專利名稱：分散和操作樣品體積的方法和設(shè)備的制作方法
分散和操作樣品體積的方法和設(shè)備相關(guān)申請的交叉引用本非臨時(shí)專利申請要求2008年8月15日提交的美國臨時(shí)專利申請第61/089，367 號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其全文通過弓I用納入本文用于所有目的。聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)下作出發(fā)明的權(quán)利聲明本發(fā)明借助美國政府的支持，在國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)授予的基金號(hào)ROl EB005197的資助下完成。美國政府享有本發(fā)明的一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
諸多化學(xué)和生物應(yīng)用的第一步均是將樣品體積分散為小的單獨(dú)體積，以便進(jìn)行隨后的鑒定和分析，其中所述鑒定和分析可以是相同類型或不同類型。這些應(yīng)用的多樣性突出了對具有不同優(yōu)點(diǎn)的不同樣品生成技術(shù)的需求。存在若干方法實(shí)現(xiàn)該目的。產(chǎn)生小體積樣品的傳統(tǒng)方法包括采用噴霧器形成氣溶膠，并將樣品與不混溶相混合以形成乳液。然而， 這些方法具有有限性。噴霧器形成的液滴顯示很寬范圍的大小。類似地，將兩個(gè)不混溶相混合以形成乳液不產(chǎn)生單分散液滴。而且，任一種方法形成的液滴一旦形成后均難以進(jìn)行單獨(dú)操作和分析。此外，這些方法均不適合進(jìn)行原位鑒定必需的持續(xù)監(jiān)測。形成分散樣品的常用方法是將小體積樣品分配到小孔或微孔中。盡管這是形成空間定位樣品陣列的一種成功方法，但分別填充單個(gè)孔是一種單調(diào)乏味的過程。此外，人為的誤差可妨礙均勻分散樣品。為避免該問題，研究者們開發(fā)了專門的分散儀器，如機(jī)器移液管。然而，對專用分散儀器的需求限制了這些微孔平臺(tái)的靈活性，并增加了成本。此外還難以對非常小體積(0. 5μ L以下)的樣品進(jìn)行操作，因?yàn)橐埔汗艿姆稚Ⅲw積較高且存在樣品蒸發(fā)的問題。(Jackman，R. J.，Duffy, D. C.，Ostuni, Ε.，ffillmore, N. D.和 Whitesides， G. Μ. Anal. Chem. 1998,70,11, 2280-2287, Morrison, Τ. ,Hurley, J. ,Garcia, J.，； Yoder,K.， Katz,A. ,Roberts,D.等，Nucleic Acids Research 2006 34，18，15)，其通過引用全文納入本文用于所有目的。不依賴于手工分散樣品的兩種樣品陣列產(chǎn)生方法是將液滴排列在模式化自裝配單層(SAM)上(Biebuyk, H. A. , ffhitesides, G. M. Langmuir 1994，10，2790.)和采用電潤濕法進(jìn)行液滴操作(Pollack, Μ. G.，F(xiàn)air, R. B.，Shenderov, R. B. App 1. Phys. Lett. 2000，77， 1725)，其通過引用全文納入本文用于所有目的。在這兩種情況中，通過基材的表面性質(zhì)分散樣品，產(chǎn)生更為均勻的液滴體積。然而，電潤濕法大多用于納升級以上的樣品，并需要復(fù)雜的電極圖形，大大限制了其實(shí)用性。模式化SAM可用來產(chǎn)生較小體積樣品，然而，制備這些表面可能非常費(fèi)力。此外，必須用一層金涂覆表面，然后進(jìn)行修飾以達(dá)到所述模式化表面。這可能會(huì)限制分析的可能，因?yàn)榛某３２煌该鳌＝诔霈F(xiàn)了樣品體積分散的新方法。這些方法包括采用微流體閥使樣品體積彼此分離(Unger, Μ. A.，Chou, H. P.，Thorsen, T.，Scherer, A.禾口 Quake，S. R. Science 2000 288(5463) :113-116)或產(chǎn)生液滴流(Sgro, A.，Allen, P. B.，Chiu, D. T. Anal. Chem. 2007, 79,4845-4851.)或單獨(dú)液滴(Lorenz, R. M.，Edgar, J. S.，Jeffries, G. D. Μ.，Chiu, D. Τ. Anal. Chem. 2006，78，6433-6439.)，其通過引用全文納入本文用于所有目的。然而，這些方法可能具有某些缺陷。例如，采用閥和泵需要復(fù)雜的流體控制和造價(jià)傾向于昂貴的裝置，特別在涉及很多分散樣品體積(幾百到幾千)時(shí)。采用穩(wěn)態(tài)方法產(chǎn)生液滴流使隨后對液滴的操作和固定化難以進(jìn)行，但更重要的是，因?yàn)槠錇榉€(wěn)態(tài)方法，其常包含樣品體積的損失，即存在一些樣品的初始損失，因?yàn)楸仨氃诔Ｒ?guī)形成液滴之前建立穩(wěn)態(tài)流。 此外，這樣的流動(dòng)法需要對流速的精確控制，也會(huì)增加最終裝置或設(shè)備的復(fù)雜度和費(fèi)用。因此，本領(lǐng)域需要操作樣品體積的新的方法。發(fā)明概述本發(fā)明的實(shí)施方式涉及簡單、穩(wěn)固和多用途的分散樣品體積的新方法。在具體實(shí)施方式
