液I中，在水平搖床上平衡15min ；再使用平衡液II進行第二步平衡，在搖床上平衡15min。平衡液I 配方尿素 72. 07g, SDS 4. 0g, 1. 5M Tris-HCl 6. 7mL(pH8. 8)，甘油 69mL，l%溴酚藍貯存液400yL，加入雙蒸水至200mL，使用前每IOmL加入DTT IOOmgo平衡液II 配方尿素 72. 07g，SDS 4. 0g, 1. 5M Tris-HCl 6. 7mL(pH8. 8)，甘油 69mL，l%溴酚藍貯存液400yL，加入雙蒸水至200mL，使用前每IOmL加入IAA 250mg。3)平衡后進行第二向SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為12. 5% (IOcmX7cmX Imm)。 將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移到已聚合的聚丙烯酰胺凝膠膠面頂端，排除膠條與膠面之間的氣 泡。以恒流方式進行電泳先IOmA電泳lOmin，然后電流調(diào)至20mA。當(dāng)溴酚藍指示劑遷移 到凝膠底部時，關(guān)閉電源，結(jié)束電泳。4)采用考馬斯亮藍染色法對凝膠進行染色。
5)利用捷達JD-801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)對脫色后的雙向電泳凝膠進行掃描、 拍照。雙向電泳結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明該紹興黃酒成品麥曲中微生物胞外酶樣品的 制備和分離效果較好，最終得到了分辨率較高，重復(fù)性較好的雙向電泳圖譜(圖1)。實施例21)稱取30g浙江紹興市某黃酒廠成品機制麥曲，加入50mL濃度為0. 15mol/L, pH5. 0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，同時加入1片蛋白酶抑制劑混合片，在4°C條件下浸提4h。 然后依次用4層紗布和濾紙過濾，得濾液。利用冷凍高速離心機使濾液在4°C，10000r/min 條件下離心30min，收集上清液，此上清液為粗酶提取液。2)在步驟1)得到的粗酶提取液中加入6倍體積預(yù)冷的丙酮溶液I (其中含 lOmmol/L的二硫蘇糖醇，0. 2g/mL的三氯乙酸)，顛倒數(shù)次混勻后，_20°C放置Ih用以沉淀蛋 白；接著4°C，12000r/min離心30min，棄去上清，收集沉淀。在收集的沉淀中加入2mL預(yù)冷 的丙酮溶液II (其中含30mmol/L的二硫蘇糖醇)，輕輕搖晃，用以清洗沉淀，_20°C放置lh， 接著4°C，12000r/min離心15min。接著再利用預(yù)冷的丙酮溶液II，采用相同步驟重復(fù)清洗 沉淀一次，最后用保鮮膜封蓋裝有沉淀的離心管管口，置于-20°C環(huán)境48h，使沉淀中殘留 的丙酮完全揮發(fā)。3)按100mg/400mL的比例向步驟2)中制得的蛋白質(zhì)沉淀加入裂解液(其中含 8mol/L尿素，0. 02g/mL的CHAPS，體積百分含量為0. 5%的IPG緩沖液，0. 002g/mL的溴酚 藍)，室溫下充分溶解，然后12000r/min離心lOmin，取上清液，此上清液即為紹興黃酒成品 麥曲微生物胞外酶雙向電泳樣品。2、電泳檢測1)按照《雙向電泳操作手冊》進行水化上樣和等電聚焦。在Immobiline干膠條 再泡脹盤中加入含100 μ g蛋白的樣品液，將IPG干膠條(7cm，pH3-10)水平放入其中，加入 少量IPG覆蓋液，水化過夜。水化過夜后的膠條轉(zhuǎn)移到Ettan IPGphor膠條槽中，進行等電 聚焦。等電聚焦程序設(shè)置為①St印，300VX2h;②Gradient，1000VX0.5h;③Gradient， 5000VX 1. 5h ；④ Step, 5000V, 2500vh。2)等電聚焦結(jié)束后，立即進行平衡。采用兩步平衡法，先將IPG膠條放入3mL平衡 液I中，在水平搖床上平衡15min ；再使用平衡液II進行第二步平衡，在搖床上平衡15min。平衡液I 配方尿素 72. 07g, SDS 4. Og, 1. 5M Tris-HCl 6. 7mL(pH8. 8)，甘油 69mL，l%溴酚藍貯存液400yL，加入雙蒸水至200mL，使用前每IOmL加入DTT IOOmgo平衡液II 配方尿素 72. 07g，SDS 4. Og, 1. 5M Tris-HCl 6. 7mL(pH8. 8)，甘油 69mL，l%溴酚藍貯存液400yL，加入雙蒸水至200mL，使用前每IOmL加入IAA 250mg。