專利名稱：檢測重金屬脅迫下核仁纖維蛋白定位的免疫熒光方法
技術領域：
本發(fā)明屬于細胞生物學技術領域，涉及一種快速檢測重金屬脅迫下核仁蛋白質變
化的定位方法。更具體的說是一種檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫熒 光方法。該方法為研究重金屬毒害植物細胞機理提供新的技術支持。
背景技術：
隨著礦產資源的大量開發(fā)，農藥、化肥的廣泛使用以及城市污泥、污水的農用，重 金屬對土壤、水體的污染越來越嚴重。過量重金屬(Cd、Cr、Hg、Pb、Cu、Zn、Ag、Sn等)進入 環(huán)境，參與水體_ 土壤_生物系統(tǒng)的循環(huán)，通過植物的吸收在植物體內大量積累，經食物鏈 危及動物和人類健康。目前，全球性的重金屬污染狀況日益嚴重，如何控制和減輕重金屬對 環(huán)境的污染和危害，已成為科學家們關注的熱點課題。大量研究表明了過量重金屬對植物 產生毒害作用，影響植物正常生長發(fā)育；引起植物生理、生化的變化；誘導染色體畸變；損 傷細胞結構。 核仁(皿cleolus)是細胞核中一種明顯的功能區(qū)域。核糖體形成的大多數步驟 發(fā)生在核仁中，包括核糖體基因的轉錄、核糖體RNA前體的加工和rRNA與核糖體蛋白及 5SrRNA的聯系等一系列復雜的過程。核仁的功能不僅限于核糖體合成，它還具有其它重要 功能，包括幾種小RNA的核苷酸的修飾、信號識別顆粒的生物合成，與基因沉默、衰老和細 胞分裂有關蛋白的時期性的封存和釋放等。因此，核仁結構的損傷勢必影響其功能的正常 發(fā)揮，從而造成細胞多種生命活動的嚴重障礙。核仁的化學成分主要由DNA、RNA、蛋白質和 酶類等組成，其中以蛋白質為主。利用蛋白質組學方法已鑒定了 350中核仁蛋白，這些蛋白 質與核仁的功能密切相關。 人們利用分子生物學和細胞生物學手段，從不同角度研究重金屬對核仁的結構以 及核仁蛋白質分布及功能的影響。硝酸銀染色就是用于研究重金屬對核仁結構損傷的一種 常用技術，其主要機制是硝酸銀能將核仁中酸性非組蛋白染色。發(fā)明人利用此技術研究了 不同重金屬(Cd、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、Pb、Zn、Al)脅迫對蠶豆、向日葵、洋蔥及玉米等植物幼 苗根尖細胞核仁的影響，這些研究結果表明重金屬脅迫能夠損傷核仁結構，導致核仁中銀 染蛋白物質外溢到細胞質中。因此，利用銀染技術研究重金屬對植物細胞核仁結構的影響， 具有一定的科學價值。但是，銀染技術只能鑒定重金屬脅迫后，從細胞核外溢到細胞質中的 銀染顆粒是核仁蛋白，至于究竟哪些核仁蛋白受到重金屬脅迫的影響不能具體鑒定，具有 一定的局限性。 近年來，免疫熒光技術得到了飛速發(fā)展，作為一種研究方法或實驗手段，已被廣泛 地應用于生命科學領域和醫(yī)學科學領域內，諸如測定生長因子、蛋白質定位、核酸分析、神 經遞質研究等。 核仁纖維蛋白是真核細胞內重要的核仁蛋白之一，在進化上具有高度保守性。在 間期細胞內，核仁纖維蛋白定位于核仁的纖維中心(FC)和致密纖維組分(DFC)區(qū)域。它主 要參與了核仁在細胞周期中的解體和重建過程，其中包括rRNA的合成加工修飾以及核糖體的組裝等。此外，核仁纖維蛋白還是構成核仁骨架的主要蛋白成分之一。但是，利用免疫 熒光技術研究重金屬脅迫對核仁纖維蛋白的功能和動態(tài)變化的影響尚未見文獻報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫 熒光方法，為研究逆境脅迫下細胞中蛋白質定位及變化特征提供了簡易、準確、快速的方 法。 本發(fā)明人結合實驗室前期工作，發(fā)明了一種檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維 蛋白定位的免疫熒光方法。該技術的主要原理是將免疫學方法(抗原抗體特異結合)與熒 光標記技術結合起來，研究特異蛋白抗原在細胞內分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可 在熒光顯微鏡下檢出，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。