中，流體裝置不是基于穩(wěn)態(tài)方法如形成液滴流而是基于流體力之間的相互作用、界面張力、螺槽(channel)幾何形狀和形成的液滴和/或分散化體積的最終穩(wěn)定性之間的相互作用來分隔樣品。這些分隔的體積能使樣品分離并分隔為隨后可操作和分析的局部化陣列。最小流體互相連接和簡單的流動(dòng)幾何結(jié)構(gòu)使所述裝置易于使用和實(shí)施，具有制造和操作的經(jīng)濟(jì)性，并在其運(yùn)轉(zhuǎn)中具有穩(wěn)固性。所述裝置的多用途的基礎(chǔ)在于但不限于其易于產(chǎn)生和具有可調(diào)整性，其由裝置內(nèi)螺槽的表面性質(zhì)、螺槽的幾何形狀、界面的性質(zhì)和連續(xù)和不連續(xù)相的性質(zhì)控制。分散化體積的分離連同其固有便攜性進(jìn)一步擴(kuò)展了用于多個(gè)領(lǐng)域的多種用途，包括但不限于PCR、 數(shù)字PCR、基因分型、單細(xì)胞基因表達(dá)分析、確定拷貝數(shù)量變化、診斷學(xué)和預(yù)后學(xué)的生物鑒定、癌癥診斷和預(yù)后、DNA甲基化鑒定、高流體積篩選、單分子和單細(xì)胞反應(yīng)或鑒定、結(jié)晶研究和統(tǒng)計(jì)學(xué)過程、蛋白質(zhì)結(jié)晶、藥物篩選、環(huán)境測試和與生物醫(yī)學(xué)鑒定和測量的多種分析檢測技術(shù)進(jìn)行結(jié)合。所述裝置的獨(dú)特穩(wěn)定性使操作和檢測方法可平行進(jìn)行或串聯(lián)使用，形成引入補(bǔ)充檢測技術(shù)的手段。為說明該裝置，我們對液滴填充方案、樣品體積研究、樣品和不混溶相性質(zhì)、界面性質(zhì)、裝置幾何形狀、流速、基材性質(zhì)影響和分散后操作和檢測進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。


圖1中的a和b)為分散裝置的示意圖和某些特征的圖示定義。b)顯示樣品隔室和主螺槽的放大的分散區(qū)部分。這些特征可能具有或可能不具有相同高度。c)采用所述裝置分散的樣品體積陣列的熒光發(fā)射圖像。將100 μ M羧基熒光素溶液用作樣品相。不混溶相為含0. 01%司盤(Span)80的輕質(zhì)礦物油。比例尺對應(yīng)于200 μ m。
圖IA中的a和b)流體格的示意圖和c)在流體容納室(fluidic harbor)中形成的流體包的熒光圖像。
圖2為顯示采用填充方法1分散樣品的圖像的示意圖和順序。a)首先用不與樣品相(例如水性溶液)混溶的流體(例如油)填充芯片。b)然后將所述樣品相緩慢引入到螺槽中。c)之后再次使不混溶相流過所述螺槽。在該步驟中，所述樣品相被移出主螺槽但仍保留在隔室內(nèi)，使所述樣品相被分散為主要由隔室?guī)缀纬叽缦薅ǖ捏w積。采用ΙΟΟμΜ Alexa488作為樣品相、含0. 01%司盤80的輕質(zhì)礦物油作為不混溶相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)間順序(b 和c)。比例尺對應(yīng)于200 μ m。
圖2A為顯示實(shí)施例1中流體容納室的流體行為的圖像的示意圖和順序。
圖3顯示可將小體積樣品引入螺槽中進(jìn)行完全分散而不造成任何死體積或樣品體積損失。a_c) 100%樣品體積分散和保留的示意圖。d)顯示該現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)時(shí)間順序。穿過螺槽的小樣品堵塞物持續(xù)填充各隨后的隔室，直至所述堵塞物消失后形成液滴。所述圖像顯示樣品相(ΙΟΟμΜ Alexa 488)的熒光。所述不混溶相是含0. 01 %司盤80的輕質(zhì)礦物油，比例尺對應(yīng)于200 μ m。
圖3A中的a-c)為流體包形成和連續(xù)流體體積100%保留的示意圖。d)顯示該現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)時(shí)間順序。
圖4為顯示采用填充方法2分散樣品的圖像的示意圖和順序。a)首先用樣品相填充芯片。b)然后使不混溶相流過螺槽。在該步驟中，所述樣品相被移出主螺槽但仍保留在隔室內(nèi)，使所述樣品相被分散為主要由隔室?guī)缀纬叽缦薅ǖ捏w積。采用IOOnM磷酸鹽緩沖液作為樣品相、含0.01%司盤80的輕質(zhì)礦物油作為不混溶相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)間順序(C)。比例尺對應(yīng)于200 μ m。
圖4A為顯示實(shí)施例2中流體容納室的流體行為的圖像的示意圖和順序。
圖5顯示可將分散裝置設(shè)定為保留不同浮力的物質(zhì)。為采用該方法分散樣品，所述樣品相必須與所述不混溶相具有不同浮力。a和b)用來保留有浮力物質(zhì)的設(shè)計(jì)的一些例子。c)設(shè)計(jì)為保留有浮力物質(zhì)的樣品隔室的三維示意圖。所述樣品隔室的高度大于主螺槽的高度。如果所述樣品相比所述不混溶相更為稠密(即更重)，則可采用轉(zhuǎn)換為描述為可采用的即低于底板的隔室(而非隔室高于頂板)的螺槽幾何形狀。
圖5A為從不同密度或浮力的流體產(chǎn)生流體包的流體格。
圖6為顯示水相流速對分散體積的影響的圖像。在圖a)、b)、c)和d)中，水相流速分別為0.2、1. 1、6.9和8. 3mm/秒。對應(yīng)于這些流速的所得液滴圖像顯示，分散樣品的體積與水相流速成反比。這些圖像中的水相為ΙΟΟμΜ 5，6_羧基熒光素，油相為含0.01%司盤80的輕質(zhì)礦物油。比例尺對應(yīng)于200 μ m。
圖6A為顯示第二連續(xù)流體的流速對包體積的影響的圖像。
圖7為顯示采用填充方法2的不混溶相流速對分散體積的影響的圖像。a)以快速不混溶相流速形成的分散樣品。b)以較慢不混溶相流速形成的分散樣品。這些圖像中的水相為IOOnM磷酸鹽緩沖液，油相為電子氟化液(Fluorinert)。比例尺對應(yīng)于200 μ m。
圖7A為顯示其它連續(xù)流體的流速對包體積的影響的圖像。
圖8為采用不同不混溶相通過填充方法1 (a、b、c、d)和填充方法2 (e、f)分散的小體積的例子。用來形成所示樣品的不混溶相為a)含0.01%司盤80的輕質(zhì)礦物油，b) 電子氟化液，c)AS-4，d)AR-20, e)輕質(zhì)礦物油和f)電子氟化液。
圖8A為采用不同連續(xù)流體形成的流體包的圖像。
圖9顯示可加入表面活性劑以促進(jìn)分散。a)采用純輕質(zhì)礦物油嘗試的分散。b) 采用含0.01%司盤80的輕質(zhì)礦物油分散的樣品。C)采用含0.01%八甘醇單癸醚的輕質(zhì)礦物油分散的樣品。d)采用含0.01%四甘醇單癸醚的輕質(zhì)礦物油分散的樣品。
圖9A為可用于在流體容納室中產(chǎn)生流體包的表面活性劑的例子。