3)平衡后進行第二向SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為12. 5% (IOcmX7cmX Imm)。 將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移到已聚合的聚丙烯酰胺凝膠膠面頂端，排除膠條與膠面之間的氣 泡。以恒流方式進行電泳先IOmA電泳lOmin，然后電流調(diào)至20mA。當(dāng)溴酚藍指示劑遷移 到凝膠底部時，關(guān)閉電源，結(jié)束電泳。4)采用考馬斯亮藍染色法對凝膠進行染色。5)利用捷達JD-801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)對脫色后的雙向電泳凝膠進行掃描、 拍照。
結(jié)果表明該紹興黃酒成品麥曲中微生物胞外酶樣品的制備和分離效果較好，雙向 電泳結(jié)果與圖1高度相似。實施例31)稱取20g浙江紹興市某黃酒廠成品機制麥曲，加入50mL濃度為0. 10mol/L, PH5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，同時加入1片蛋白酶抑制劑混合片，在4°C條件下浸提 IOh0然后依次用4層紗布和濾紙過濾，得濾液。利用冷凍高速離心機使濾液在4°C，IOOOOr/ min條件下離心30min，收集上清液，此上清液為粗酶提取液。2)在步驟1)得到的粗酶提取液中加入4倍體積預(yù)冷的丙酮溶液I (其中含 30mmol/L的二硫蘇糖醇，0. 15g/mL的三氯乙酸)，顛倒數(shù)次混勻后，_20°C放置Ih用以沉淀 蛋白；接著4°C，12000r/min離心30min，棄去上清，收集沉淀。在收集的沉淀中加入2mL預(yù) 冷的丙酮溶液II (其中含30mmol/L的二硫蘇糖醇)，輕輕搖晃，用以清洗沉淀，-20°C放置 Ih,接著4°C，12000r/min離心15min。接著再利用預(yù)冷的丙酮溶液II，采用相同步驟重復(fù)清 洗沉淀一次，最后用保鮮膜封蓋裝有沉淀的離心管管口，置于-20°C環(huán)境48h，使沉淀中殘 留的丙酮完全揮發(fā)。3)按140mg/400mL的比例向步驟2)中制得的蛋白質(zhì)沉淀加入裂解液(其中含 8mol/L尿素，0. 02g/mL的CHAPS，體積百分含量為0. 5%的IPG緩沖液，0. 002g/mL的溴酚 藍)，室溫下充分溶解，然后12000r/min離心lOmin，取上清液，此上清液即為紹興黃酒成品 麥曲微生物胞外酶雙向電泳樣品。2、電泳檢測1)按照《雙向電泳操作手冊》進行水化上樣和等電聚焦。在Immobiline干膠條 再泡脹盤中加入含100 μ g蛋白的樣品液，將IPG干膠條(7cm，pH3-10)水平放入其中，加入 少量IPG覆蓋液，水化過夜。水化過夜后的膠條轉(zhuǎn)移到Ettan IPGphor膠條槽中，進行等電 聚焦。等電聚焦程序設(shè)置為①St印，300VX2h ；②Gradient，1000VX0. 5h ；③Gradient， 5000VX 1. 5h ；④ Step, 5000V, 2500vh。2)等電聚焦結(jié)束后，立即進行平衡。采用兩步平衡法，先將IPG膠條放入3mL平衡 液I中，在水平搖床上平衡15min ；再使用平衡液II進行第二步平衡，在搖床上平衡15min。平衡液I 配方尿素 72. 07g, SDS 4. 0g, 1. 5M Tris-HCl 6. 7mL(pH8. 8)，甘油 69mL，l%溴酚藍貯存液400yL，加入雙蒸水至200mL，使用前每IOmL加入DTT IOOmgo平衡液II 配方尿素 72. 07g，SDS 4. 0g, 1. 5M Tris-HCl 6. 7mL(pH8. 8)，甘油 69mL，l%溴酚藍貯存液400yL，加入雙蒸水至200mL，使用前每IOmL加入IAA 250mg。3)平衡后進行第二向SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為12. 5% (IOcmX7cmX Imm)。 將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移到已聚合的聚丙烯酰胺凝膠膠面頂端，排除膠條與膠面之間的氣 泡。以恒流方式進行電泳先IOmA電泳lOmin，然后電流調(diào)至20mA。當(dāng)溴酚藍指示劑遷移 到凝膠底部時，關(guān)閉電源，結(jié)束電泳。4)采用考馬斯亮藍染色法對凝膠進行染色。5)利用捷達JD-801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)對脫色后的雙向電泳凝膠進行掃描、 拍照。雙向電泳結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明該紹興黃酒成品麥曲中微生物胞外酶樣品的 制備和分離效果較好，最終得到了分辨率較高，重復(fù)性較好的雙向電泳圖譜。