特 別是本發(fā)明涉及的壓片方法的改革，能夠提高觀察細胞數目，可適用于其它細胞生物學研 究。為達到上述目的，本發(fā)明提供如下的技術方案 —種快速檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫熒光方法，其特征 在于，按如下的步驟進行 (1)切取重金屬處理后的植物根尖分生組織細胞，于4%多聚甲醛中固定l-2h ;經 PBS緩沖液洗； (2)采用2. 5%纖維素酶+2. 5%果膠酶酶液于37t:溫箱酶解；經PBS緩沖液洗滌 后壓片； (3)將植物根尖轉至離心管中，滴加PBS緩沖液，手搖震蕩至多數細胞游離狀態(tài)， 用滴管吸取約0. 1-0. 2ml樣品液，均勻涂于載玻片上分散成單個細胞，標記后自然風干后 備用； (4)將(3)得到的載玻片放在1 % TritonX-100浸泡15-20分鐘；經PBS緩沖液洗 滌； (5)在(4)得到的載片上滴入15-20 iU配好的一抗，蓋上蓋玻片，37t:溫箱孵育 lh-l. 5h ;再經PBS緩沖液洗滌； (6)再將(5)得到的載片上滴入15-20 iU配好的二抗，蓋上蓋玻片，37t:溫箱孵育 45min-lh ;經PBS緩沖液洗滌； (7)再將(6)的載玻片上滴加15-20 ii 1 DAPI，蓋上蓋玻片；經PBS緩沖液洗滌；
(8)用濾紙吸干多余PBS，滴加5-10 ii 1防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用 指甲油將蓋玻片四周封好，l-2h后在熒光顯微鏡下觀察。 本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫熒光方法，其
中步驟(2)中酶解所用時間是指在鏡檢時如果觀察到大部分細胞均分散開，成一層球形
原生質體，其中少量細胞的細胞質已經解體，只剩下細胞核時，即結束酶解。 本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫熒光方法，其
中步驟(2)中所述的壓片是指酶解后直接將樣品制成懸浮液狀態(tài)，然后，均勻地滴在載玻
片上，不蓋載玻片，自然風干后備用。 本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫熒光方法，其 中的一抗為鼠抗核仁纖維蛋白單克隆抗體，其濃度為0. 5mg/ml。
本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫熒光方法，其 中的二抗為FITC-兔抗鼠IgG其濃度為0. 75mg/ml。 本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫熒光方法，其 中DAPI (4， 6- 二胺-2苯基吲哚-二鹽酸)的濃度為1 y g/ml 。 本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫熒光方法，其 中的1% Triton X-100為聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)。 本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫熒光方法，其 中的防淬滅劑為lOXlml。 本發(fā)明所述的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫熒光方法，其 中的重金屬為Cd、 Cr、 Cu、 Hg、 Mn、 Ni、 Al、 Pb或Zn。優(yōu)選Cd、 Pb、 Al、 Cr、 Cu、 Hg，特別優(yōu)選 Cd、Pb和Al。 本發(fā)明的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫熒光方法，其中所