圖10顯示可通過改變裝置基材的表面性質(zhì)來調(diào)整所述裝置的分散能力。a、b和 c)為在表面性質(zhì)不合適的裝置中采用填充方法1引入所述裝置的樣品相缺乏分散的示意圖。b和c)顯示該現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)時(shí)間順序。圖b)中引入所述裝置的樣品相在如圖c)所示的隨后不混溶相流動(dòng)期間未得到保留。b和c)中的實(shí)驗(yàn)圖像顯示由ΙΟΟμΜ羧基熒光素組成的樣品相的熒光。所述不混溶相是含0. 01%司盤80的輕質(zhì)礦物油，比例尺對應(yīng)于200 μ m。
圖IOA顯示改變流體格的表面性質(zhì)時(shí)缺乏流體包形成。
圖11為樣品和不混溶相入口幾何形狀的一些例子。在a)中直接將兩相引入所述裝置。各相具有與主螺槽連接的入口螺槽。b)所述裝置具有一個(gè)可與閥連接的入口?？烧{(diào)整所述閥以選擇引入芯片的相。可依次將不同的相引入所述裝置。
圖IlA為流體入口構(gòu)造的例子。
圖12顯示可優(yōu)化所述裝置的分散區(qū)以使其達(dá)到最適合于應(yīng)用。a和b)分散區(qū)的尺寸?？筛淖?nèi)魏位蛩羞@些尺寸。還可改變樣品隔室的形狀。c)不同樣品隔室變化的一些例子。這些樣品隔室可與主螺槽具有相同高度或可具有不同高度。d)樣品隔室相對主螺槽的不同位置的一些例子?？蓛?yōu)化這些隔室的取向以適合于不同應(yīng)用。
圖12A顯示流體容納室的各種幾何形狀。
圖13顯示采用不同形狀樣品隔室的一些例子分散的水性樣品。a)將含0. 01%司盤80的輕質(zhì)礦物油用作不混溶相。b)將電子氟化液用作不混溶相。
圖13A為在各種形狀的流體容納室中產(chǎn)生的流體包的圖像。
圖14顯示還可制造具有引導(dǎo)返回主螺槽的排出螺槽的分散隔室。這些排出螺槽可用來促進(jìn)樣品填充。a和b)具有排出螺槽的樣品隔室的一些例子。所述排出螺槽可與主螺槽具有相同的高度或不同高度。c和d)在包括排出螺槽的裝置中形成的分散樣品。
圖14A為在多于一個(gè)位置處與主流動(dòng)螺槽連接的流體容納室的例子。
圖15為可用來達(dá)到大陣列分散樣品的裝置幾何形狀的例子。a)可依次或平行填充的5個(gè)平行主螺槽。b)具有交替樣品隔室的以蜿蜒形式折疊的單個(gè)主螺槽。c)具有緊密間隔相鄰樣品隔室的蜿蜒主螺槽的另一個(gè)例子。可預(yù)定分散樣品的數(shù)量和間隔以適合于特定應(yīng)用。
圖15A為流體格構(gòu)造的例子。
圖16顯示采用兩隔室系統(tǒng)用于鑒定的多層結(jié)構(gòu)。a_b)顯示兩種不同樣品的填充隔室矩陣。c)顯示(a)和(b)的分層結(jié)合，其中兩組隔室或樣品體積之間存在垂直連接以使頂部和底部樣品體積可混合。d-f)分別為(a-c)的圖示。為清楚起見，移去在(f)中分隔兩個(gè)層的膜。該薄膜可形成所述隔室的頂板和底板，可采用多種不同方法將其去除以引入兩組頂部和底部隔室之間的連接，由此形成兩個(gè)不同樣品體積以進(jìn)行混合。
圖16A為由可去除的膜分隔相鄰流體容納室的流體格的多層設(shè)計(jì)。
圖17顯示采用兩隔室系統(tǒng)用于可處理鑒定的平面結(jié)構(gòu)。a)填充樣品隔室的3D圖像，其中不同樣品由薄膜(為清楚起見省略膜)分隔，所述薄膜可形成所述隔室的其中一個(gè)壁或可為形成分隔兩個(gè)隔室的壁的唯一材料。b)由薄膜分隔隔室的填充隔室的2D圖像。 c)隔室之間的光學(xué)膜破壞。d)通過外部或模式加熱器進(jìn)行隔室之間的熱學(xué)膜破壞。e)膜破裂，兩隔室混合融合液滴或分散樣品體積。f)所得融合或混合樣品。
圖17A顯示由可單獨(dú)去除的膜分隔相鄰流體容納室的流體格的平面設(shè)計(jì)。
圖18顯示采用兩隔室系統(tǒng)用于大面積鑒定的平面結(jié)構(gòu)。a)填充隔室的3D圖像， 其中不同樣品由薄膜(為清楚起見省略膜)分隔，所述薄膜可形成所述隔室的其中一個(gè)壁或可為形成分隔兩個(gè)隔室的唯一材料。b)由薄膜分隔隔室的填充隔室的2D圖像。c)通過外部或模式加熱器進(jìn)行隔室之間的熱學(xué)膜破壞。d)膜破裂，相對隔室混合融合或混合樣品。e)所得融合或混合樣品陣列。
圖18A為由可去除的膜分隔相鄰流體容納室的流體格的平面設(shè)計(jì)。
圖19為輔助螺槽示意圖的例子。在諸如PCR過程中加熱水性分散樣品時(shí)，輔助螺槽可用來用水使空氣可滲透的聚合芯片和/或不混溶相飽和，以抑制體積損失。a)在分散區(qū)任一側(cè)具有整合的輔助螺槽的分散裝置的例子。在該例子中，主螺槽任一側(cè)各具有兩個(gè)輔助螺槽。b)a)中所示裝置的輔助螺槽和分散區(qū)的放大視圖。c)主螺槽任一側(cè)各具有單個(gè)輔助螺槽的分散裝置的例子。d)c)中所示裝置的輔助螺槽和分散區(qū)的放大視圖。
圖19A為輔助螺槽示意圖的例子。圖19 (b)和(d)分別為1905和1925區(qū)的放大視圖。
圖20為不具有水填充輔助螺槽(a-e)和具有水填充輔助螺槽(f_j)的裝置中加熱的水性分散樣品的圖像。圖像中的樣品相為IOmM Tris HCl、50mM KCl和1. 5mM MgCl20 不混溶相為含0. 01%司盤(Span)SO的輕質(zhì)礦物油。
圖20A為不具有水填充輔助螺槽(a-e)和具有水填充輔助螺槽(f_j)的加熱的流體包的圖像。
圖21顯示可通過使不混溶相以增大的流速流過所述裝置來從樣品隔室中釋放分散的樣品。在這些圖像中，所述樣品相為InM磷酸鹽緩沖液，所述不混溶相為含0.01%司盤 80的輕質(zhì)礦物油。所述不混溶相的流速為每分鐘3 μ L0比例尺對應(yīng)于200 μ m。
圖21A為通過改變流速從流體容納室部分釋放的流體包的例子。
圖22為通過使粘度更大的不混溶相流過所述裝置來從所述樣品移出分散樣品的示意圖。粘度較高的不混溶相的流動(dòng)引起分散體積逃出所述隔室。
圖22A為通過使另一連續(xù)流體流入流體格而從流體容納室完全釋放的流體包的例子。
圖23顯示可將外部通道螺槽結(jié)合到分散裝置中以解決和促進(jìn)將所選分散樣品移出。通過樣品隔室螺槽將外部通道螺槽與樣品隔室連接。可優(yōu)化外部通道螺槽和樣品隔室螺槽的尺寸以適合于具體應(yīng)用。a)具有與主螺槽平行延伸的外部通道螺槽的分散裝置的例子。該外部通道螺槽與提供各樣品隔室通道的樣品隔室螺槽連接。b)具有用來單獨(dú)通向不同樣品隔室的三個(gè)外部通道螺槽的分散裝置的例子。采用的這些輔助樣品通道螺槽可具有之前詳述的分散幾何形狀中的任何一種。