結(jié)果表明該紹興黃酒成品麥曲中微生物胞外酶樣品的制備和分離效果較好，雙向 電泳結(jié)果與圖1高度相似。雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種制備紹興黃酒成品麥曲中微生物胞外酶雙向電泳樣品的方法，包括以下步驟1)稱取一定質(zhì)量的紹興黃酒成品麥曲，加入適當(dāng)體積濃度為0.09 0.15mol/L，pH3.8 5.5的乙酸 乙酸鈉緩沖溶液，同時加入1片蛋白酶抑制劑混合片，在4℃條件下浸提4 12h；然后依次用4層紗布和濾紙過濾，得濾液。利用冷凍高速離心機使濾液在4℃，10000r/min條件下離心30min，收集上清液；2)向步驟1)得到的粗酶提取液中加入4 6倍體積預(yù)冷的丙酮溶液Ⅰ(其中含0.01 0.03mol/L的二硫蘇糖醇，0.05 0.2g/mL的三氯乙酸)，混勻， 20℃放置1h；低溫高速離心收集沉淀，向沉淀中加入2mL預(yù)冷的丙酮溶液Ⅱ(其中含0.01 0.03mol/L的二硫蘇糖醇)，清洗沉淀， 20℃放置1h；低溫高速離心收集沉淀，采用預(yù)冷的丙酮溶液Ⅱ重復(fù)清洗沉淀一次；用保鮮膜封蓋裝有蛋白沉淀的離心管管口， 20℃揮發(fā)殘留丙酮；3)將步驟2)中制得的蛋白沉淀加入適量的樣品裂解液(其中含6 8mol/L尿素、0.02g/mL的CHAPS、體積百分含量為0.5 2％的IPG緩沖液、0.002g/mL的溴酚藍)，室溫下充分溶解，離心取上清液，此上清液即為紹興黃酒成品麥曲微生物胞外酶雙向電泳樣品；所述裂解液組成為樣品裂解液為8mol/L尿素、0.02g/mL的CHAPS、體積百分含量為0.5％的IPG緩沖液、0.002g/mL的溴酚藍。
2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中紹興黃酒成品麥曲用量為 25g/50mLo
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)乙酸-乙酸鈉緩沖溶液為 pH5. 0，濃度為 0. 09mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中在4°C條件下浸提麥曲12h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述丙酮溶液I為4倍 體積。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述丙酮溶液I中含0.02mol/L 的二硫蘇糖醇，0. lg/mL的三氯乙酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)丙酮溶液II中含 0. 02mol/L的二硫蘇糖醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，制得的蛋白沉淀與樣品 裂解液的質(zhì)量體積比為100mg/400 μ L-150mg/400 μ L，優(yōu)選為150mg/400 μ L。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述紹興黃酒成品麥曲為紹興黃酒成品 機制曲、腳踏曲或熟曲。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述紹興黃酒成品麥曲為成品機制曲。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備紹興黃酒成品麥曲中微生物胞外酶雙向電泳樣品的方法。該方法選取乙酸-乙酸鈉緩沖溶液低溫浸提麥曲中微生物胞外酶，通過使用含有二硫蘇糖醇和三氯乙酸的預(yù)冷丙酮溶液Ⅰ沉淀蛋白并用含有二硫蘇糖醇的預(yù)冷丙酮溶液漂洗沉淀，最后加入裂解液制備出適合雙向電泳的高質(zhì)量樣品。本發(fā)明制備紹興黃酒成品麥曲中微生物胞外酶雙向電泳樣品的方法快速可靠、簡單易行，可獲得較高質(zhì)量且重復(fù)性較好的雙向電泳圖譜，便于后續(xù)的生物質(zhì)譜分析鑒定蛋白，具有較大的實際應(yīng)用價值。
文檔編號G01N1/34GK101893528SQ20101024491
公開日2010年11月24日 申請日期2010年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月4日
發(fā)明者孔令瓊, 管政兵, 陸健 申請人:江南大學(xué)