述的植物細胞包括蠶豆、洋蔥、向日葵和小麥根尖細胞中核仁纖維蛋白的變化。 本發(fā)明的檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫熒光方法，能夠對
重金屬脅迫后，細胞內核仁纖維蛋白的變化進行精確定位。 本發(fā)明用到的用于固定樣品的多聚甲醛試劑屬危險化學品，請注意適當防護。多 聚甲醛在冷水中不易溶解，配制時要放置在通風櫥中，9(TC攪拌加熱至溶解(呈透明色)，
冷卻至室溫后，倒入棕色瓶中，4t:保存待用。 本發(fā)明酶解所需的時間，要根據樣品酶解的具體情況而定。根據本發(fā)明人的經驗， 在鏡檢時觀察到大部分細胞均分散開，成一層球形原生質體，其中少量細胞的細胞質已經 解體，只剩下細胞核時結束酶解，獲得的效果最佳。酶解后直接將樣品制成懸浮液狀態(tài)，然 后，均勻地滴在載玻片上，不用蓋蓋玻片，自然風干后備用。這種方法減去了常規(guī)壓片中蓋 片和揭片兩個步驟，避免了在這兩個步驟的操作中對細胞的損傷。
更加詳細的實驗步驟如下 以植物根尖為實驗材料，待根生長長度約1. 5cm左右時，進行不同重金屬脅迫實 驗。
(1)切取重金屬處理后的根尖分生組織細胞，于4%多聚甲醛中固定l-2h。
(2) PBS緩沖液(pH7. 0)中洗3次(每次10分鐘)。 (3)2. 5%纖維素酶+2. 5%果膠酶，37。C溫箱酶解，根據細胞酶解情況確定時間。
(4) PBS緩沖液洗3次(每次10分鐘)。 (5)將根尖轉至0.5ml的離心管中，滴加PBS緩沖液少量(適樣品多少而定)，蓋 離心管蓋，手搖震蕩至多數細胞游離狀態(tài)。用滴管吸取約O. l-0.2ml樣品液，均勻涂于載片 上分散成單個細胞，不蓋蓋玻片，用記號筆在載片的無樣品面標記，自然風干后備用。
(6)將要標記的切片放在1% TritonX-lOO聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)浸泡 20分鐘。 (7) PBS緩沖液洗3次(每次10分鐘)。 (8)用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20 y 1)配好的一抗(與核仁纖維蛋白 結合)至載玻片的樣品處，蓋上蓋玻片，37t:溫箱孵育lh-1.5h。需要強調的是購買的抗 體要盡快分裝，分裝可以最大程度地降低反復凍融對抗體活性的損害，同時也降低了由于多次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。
(9) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (10)用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20 1)配好的二抗(與一抗結構的 熒光素)至載玻片的樣品上，蓋上蓋玻片。37t:溫箱孵育45min-lh。
(11) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (12)DAPI(DNA染料)染色用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20iU)DAPI蓋 上載玻片。 (13) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (14)用濾紙吸干多余PBS，滴一滴(10 ii 1)防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻 片，用指甲油將蓋玻片四周封好，lh后可在熒光顯微鏡下觀察。 (15)熒光顯微鏡觀察核仁纖維蛋白用藍光450 490nm(FITC)激發(fā)呈綠色熒 光。DNA(細胞核和染色體)用紫外光355 425nm(DAPI)激發(fā)呈藍色熒光。
本發(fā)明所用到主要試劑的配置及保存 (1) —抗鼠抗核仁纖維蛋白單克隆抗體(mouse monoclonal