圖23A為通道螺槽釋放特定流體包的例子。
圖2 顯示通過對與各流體容納室連接的外部通道螺槽施加正壓力選擇性釋放的流體包的順序圖像。
圖23C顯示在向通道螺槽施加正壓力引起流體流入通道螺槽時(shí)釋放一部分的流體包的順序圖像。
圖M為通過界面加熱移出樣品的方案。a)沿主螺槽長度具有模式或插入加熱器的填充樣品隔室的示意圖。b)隨張力減小變形自由度更大的界面示意圖。c)應(yīng)用連續(xù)相流(方向如箭頭所示)協(xié)助從隔室中移出樣品。d)從隔室釋放后，所述樣品形成堵塞物或液滴，在連續(xù)相流的驅(qū)動(dòng)下沿螺槽向下流動(dòng)?？刹徊捎昧黧w流而使用向樣品體積施加力來協(xié)助移出的其它方法，所述力如輻射壓力、電場衍生力、表面張力衍生力、熱梯度衍生力或磁力。
圖24A為通過加熱從流體容納室釋放流體包的示意圖。
圖25顯示采用直接或間接光學(xué)加熱從隔室中移出樣品。通過用激光直接加熱分散樣品界面或通過采用在表面上成層的吸收材料。a)填充隔室，星爆標(biāo)志指示隔室中樣品上的多種可能的激光位置。b)定位加熱造成的界面變形。c)界面持續(xù)變形，與引導(dǎo)樣品流出隔室的連續(xù)相流結(jié)合。d)隔室完全空置，樣品可作為堵塞物流而流動(dòng)?？刹徊捎昧黧w流而使用向樣品體積施加力來協(xié)助移出的其它方法，所述力如輻射壓力、電場衍生力、表面張力衍生力、熱梯度衍生力或磁力。
圖25A為通過界面光學(xué)加熱從流體容納室釋放流體包的示意圖。
圖沈顯示采用電潤濕法使樣品體積移動(dòng)并將其從隔室中移出。(a)中隔室中的樣品已經(jīng)過褪色處理以顯示電極。為清楚起見，(b-d)中省略了電極?？刹捎锚?dú)立而非串聯(lián)導(dǎo)線連接電極來單獨(dú)處理樣品體積。a)顯示一種可能的電極排列的樣品陣列。b-c)隨電極1 和2之間的電壓變化，所述樣品開始移動(dòng)并潤濕越過到電極2上。d) —旦所述樣品基本上占據(jù)電極2，連續(xù)相可用來將堵塞物向下游移動(dòng)?？刹徊捎昧黧w流而使用施加力以移動(dòng)樣品體積的其它方法，所述力如輻射壓力、電場衍生力、表面張力衍生力、熱梯度衍生力或磁力。 也可將電極設(shè)置在主螺槽內(nèi)以采用電潤濕法將樣品向下游移動(dòng)。改變表面張力以促進(jìn)從隔室中移出液滴的描述的其它方法可與該電潤濕法結(jié)合，以便使從單獨(dú)隔室移出和操作液滴的性能增強(qiáng)。
圖為通過電潤濕法從流體容納室釋放流體包的示意圖。
圖27顯示用于閥控制包封樣品陣列移出的溫度和/或溶劑可降解膜。a)溫度和 /或溶劑反應(yīng)性材料呈螺槽之間的三明治形式或被填充入狹窄出口進(jìn)料螺槽。b)單獨(dú)加熱所述膜后或通過溶劑的其它溶解作用，所述閥溶解，開放出口螺槽。c)使連續(xù)相流動(dòng)，由于 &與R1相比是阻力更低的途徑，所述樣品體積移動(dòng)到出口螺槽中。d)樣品體積完全占據(jù)所述出口螺槽，其它連續(xù)相注入使其向出口移動(dòng)?？刹徊捎昧黧w流而使用施加力以移動(dòng)樣品體積的其它方法，所述力如輻射壓力、電場衍生力、表面張力衍生力、熱梯度衍生力或磁力。
圖27A為通過破壞臨時(shí)壁從流體容納室釋放流體包使其進(jìn)入通道螺槽的示意圖。
圖28顯示移出包封樣品陣列的磁臨時(shí)閥。a)將磁珠排列到出口螺槽之上的區(qū)域中，將磁鐵置于芯片之下，形成對磁珠的向下吸引，完全或部分密封所述出口螺槽。b)去除所述磁鐵后，磁珠在芯片下釋放，開放所述出口螺槽。c)使連續(xù)相流動(dòng)，由于&與R1相比是阻力更低的途徑，所述樣品體積移動(dòng)到出口螺槽中。d)樣品體積完全占據(jù)所述出口螺槽， 其它連續(xù)相注入使其向出口移動(dòng)。可不采用流體流而使用施加力以移動(dòng)樣品體積的其它方法，所述力如輻射壓力、電場衍生力、表面張力衍生力、熱梯度衍生力或磁力。除磁珠以外， 可采用具有合適磁性的其它材料，如永久磁鐵和鐵流體。
圖28A為通過開放臨時(shí)閥從流體容納室釋放流體包使其進(jìn)入通道螺槽的示意圖。
圖四顯示采用直接或間接光學(xué)加熱從隔室中對樣品進(jìn)行單獨(dú)處理和移出樣品。 通過用激光直接加熱分散樣品界面或通過采用在表面上、樣品體積中或不混溶相流體中成層的吸收材料。a)填充隔室陣列(星爆標(biāo)志指示激光照明)。b)定位加熱造成的界面變形。c)界面持續(xù)變形，與引導(dǎo)樣品流出隔室的連續(xù)相流結(jié)合。d)所選樣品完全從隔室中釋放，可沿主螺槽向下自由流動(dòng)。可不采用流體流而使用施加力以移動(dòng)樣品體積的其它方法， 所述力如輻射壓力、電場衍生力、表面張力衍生力、熱梯度衍生力或磁力。
圖29A顯示通過直接或間接光學(xué)加熱從流體容納室單獨(dú)釋放流體包。
圖30顯示采用直接或間接光學(xué)力和/或輻射壓力從隔室中移出單獨(dú)處理樣品。通過光束與樣品之間的相互作用產(chǎn)生的吸引力或排斥力。a)填充隔室陣列(紅圈指示激光照明)。b)光學(xué)力造成的界面變形。c)界面持續(xù)變形，與引導(dǎo)樣品流出隔室的連續(xù)相流結(jié)合。d)所選樣品完全從隔室中釋放，可沿主螺槽向下自由流動(dòng)?？刹徊捎昧黧w流而使用施加力以移動(dòng)樣品體積的其它方法，所述力如輻射壓力、電場衍生力、表面張力衍生力、熱梯度衍生力或磁力。
圖30A顯示通過光學(xué)力從流體容納室單獨(dú)釋放流體包。
圖31顯示通過直接壓力刺激的單獨(dú)樣品逐出(如果致動(dòng)器陣列可與隔室對齊，則該過程還可實(shí)現(xiàn)大量釋放)。a)用樣品填充隔室。b)在隔室上施加直接壓力，使樣品堵塞物變形，引導(dǎo)其返回到主螺槽中。c)連續(xù)相流的應(yīng)用能實(shí)現(xiàn)將樣品體積離開樣品隔室陣列被傳輸?shù)较掠?。可不采用流體流而使用施加力以移動(dòng)樣品體積的其它方法，所述力如輻射壓力、電場衍生力、表面張力衍生力、熱梯度衍生力或磁力。
圖31A顯示通過壓縮從流體容納室單獨(dú)釋放流體包。
圖32顯示分散后的鑒定分析和提取。a)將樣品分散到隔室陣列中。b)將與注射器連接的小針穿過基材插入到樣品隔室中(具有機(jī)器視野ID標(biāo)記，可采用自動(dòng)致動(dòng)器進(jìn)行定位)。c)將所述樣品提取到注射器中，然后進(jìn)行傳輸以供進(jìn)一步分析(d)。
圖32A顯示通過破壞壁從流體容納室單獨(dú)釋放流體包。
圖33為下游樣品傳輸方案。a)分散樣品圖像。b)從隔室移出的流體流中樣品堵塞物的示意圖。c)與液滴流區(qū)連接的分散區(qū)末端，其中加入任選加速鞘流(指示為在主螺槽之上和之下流動(dòng))。d)顯示兩種可能的加工為液滴的技術(shù)。左邊顯示來自單個(gè)隔室的一個(gè)堵塞物形成一個(gè)液滴。右邊顯示采用鞘流將隔室體積進(jìn)一步分隔以使所述堵塞物破裂為多個(gè)液滴。
圖33A為釋放流體包之后的隨后操作的示意圖。
圖34從陣列內(nèi)電生液滴。a)將樣品分散到陣列中。b)對接觸樣品的電極采用高壓導(dǎo)致泰勒錐形成。c)高壓供給的脈沖能使樣品隔室受控產(chǎn)生液滴。
圖34A為通過電生液滴釋放流體包的示意圖。
圖35中a)分散裝置熱循環(huán)的示意圖。將裝置置于熱循環(huán)儀之上或之中以在分散樣品上進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。也可在熱循環(huán)中對分散樣品進(jìn)行成像，以進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR或監(jiān)測信號(hào)增大。如果樣品中的模板量經(jīng)稀釋使無樣品隔室包含多于一個(gè)模板，則所述分散裝置可用來進(jìn)行數(shù)字PCR。b)來自經(jīng)過40個(gè)熱循環(huán)周期的分散實(shí)時(shí)PCR樣品的熒光。除顯示的方案以外，可采用用于PCR的使分散裝置進(jìn)行熱循環(huán)的多種其它方法，如采用外置燈或芯片上整合的電阻加熱器，或簡單地采用等溫PCR方案。
圖35A為采用本發(fā)明進(jìn)行PCR的示意圖。
圖36顯示流體包的結(jié)晶。
圖37顯示采用流體包進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和血液分析。
圖38為使流體格與DNA發(fā)動(dòng)機(jī)熱循環(huán)儀相界的機(jī)械結(jié)構(gòu)的各種視圖。
圖39為使流體格與DNA發(fā)動(dòng)機(jī)熱循環(huán)儀相界的機(jī)械結(jié)構(gòu)的各組件。
圖40為使流體格與DNA發(fā)動(dòng)機(jī)熱循環(huán)儀相界的具有閥連接的機(jī)械結(jié)構(gòu)的各種視圖。
圖41為使流體格與DNA發(fā)動(dòng)機(jī)熱循環(huán)儀相界的具有閥連接的機(jī)械結(jié)構(gòu)的組件。
發(fā)明詳述 本發(fā)明的實(shí)施方式涉及采用流體格形成流體包的分析物質(zhì)的方法和設(shè)備，所述物質(zhì)包括但不限于化學(xué)物質(zhì)、生化物質(zhì)、遺傳材料或生物細(xì)胞。本發(fā)明實(shí)施方式的可能應(yīng)用包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸序列擴(kuò)增(NASBA)、蛋白質(zhì)和小分子結(jié)晶和對生物流體中存在的稀有細(xì)胞的分析。
本文描述了樣品體積分散和操作裝置，其可適用于多種不同應(yīng)用和分析方法。圖 1顯示所述裝置的解剖整體視圖。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述裝置由主螺槽組成，其上散布有高度不同于主螺槽的相鄰的樣品隔室(室)?？筛淖冞@兩個(gè)特征的尺寸以限定分散樣品的體積。所述分散體積一旦形成就駐留在樣品隔室內(nèi)。通過所述裝置樣品隔室之間的間距來預(yù)先限定大型樣品陣列的間距。除該具體實(shí)施方式
以外，也可采用多種其它設(shè)計(jì)和實(shí)施方式，以下將對其進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
以下也將與流體螺槽具有流體交換的樣品隔室或室稱為“流體容納室”。這些流體容納室通常與通過流體螺槽的流體軸之間存在偏移。
如果所述流體容納室的開口的取向不是接受通過螺槽的流體的直接沖擊，則所述流體容納室與通過流體螺槽的流體軸之間存在偏移。在某些實(shí)施方式中，流體可以不平行于主流體螺槽的流體軸的角度進(jìn)入流體容納室。例如，在一些實(shí)施方式中，流體可以垂直于通過流體螺槽流體軸的方向進(jìn)入偏移的流體容納室。據(jù)稱，如果在容納室中心和流體螺槽中心線之間繪制的線長于螺槽壁和其中心線之間的最短距離，則流體容納室也可與通過流體螺槽的流體軸之間存在偏移。
本文所用的術(shù)語不混溶指不形成均一溶液或存在可觀察到的分隔流體的界限的流體。這樣的界限可在顯微鏡下通過光散射或通過檢測某種分子在一種流體相對另一種流體的優(yōu)先分布而觀察到。
本發(fā)明的實(shí)施方式可包括進(jìn)行生化分析的方法和設(shè)備，其中 (1)第一連續(xù)流體流過螺槽進(jìn)入流體格，所述流體格包括保護(hù)流體免受螺槽中高速度或速度梯度影響的流體容納室。
(2)第二連續(xù)流體流過所述流體格，攪亂所述第一流體。
在某些實(shí)施方式中，第三連續(xù)流體在所述第二流體之后流入所述流體格，攪亂所述第二流體。
在某些實(shí)施方式中，所述第三流體與所述第一流體在化學(xué)上相同。
在某些實(shí)施方式中，一種或多種流體在所述第一流體之后流入所述流體格，各流體分別攪亂之前的流體。
本發(fā)明的某些實(shí)施方式涉及進(jìn)行生化分析的方法或設(shè)備，其中將連續(xù)流體依次調(diào)換入駐留在流體容納室中的流體包，所述流體包保持連續(xù)流體的順序。