anti-Fibrillarinantibody)，購自Santa(美國)公司。 一抗?jié)舛葹?. lmg/ml，每個包裝為
0.2ml。購買后按每管10iiL分裝于1.5ml離心管中，-2(TC保存。待用時解凍。使用前用
PBS緩沖液(pH7. 4)稀釋至1.5ml即可(相當于稀釋了 150倍)，4"保存。 (2) 二抗FITC-兔抗鼠IgG (Fluorescein-conjugated rabbit anti-Mouse
IgG(H+L))，購自Sigma(美國)公司。原裝進口為凍干粉，2. Oml ;進口分裝為液體，
0. lml(另加O. lml甘油)。按每管10iiL分裝于0.5ml離心管中，-2(TC避光保存。待用時
解凍，用PBS buffer (pH7. 6)稀釋至0. 5ml即可(相當于稀釋了 50倍)，4。C避光保存待用 (3) DAPI (4， 6- 二胺_2苯基吲哚-二鹽酸)DAPI主要染核酸中DNA，儲存液用無離
子水配成lmg/ml濃度，4t:避光保存?zhèn)溆?，使用終濃度為1 y g/ml，4t:避光保存。紫外光激
發(fā)，細胞核和染色體呈藍色熒光。 (4)磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液) NaCl 0. 14mM 0. 0082g/L KC12. 7mM 0. 2013g/L Na2HP04 8. OmM 2. 8651g/L NaH2P04 1. 5mM 0. 2041g/L 加無離子水至1L，用0. lMNaH2P04調pH至7. 0 (5)固定劑4%多聚甲醛(paraformaldehyde in PBS buffer):購自Sigma(美 國)公司。稱多聚甲醛白色粉末lg，量取25ml PBS buffer于燒杯中，蓋蓋兒，放置在通風 櫥中，9(TC攪拌加熱至溶解(呈透明色)，冷卻至室溫后，倒入棕色瓶中，4t:保存待用。固定 劑4%多聚甲醛，主要是殺死細胞，維持細胞在活體時的結構狀態(tài)。 (6)酶液(2. 5% Cellulase纖維素酶+2. 5 % Pectolase果膠酶)購自Yakult Honsha(日本)公司。 一般配制5ml酶液，分別稱0. 125g Cellulase和O. 125g Pectolase， 于5ml無離子水中，充分溶解后，分裝于4支1. 5ml的離心管中，_24°0保存?zhèn)溆?。主要作?去除細胞壁(纖維素和果膠)。 (7)1% Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚(曲拉通)購自上?；瘜W試劑公司。一般配25ml，取O. 25ml Triton X-100加到25ml PBS buffer中，現用現配。這是一種優(yōu)異
的表面活性劑、潤濕及洗滌劑，破細胞膜，即在細胞膜上打孔，使抗體進入。 (8)抗熒光淬滅封片液(Antifade mounting medium):購自上海杰美基因公司。 (9)指甲油市場購置。 本發(fā)明的實驗中應注意的幾個問題 (1)抗體的活性決定了使用效果，如果抗體保存得當，大部分抗體活性都可以維持
數月甚至數年。因此，買來的抗體要盡快分裝，分裝可以最大程度的降低反復凍融對抗體活
性的損害，同時也降低了由于多次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。
(2)酶解是本實驗關鍵的步驟之一，酶解時間依細胞具體情況而定。根據我們的經
驗，在鏡檢時如果觀察到大部分細胞均分散開，成一層球形原生質體，其中少量細胞的細胞
質已經解體，只剩下核時結束酶解。 (3)壓片方法也是本實驗成功的關鍵步驟。本發(fā)明對傳統(tǒng)的制片方法進行了改革。 酶解后直接將樣品制成懸浮液狀態(tài)，然后，均勻地滴在載玻片上，不用蓋蓋玻片，自然風干 后備用。這種方法減去了常規(guī)壓片中蓋蓋片和揭片兩個步驟，避免了在這兩個步驟的操作 中對細胞的損傷。 本發(fā)明與現有技術相比所具有的積極效果在于 (1)本發(fā)明通過免疫熒光定位技術，對重金屬脅迫后的核仁纖維蛋白的變化進行 精確定位。利用上述方法已經觀察了在Cd、Pb和Al脅迫下，蠶豆和洋蔥根尖細胞中核仁纖 維蛋白的變化，取得了很好的結果。 (2)本發(fā)明的檢測技術具有特異性高、實驗結果準確等特點。本發(fā)明中對常規(guī)壓片 方法進行了改革，使操作步驟更加簡便易行、大大提高了觀察細胞數目等優(yōu)點。該方法為研 究重金屬等逆境脅迫下對細胞中蛋白質的影響提供科學依據。為探討重金屬毒害細胞機理 提供了精確的檢測方法，其方法具有廣闊的應用前景。


圖1包括 圖中A為未經重金屬脅迫的細胞中核仁纖維蛋白的分布。其中Al :綠色熒光顯示 核仁纖維蛋白；A2 :藍色熒光顯示細胞核(DNA) ;A3 :合成圖。 圖中B、 C為重金屬脅迫后細胞中核仁纖維蛋白在細胞中的定位，顯示細胞核中的 核仁纖維蛋白在重金屬的脅迫下外溢到細胞質中。
Bl :綠色熒光顯示核仁纖維蛋白；B2 :藍色熒光顯示細胞核(DNA) ;B3 :合成圖；
Cl :綠色熒光顯示核仁纖維蛋白；C2 :藍色熒光顯示細胞核(DNA) ;C3 :合成圖；
圖2為銀染實驗結果圖；其中未經重金屬脅迫的細胞核仁呈深棕色處于細胞核中 (圖2a) 。 CcT處理后，發(fā)現一些與核仁銀染反應相同的細小顆粒分布在細胞質內(圖2b)。 這些銀染顆粒的數量隨著Cd2+濃度升高和處理時間的延長而增多(圖2c)。
具體實施例方式
以下結合實施例用來幫助理解本發(fā)明，并且不用于也不應被解釋為以任何方式對 所列出的權利要求中發(fā)明的限制。本發(fā)明所用到的各種試劑均有市售。
實施例1 材料培養(yǎng)以蠶豆為例蠶豆主(側)根根長約1.5cm時，用10 ii M、50 ii M、 100 ii M 的CcT處理24h、48h、72h。 (1)切取重金屬處理后的蠶豆植物根尖分生組織細胞，于4%多聚甲醛中固定2h ; 經PBS緩沖液洗； (2)采用2. 5%纖維素酶+2. 5%果膠酶酶液于37。C溫箱酶解；經PBS緩沖液洗滌 后壓片； (3)將蠶豆植物根尖轉至離心管中，滴加PBS緩沖液，手搖震蕩至多數細胞游離狀 態(tài)，用滴管吸取約O. lml樣品液，均勻涂于載玻片上分散成單個細胞，標記后自然風干后備 用； (4)將(3)得到的載玻片放在1 % TritonX-100浸泡15分鐘；經PBS緩沖液洗滌；
(5)在(4)得到的載片上滴入15 配好的一抗，蓋上蓋玻片，37t:溫箱孵育lh ; 再經PBS緩沖液洗滌； (6)再將(5)得到的載片上滴入15iU配好的二抗，蓋上蓋玻片，37t:溫箱孵育 45min-lh ;經PBS緩沖液洗滌； (7)再將(6)的載玻片上滴加15 1 DAPI，蓋上蓋玻片；經PBS緩沖液洗滌；
(8)用濾紙吸干多余PBS，滴加5 1防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用指 甲油將蓋玻片四周封好，lh后在熒光顯微鏡下觀察。 (9)熒光顯微鏡觀察及圖像分析處理制片用NIKON公司(日本)HB-10101AF型 熒光顯微鏡觀察，Pixera Pro 600CL CCD數碼照相。圖像采集為1392X 1040象素，圖像的 后期處理利用Photoshop 7. 0軟件排版。核仁纖維蛋白由FITC標記，藍光450 490nm激 發(fā)，呈綠色熒光(見圖1中A1， Bl， C1)，細胞核由DAPI染色，紫外光355 425nm激發(fā)，呈 藍色熒光(見圖1中A2， B2， C2)。圖1中A3， B3， C3為合成圖。
實施例2 材料培養(yǎng)以向日葵為例，向日葵根根長約l. 5cm時，用10iiM、50iiM、100iiM的Pb"
處理24h、48h、72h。 實驗步驟 (1)切取重金屬處理后的根尖約2mm，于4%多聚甲醛中固定2h。
(2) PBS緩沖液(pH7. 0)中洗3次(每次10分鐘)。 (3)2. 5%纖維素酶+2. 5%果膠酶，37。C溫箱酶解，在酶解過程中隨時鏡檢，直到有