本文所用的術(shù)語“調(diào)換”指制劑重排。在調(diào)換中，在調(diào)換之前和之后均保留可識(shí)別的順序。例如，在調(diào)換之后，所述可識(shí)別順序可與原始順序具有相同的次序。在另一個(gè)實(shí)施例中，在調(diào)換之后，所述可識(shí)別順序可與原始順序具有相反的次序。在另一個(gè)實(shí)施例中， 在調(diào)換之后，所述可識(shí)別順序可僅包含原始順序的偶數(shù)條目。在另一個(gè)實(shí)施例中，在調(diào)換之后，所述可識(shí)別順序可僅包含原始順序的奇數(shù)條目。在另一個(gè)實(shí)施例中，在調(diào)換之后，所述可識(shí)別順序可包含原始順序的分段調(diào)換，保留順序包。
在一個(gè)實(shí)施方式中，順序指空間組成分布。
在分析連續(xù)流體的組成時(shí)，由于所述流體的自由流動(dòng)性質(zhì)，在進(jìn)行意在揭示組成分布的探詢、加熱、反應(yīng)或其它操作時(shí)可能難以保持組成特征的空間分布。本發(fā)明的實(shí)施方式采用連續(xù)流體，將其解構(gòu)為駐留在流體容納室中的流體包，但在解構(gòu)過程中也調(diào)換所述連續(xù)流體的組成特征。例如，如果進(jìn)入的連續(xù)流體在流體體積的右部包含5個(gè)生物細(xì)胞、在流體體積中部包含10個(gè)細(xì)胞、在流體體積左部包含15個(gè)細(xì)胞，則所述調(diào)換過程可產(chǎn)生駐留在最左邊流體容納室的包含5個(gè)細(xì)胞的第一流體包、駐留在中部流體容納室的包含10個(gè)細(xì)胞的第二流體包和駐留在最右邊流體容納室的包含15個(gè)細(xì)胞的第三流體包。由此細(xì)胞數(shù)量的順序得以保持，但在調(diào)換之后以相反次序存在。
調(diào)換過程提供的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在允許操作的情況下以某種方式保留順序。將連續(xù)流體解構(gòu)為流體包可切斷意外混合的可能性和由此可能引起的空間組成信息的破壞。調(diào)換能保留原始樣品順序，使可追溯到連續(xù)流體進(jìn)行定位。
在一個(gè)實(shí)施方式中，流過螺槽進(jìn)入流體格的各流體可保持連續(xù)直至進(jìn)入第一流體容納室。液滴、泡沫、堵塞物或分段流體為分散的不連續(xù)實(shí)體，不將其視作連續(xù)流體。
在一個(gè)實(shí)施方式中，連續(xù)流體包含體積等于或大于兩個(gè)流體容納室體積的任何未擾動(dòng)的流體。在其它實(shí)施方式中，連續(xù)流體包含體積等于或大于5個(gè)流體容納室體積的流體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，連續(xù)流體包含體積等于或大于20個(gè)流體容納室體積的流體。
本文所用的“生化分析”指確定流體內(nèi)存在的分析物的身份、濃度、比例、反應(yīng)性、 物理或分子性質(zhì)。例如，生化分析可包括PCR、核酸序列擴(kuò)增(NASBA)、化合物的結(jié)晶或沉淀、單細(xì)胞生物的觀察或細(xì)胞鑒定等?！吧治觥边€可指感興趣的過程如反應(yīng)、晶體生長和納米顆粒形成。
本文所用的“分析物”指感興趣的物質(zhì)，其可包括但不限于化學(xué)物質(zhì)、生化物質(zhì)、小分子、遺傳材料、顆?；蛏锛?xì)胞。
術(shù)語“流體格”指通過一個(gè)或多個(gè)螺槽相互連接的流體容納室的網(wǎng)狀物。流體容納室的排列可能在連接螺槽的一側(cè)或多側(cè)上具有或不具有周期重復(fù)性。
術(shù)語“流體容納室”指提供保護(hù)免受螺槽中流體影響的沿螺槽的位置，由此可在容納室中形成流體包。流體包在容納室中累積到充分占據(jù)所述體積并基本呈現(xiàn)所述容納室的形狀。例如，如果流體容納室為矩形，則包含于其中的流體包應(yīng)基本呈現(xiàn)矩形。在流體包形狀與外殼的形狀不一致的情況中(例如，如果在外殼為立方體時(shí)流體呈現(xiàn)球形)，這樣的外殼不視作流體容納室，因?yàn)榇嬖诘挚沽黧w流出外殼壁的的壁力，所述流體無法受到充分保護(hù)免受流體螺槽的速度或速度梯度的影響。
流體容納室保護(hù)流體包免受高速流體或高速度梯度流體沖擊的影響。在某些實(shí)施方式中，流體容納室不阻礙與其進(jìn)行交換的流體螺槽中的流體。在某些實(shí)施方式中，流體容納室入口處的流動(dòng)方向垂直于與其進(jìn)行交換的流體螺槽中的流動(dòng)方向。
在某些實(shí)施方式中，“基本呈現(xiàn)容納室形狀的流體包”指與球形狀態(tài)相比，流體體積的表面積或周長增大2%或更多。在一些實(shí)施方式中，“基本呈現(xiàn)容納室形狀的流體包” 指與球形狀態(tài)相比，流體體積的表面積或周長增大5%或更多。在一些實(shí)施方式中，“基本呈現(xiàn)容納室形狀的流體包”指與球形狀態(tài)相比，流體體積的表面積或周長增大10%或更多。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，“基本呈現(xiàn)容納室形狀的流體包”指與球形狀態(tài)相比，流體體積的表面積或周長增大25%或更多。
“主流體螺槽”指用來依次連接單個(gè)流體容納室的螺槽。所述主流體螺槽提供與流體容納室的流體交換。
在某些實(shí)施方式中，流體容納室的特征為從所述螺槽伸出的突起。流體容納室僅與一個(gè)主螺槽連接，但可與主螺槽進(jìn)行多于一次的連接。
在某些實(shí)施方式中，流體容納室提供對包括于所述流體容納室內(nèi)的流體包進(jìn)行定位或?qū)⒁粋€(gè)流體包與另一個(gè)進(jìn)行區(qū)分的坐標(biāo)。例如，可為各流體容納室分配一串獨(dú)特的文字?jǐn)?shù)字字符識(shí)別包括于其中的流體包。在將連續(xù)流體樣品調(diào)換入流體格時(shí)，將所述樣品解構(gòu)為物理性質(zhì)不同的流體包，各流體包根據(jù)其駐留的流體容納室具有獨(dú)特的可識(shí)別性。