大量的球形原生質體產生結束酶解。 (4) PBS緩沖液洗3次(每次10分鐘)。 (5)將根尖轉至0.5ml的離心管中，滴加PBS緩沖液少量(適樣品多少而定)，蓋 離心管蓋，手搖震蕩至多數細胞游離狀態(tài)。用滴管吸取約O. 2ml樣品液，均勻涂于載片上分 散成單個細胞，不蓋蓋玻片，用記號筆在載片的無樣品面標記，自然風干后備用。
(6)將要標記的切片放在1% Triton X-100中抽提20min。
(7) PBS緩沖液洗3次(每次10分鐘)。 (8)用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，用經PBS稀釋的一抗(鼠抗核仁纖維蛋白單克
隆抗體，工作濃度i : 150)37t:孵育lh或4t:孵育過夜。
(9) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (10)用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20 ii 1)配好的二抗(兔抗鼠IgG，工 作濃度l : 50)至載玻片上的樣品處，蓋上蓋玻片，37t:溫箱孵育45min-lh。
(11) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (12)DAPI染色用濾紙吸干多余PBS緩沖液，滴一滴(20iU)DAPI，蓋上蓋玻片。
(13) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (14)用濾紙吸干多余PBS，滴一滴(10 ii 1)防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻 片，用指甲油將蓋玻片四周封好，lh后可在熒光顯微鏡下觀察。 (15)熒光顯微鏡觀察及圖像分析處理制片用NIKON公司(日本)HB-10101AF型 熒光顯微鏡觀察，Pixera Pro 600CL CCD數碼照相。圖像采集為1392X 1040象素，圖像的 后期處理利用Photoshop 7. 0軟件排版。核仁纖維蛋白由FITC標記，藍光450 490nm激 發(fā)，呈綠色熒光(見圖1中A1， Bl， C1)，細胞核由DAPI染色，紫外光355 425nm激發(fā)，呈 藍色熒光(見圖1中A2， B2， C2)。圖1中A3， B3， C3為合成圖。
實施例3 洋蔥根尖細胞中核仁Fibrillarin蛋白質的變化 材料培養(yǎng)以洋蔥為例洋蔥不定根根長約1.5cm時，用10iiM、50iiM、100iiM的 Al3+處理24h、48h、72h。
實驗步驟 (1)切取重金屬處理后的根尖約2mm，于4X多聚甲醛中固定2h。
(2) PBS緩沖液(pH7. 0)中洗3次(每次15分鐘)。 (3)2. 5%纖維素酶+2. 5%果膠酶，371:溫箱酶解，在酶解過程中隨時鏡檢，直到有
大量的球形原生質體產生結束酶解。 (4) PBS緩沖液洗3次(每次15分鐘)。 (5)將根尖轉至0.5ml的離心管中，滴加PBS緩沖液少量(適樣品多少而定)，蓋 離心管蓋，手搖震蕩至多數細胞游離狀態(tài)。用滴管吸取約O. lml樣品液，均勻涂于載片上分 散成單個細胞，不蓋蓋玻片，用記號筆在載片的無樣品面標記，自然風干后備用。
(6)將要標記的切片放在1% Triton X-100中抽提20min。 [cms] (7)PBS緩沖液洗3次(每次15分鐘)。 (8)用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，用經PBS稀釋的一抗(鼠抗核仁纖維蛋白單克
隆抗體，工作濃度i : 150)37t:孵育lh或4t:孵育過夜。 (9) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (10)用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20iU)配好的二抗(兔抗鼠IgG，工