術(shù)語“流體包”指定位的流體體積。流體包可與相同流體剩余部分的體積完全或基本分離?？捎弥虚g固體(例如壁)、液體(例如不混溶液體)、氣體或真空完成分離?！盎痉蛛x”表示在流體包和相同流體剩余部分的體積之間進(jìn)行橋連的流體直徑不大于流體包的液壓直徑的90%。
圖IA顯示流體格的示意圖。在圖IA(a)中，連續(xù)流體流入具有流體入口 101和 103以及流體出口 102的流體格110。所述流體格包括具有的流體容納室120用于產(chǎn)生流體包的流體螺槽。圖lA(b)顯示流體容納室的剖面圖和平面圖。在剖面圖中，流體容納室 131與可具有不同高度的流體螺槽133連接。在平面圖中，兩個(gè)流體容納室134和132與流體螺槽135連接。圖IA(C)顯示在流體容納室160中形成的包含150μΜ羧基熒光素的流體包150的熒光圖像。應(yīng)注意，流體包基本呈現(xiàn)流體容納室的形狀。該情況中的第一和第三流體是含0. 01%司盤80的輕質(zhì)礦物油。比例尺對應(yīng)于200 μ m。
流體格可具有不同數(shù)量的流體入口或出口。例如，如圖IlA所示，流體格1120可僅具有單個(gè)入口 1111，但與流體源1114和1115在流體格外部的T-連接點(diǎn)1113連接。
在某些實(shí)施方式中，所述第一連續(xù)流體和第二連續(xù)流體可在流體容納室處顯示不同的表面親和力或在流體容納室內(nèi)顯示不同的界面松弛。表面親和力可包括接觸角、界面張力、毛細(xì)作用力、潤濕、電潤濕、電毛細(xì)管現(xiàn)象、結(jié)合、化學(xué)或物理吸附。例如，所述第二連續(xù)流體可顯示比所述第一流體更強(qiáng)的駐留在流體容納室內(nèi)的傾向，由此攪亂之前流體容納室內(nèi)靜止的第一流體。
在某些實(shí)施方式中，可用化學(xué)或生物試劑對所述流體容納室進(jìn)行改性以使與流體接觸的表面優(yōu)先被第一或第二連續(xù)流體潤濕。例如，可對所述表面進(jìn)行改性以允許第二流體優(yōu)先駐留在流體容納室內(nèi)，由此攪亂之前靜止在流體容納室中的第一流體。也可對所述表面進(jìn)行改性以允許所述第一流體優(yōu)先占據(jù)流體容納室，使第二流體僅可攪亂第一流體的一部分。
在某些實(shí)施方式中，連續(xù)流體可包含各種分析物，包括但不限于化學(xué)物質(zhì)、生化物質(zhì)、遺傳材料(DNA、RNA等)、遺傳材料的表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物)、結(jié)晶分子、生物細(xì)胞或顆粒。
突起可采用各種形狀、尺寸并且側(cè)向和軸向偏離螺槽。例如，突起可類似于菱形、 五邊形、“L”形、“T”形、矩形或三角形。15.流體容納室的橫截面可為T形、L形、三角形、矩形、圓形、橢圓形、多邊形或正方形。在流體格內(nèi)，所述流體容納室可包括多于一種的幾何形狀和多于一種的大小且無特定的重復(fù)式樣。流體容納室可能具有其它形狀?？蓪α黧w容納室的形狀進(jìn)行改性使具有不同界面張力的不同流體可顯示不同的優(yōu)先駐留在流體容納室內(nèi)的傾向。
小流體包可在流體容納室中即刻形成，而不采用液滴形成的分離的不同步驟，之后將液滴定位于隔室。區(qū)域中的液滴形成和液滴定位可能不具有獨(dú)立且不同的操作。
在某些實(shí)施方式中，流體包可呈現(xiàn)外圍流體容納室的形狀。
在某些實(shí)施方式中，小流體包通過依次流動(dòng)連續(xù)而非不連續(xù)(例如，堵塞物、液滴或區(qū)段)流體進(jìn)入流體螺槽以占據(jù)流體容納室而形成。
在某些實(shí)施方式中，流體容納室產(chǎn)生流體包不需阻抗區(qū)。流體容納室僅與一個(gè)主流體螺槽具有流體交換。
操作 實(shí)施例1 用三種流體在流體容納室中產(chǎn)牛流體包 采用本裝置分散樣品的方法不止一種。在填充方法1(圖2、中，首先用與待分散樣品相不混溶的流體填充所述裝置。接著將所述樣品相緩慢引入所述裝置。之后使不混溶相再次流過所述裝置。在該最后一個(gè)步驟中，所述樣品相被移出主螺槽但仍留在樣品隔室中，使所述樣品相被分散為主要由隔室?guī)缀纬叽缦薅ǖ捏w積。所述分散有時(shí)可在初始樣品相填充步驟中發(fā)生。就樣品處于水性溶液中的生物鑒定而言，填充方法1會(huì)包括首先用不混溶相(例如，油或電子氟化液(Fluorinert))填充所述裝置，之后用樣品(水相)填充， 最后使不混溶油相再次流過所述裝置。
在該實(shí)施例中，如圖2A(a)所示，使起始連續(xù)流體202流過螺槽進(jìn)入流體格，所述流體格包含產(chǎn)生并保護(hù)流體包的流體容納室201。在圖2A(b)中，使包含分析物211的第一連續(xù)流體流過流體格，攪亂起始流體214。這之后，使第二連續(xù)流體223流過流體格(圖 2A(C))，其中流體容納室與通過螺槽流體的軸299之間存在偏移。圖2A(d，e)下部的熒光圖片顯示在矩形流體容納室中觀察到的熒光運(yùn)動(dòng)。
在該實(shí)施例中，所述起始連續(xù)流體為含0. 01%司盤80的輕質(zhì)礦物油，所述第一連續(xù)流體為含100 μ M Alexa488的水性溶液，所述第二連續(xù)流體與第一連續(xù)流體相同。
我們注意到，由于所述矩形流體容納室保護(hù)流體包Ml免受螺槽243中主流體對6 的影響，為所述流體包提供相對無應(yīng)力的環(huán)境，所述流體包呈現(xiàn)的形狀為流體容納室的形狀而非球形液滴的形狀。
填充方法1可用來100%分散樣品(圖幻。移動(dòng)穿過主螺槽的小樣品堵塞物會(huì)繼續(xù)填充各隨后的隔室并分為更小的體積直至所述堵塞物消失。這是本應(yīng)用方法的重要性能，其中待分析的材料量很小，如多種生物鑒定的情況一樣。填充方法1是大多數(shù)應(yīng)用分散樣品體積的優(yōu)選方法。
在一個(gè)實(shí)施方式中，產(chǎn)生的流體包的總體積與第二連續(xù)流體的進(jìn)入體積完全相同。可將連續(xù)流體體積引入螺槽并將其完全轉(zhuǎn)變?yōu)榱黧w包而不造成任何死體積或樣本損失。圖3A(a_c)顯示流體包形成過程和所得連續(xù)流體體積100%保留的示意圖。由于首先用起始流體314填充螺槽，之后用流體315填充以調(diào)換為用于分析的流體包，流體315繼續(xù)解構(gòu)為流體包321，直至最后一個(gè)流體容納室保留小于容納室體積的任何殘余連續(xù)流體。圖3A(d)為顯示該現(xiàn)象的實(shí)驗(yàn)時(shí)間順序。所述圖像顯示流體包(100 μ M Alexa 488)的熒光。 363所示流體為含0. 01%司盤80的輕質(zhì)礦物油，比例尺對應(yīng)于200 μ m。