作濃度l : 50)至載玻片上的樣品處，蓋上蓋玻片，37t:溫箱孵育45min。 (11) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (12)DAPI染色用濾紙吸干多余的PBS緩沖液，滴一滴(20iU)DAPI蓋上蓋玻片。 (13) PBS緩沖液中洗3次(每次10分鐘)。 (14)用濾紙吸干多余PBS，滴一滴(lOiU)防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻 片，用指甲油將蓋玻片四周封好，lh后可在熒光顯微鏡下觀察。 (15)熒光顯微鏡觀察及圖像分析處理制片用NIKON公司(日本)HB_10101AF型熒光顯微鏡觀察，Pixera Pro 600CL CCD數碼照相。圖像采集為1392X 1040象素，圖像的 后期處理利用Photoshop 7. 0軟件排版。核仁纖維蛋白由FITC標記，藍光450 490nm激 發(fā)，呈綠色熒光(見圖1中A1， Bl， C1)，細胞核由DAPI染色，紫外光355 425nm激發(fā)，呈 藍色熒光(見圖1中A2， B2， C2)。圖1中A3， B3， C3為合成圖。
實施例4
對比試驗 銀染技術(Ag-N0R染色技術)與本發(fā)明技術的比較試驗 銀染原理Ag-NOR染色技術能夠特異地與細胞中核仁形成區(qū)(NOR)染色。當位于 此處的18S、28S核糖體RNA的基因(rDNA)具有轉錄活性時，應用銀染技術可使NOR特異性 著色(棕黃色)?，F已進一步證明銀染物質不是rDNA，亦不是rRNA，可能是核仁形成區(qū)特異 的蛋白質，即和rRNA轉錄相聯系的酸性蛋白。 材料培養(yǎng)以蠶豆為例，蠶豆根長約1.5cm時，用10iiM、50iiM、100iiM的Ccf+處理
24h、48h、72h。 實驗步驟 (1)切取重金屬處理后的根尖約2mm，于固定液(酒精醋酸=3 : 2)中固定lh。
(2)無離子水中洗3次(每次IO分鐘)。 (3)置于6(TC恒溫水浴鍋中，用水解液(1NHC1 :酒精醋酸=5:3:2)水解 9min。 (4)無離子水中洗3次(每次10分鐘)。 (5)根尖用45%乙酸壓片，室溫下干燥過夜，揭片。 (6)在干燥切片上加入1滴2 %明膠溶液和2滴50 % AgN03水溶液，混勻，加蓋片，
室溫下浸染。 (7)待核仁呈棕黃色、細胞質呈淺黃色時，用蒸餾水將染色液淋洗干凈。
(8)在0.001%亞甲基蘭水溶液復染，至染色質呈綠色。
(9)用蒸餾水將染色液淋洗干凈，室溫下干燥。
(10)光學樹脂封片，顯微鏡下觀察。 (11)顯微鏡觀察及圖像分析處理制片用VAN0X-AHB型Olympus顯微鏡(日本) 觀察，Pixera Pro 600CL CCD數碼照相。圖像采集為1392X 1040象素，圖像的后期處理利 用Photoshop 7. 0軟件排版。經AgN03染色，核仁呈棕黃色、細胞質呈淺黃色，染色體由亞 甲基蘭染色，呈綠色(見圖2)。 銀染方法結果未經重金屬脅迫的細胞核仁呈深棕色處于細胞核中(圖2a) 。 Cd2+ 處理后，發(fā)現一些與核仁銀染反應相同的細小顆粒分布在細胞質內(圖2b)。這些銀染顆粒 的數量隨著Cd2+濃度升高和處理時間的延長而增多(圖2c)。 采用本發(fā)明的方法測定及結果圖1A顯示未經重金屬脅迫的細胞中核仁纖維蛋 白位于核仁內。重金屬脅迫后細胞中核仁纖維蛋白分布在核質(圖1B)，并進一步外溢到細 胞質中(圖1C)。
兩種實驗方法的比較 利用銀染技術研究對重金屬對植物細胞核仁結構的影B向，具有一定的科學價值。 但是，銀染技術只能鑒定重金屬脅迫后，從細胞核外溢到細胞質中的銀染顆粒是核仁中嗜銀的酸性蛋白，不能鑒定是哪些種核仁蛋白受到重金屬脅迫的影響，對深入研究重金屬毒 害機理有一定的局限性。 本發(fā)明通過免疫熒光定位技術，對重金屬脅迫后的核仁纖維蛋白的變化進行精確 定位，具有特異性高、實驗結果準確等特點。本發(fā)明的檢測技術可以進一步深入檢測重金屬 對具體的核仁結構成分造成的影響。該方法為研究重金屬等逆境脅迫下對細胞中蛋白質的 影響提供科學依據，為探討重金屬毒害細胞機理提供了精確的檢測方法，其方法具有廣闊 的應用前景。 在詳細說明的較佳實施例之后，熟悉該項技術人士可清楚地了解，在不脫離上述 申請專利范圍與精神下可進行各種變化與修改，凡依據本發(fā)明的技術實質對以上實施例所 作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術方案的范圍。且本發(fā)明亦不受說明 書中所舉實例實施方式的限制。
權利要求
一種快速檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫熒光方法，其特征在于，按如下的步驟進行(1)切取重金屬處理后的植物根尖分生組織細胞，于4％多聚甲醛中固定1-2h；經PBS緩沖液洗；(2)采用2.5％纖維素酶+2.5％果膠酶酶液于37℃溫箱酶解；經PBS緩沖液洗滌后壓片；(3)將植物根尖轉至離心管中，滴加PBS緩沖液，手搖震蕩至多數細胞游離狀態(tài)，用滴管吸取約0.1-0.2ml樣品液，均勻涂于載玻片上分散成單個細胞，標記后自然風干后備用；(4)將(3)得到的載玻片放在1％TritonX-100浸泡15-20分鐘；經PBS緩沖液洗滌；(5)在(4)得到的載片上滴入15-20μl配好的一抗，蓋上蓋玻片，37℃溫箱孵育1h-1.5h；再經PBS緩沖液洗滌；(6)再將(5)得到的載片上滴入15-20μl配好的二抗，蓋上蓋玻片，37℃溫箱孵育45min-1h；經PBS緩沖液洗滌；(7)再將(6)的載玻片上滴加15-20μl DAPI，蓋上蓋玻片；經PBS緩沖液洗滌；(8)用濾紙吸干多余PBS，滴加5-10μl防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用指甲油將蓋玻片四周封好，1-2h后在熒光顯微鏡下觀察。
2. 權利要求l所述的檢測方法，其中步驟(2)中酶解所用時間是指在鏡檢時如果觀察到大部分細胞均分散開，成一層球形原生質體，其中少量細胞的細胞質已經解體，只剩下細胞核時，即結束酶解。
3. 權利要求l所述的檢測方法，其中步驟(2)中所述的壓片是指酶解后直接將樣品制成懸浮液狀態(tài)，然后，均勻地滴在載玻片上，不蓋蓋玻片，自然風干后備用。
4. 權利要求1所述的檢測方法，其中所述的PBS緩沖液洗是指采用PBS緩沖液洗3次，每次10-15分鐘。
5. 權利要求1所述的檢測方法，其中的一抗為鼠抗核仁纖維單克隆抗體，其濃度為0. 5mg/ml 。
6. 權利要求l所述的檢測方法，其中的二抗為FITC-兔抗鼠IgG其濃度為O. 75mg/ml。
7. 權利要求1所述的檢測方法，其中DAPI的濃度為1 y g/ml。
8. 權利要求1所述的檢測方法，其中的防淬滅劑為10Xlml。
9. 權利要求1所述的檢測方法，其中的重金屬為Cd、Cr、Cu、Hg、Mn、Ni、As、Pb、Co、Ag或Zn。
10. 權利要求1所述的檢測方法，其中所述的植物細胞包括蠶豆、洋蔥、向日葵或玉米。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測重金屬脅迫下植物細胞核仁纖維蛋白定位的免疫熒光方法。它是切取重金屬處理后的植物根尖分生組織細胞，于4％多聚甲醛中固定1h；采用酶液酶解后；用滴管吸取約0.1ml樣品液，均勻涂于載玻片上分散成單個細胞，標記后自然風干，放在1％TritonX-100浸泡15分鐘；然后滴入15μl配好的一抗，蓋上蓋玻片，37℃溫箱孵育1h；再滴入15μl配好的二抗，處理后滴加15μl DAPI，最后滴加5μl防淬滅劑于載玻片材料上，蓋上蓋玻片，用指甲油將蓋玻片四周封好，1h后在熒光顯微鏡下觀察。本發(fā)明的檢測方法具有特異性高、實驗結果準確，大大提高了觀察細胞數目等特點。該方法為探討重金屬毒害細胞機理提供了精確的檢測方法，其檢測方法具有廣闊的應用前景。
文檔編號G01N33/68GK101782582SQ20101003132
公開日2010年7月21日 申請日期2010年1月11日 優(yōu)先權日2010年1月11日
發(fā)明者劉東華, 張慧敏, 張閃閃, 秦蓉 申請人:天津師范大學