在一個(gè)實(shí)施方式中，采用相反次序?qū)⑺龅诙黧w調(diào)換為流體包。將所述第二流體的最右邊部分調(diào)換為最左邊的流體包，且由于所述第二流體的左邊部分在流動(dòng)方向上前進(jìn)，產(chǎn)生的流體包位于右邊。
實(shí)施例2 用兩種流體在流體容納室中產(chǎn)牛流體包 圖4顯示采用本裝置的第二種分散方法。在該方法(填充方法幻中，首先用樣品相填充所述裝置。然后通過使不混溶相流過主螺槽來分散所述樣品相。就樣品處于水性溶液中的生物鑒定而言，填充方法2包括首先用水性樣品溶液填充所述裝置，之后用不混溶相如油(例如礦物油)或氟化溶劑(例如電子氟化液)填充。與填充方法1類似，隨不混溶相流過所述裝置，所述樣品相被移出主螺槽但仍留在樣品隔室中。同樣，分散的樣品相主要由樣品隔室的尺寸限定。與填充方法1的三個(gè)步驟相比，填充方法2僅具有兩個(gè)填充步驟，可能對某些應(yīng)用具有優(yōu)勢。
在該實(shí)施例中，如圖4A(a，b)所示，僅采用兩種連續(xù)流體在流體容納室中產(chǎn)生流體包。使連續(xù)第一流體414流過螺槽進(jìn)入流體格，所述流體格包含產(chǎn)生并保護(hù)流體包413 的流體容納室。然后使第二連續(xù)流體411流過流體格。圖4A(c)顯示流體容納室產(chǎn)生第一連續(xù)流體的流體包時(shí)流體容納室的順序圖片。
在順序圖像圖4A(c)中，所述第一連續(xù)流體為包含IOOnM磷酸鹽緩沖液的水性溶液，所述第二連續(xù)流體為含0.01%司盤80的輕質(zhì)礦物油。比例尺對應(yīng)于200 μ m。
隨連續(xù)第一流體流過螺槽進(jìn)入流體格，所述流體進(jìn)入流體容納室，受到保護(hù)免受主流體螺槽的速度或速度梯度的影響。所述第一流體(水性)隨其累積而呈現(xiàn)容納室的矩形形狀。然后所述第二連續(xù)流體(油)攪亂留在主流體螺槽中的第一流體，在流體容納室中形成矩形流體包。
在一個(gè)實(shí)施方式中，采用相反次序?qū)⑺龅谝涣黧w調(diào)換為流體包。將所述第一流體的最右邊部分調(diào)換為最左邊的流體包，且由于所述第二流體的左邊部分在流動(dòng)方向上前進(jìn)，產(chǎn)生的流體包位于右邊。
實(shí)施例3 用不同密度的流體在流體容納室中產(chǎn)生流體包 我們開發(fā)的用于樣品分散的另一個(gè)方法基于對樣品相和不混溶相浮力的潛在差異的利用。在該方法中，根據(jù)樣品相的浮力大于或小于不混溶相的浮力，樣品隔室駐留在主螺槽之上或之下。如果樣品相的浮力大于不混溶相，所述隔室位于主螺槽之上，如果樣品相的浮力小于不混溶相，所述隔室在主螺槽之下。圖5包括可用于該方法的可能的分散區(qū)幾何形狀的例子。可通過首先將樣品或不混溶相引入所述裝置，然后按照填充方法1或2所述的順序流程來實(shí)施該方法。可根據(jù)最適合具體應(yīng)用的原則選擇采用的特定流體順序。
在一個(gè)實(shí)施方式中，實(shí)施例1或?qū)嵤├?采用的流體可具有不同密度。在該實(shí)施例中(參見圖5A)，所述流體容納室可駐留在主流體螺槽之上或之下的平面而非螺槽所在的同一平面上，但不在流體軸上。如果包含分析物的流體的浮力大于其它流體，則所述流體容納室位于主螺槽之上。如果包含分析物的流體的浮力小于其它流體，則所述流體容納室位于主螺槽之下。圖5A(a，b)顯示用來保留浮力物質(zhì)的流體容納室501、503、511、513的例子。圖5A(c)顯示圖a和圖b對應(yīng)的剖面示意圖(上圖指由輪廓線510圈出的區(qū)域的剖面，下圖指由輪廓線520圈出的區(qū)域的剖面)，其顯示螺槽534正上方用來保留浮力物質(zhì)的流體容納室531。所述樣品容納室的高度大于螺槽的高度。如果包含分析物的連續(xù)流體的密度大于不含分析物的流體，則所述流體容納室位于主流體螺槽之下。
_仿丨丨4 麻勵(lì)流臉流驗(yàn)流腦艦伺ι 盡管分散樣品的體積主要由樣品隔室的尺寸確定，但可對其進(jìn)行細(xì)微調(diào)整。一種調(diào)整方式可通過填充方法1達(dá)到。如圖6所示，緩慢流動(dòng)的水相相比快速移動(dòng)的水相能更大程度填充樣品隔室。該填充程度與最終分散樣品體積相關(guān)。因此，在采用填充方法1時(shí)， 可通過調(diào)整樣品相的流速來調(diào)整分散樣品的精確體積。在填充方法2中，可通過改變不混溶相的流速來改變分散樣品的體積(圖7)。在不混溶相的流速很快時(shí)，移出占據(jù)各隔室的一些樣品體積，形成較小的樣品體積。在不混溶流速較低時(shí)，分散樣品會(huì)較大。
在一個(gè)實(shí)施方式中，連續(xù)流體的流速可用來控制容納室中流體包的形成。盡管流體包的體積主要由流體容納室的尺寸確定，但也可調(diào)整所述連續(xù)流體的流速以影響所述流體包的體積。
圖6Α為顯示連續(xù)流體流速對流體包體積的影響的一系列圖像。將包含100 μ M 5， 6-羧基熒光素的水性溶液用作包含分析物的流體，將含0. 01%司盤80的輕質(zhì)礦物油用作其它連續(xù)流體。
如圖6Α所示，緩慢流動(dòng)的流體相比快速移動(dòng)的流體可更大程度占據(jù)容納室。因此，流體包(ΙΟΟμΜ 5，6-羧基熒光素的水性溶液)的體積與流體流速成反比，在主要調(diào)整基于容納室體積的情況下作為對流體包體積的二次調(diào)整。圖64仏)、(13)、((3)和(d)的流體速度分別為0. 2、1. 1,6. 9和8. 3mm/秒。比例尺對應(yīng)于200 μ m。產(chǎn)生于8. 3mm/秒水性溶液的流體包642明顯小于產(chǎn)生于0. 2mm/秒的流體包612。
或者可調(diào)整其它流體的流速以控制流體包體積。在采用實(shí)施例2所述方法產(chǎn)生的第二連續(xù)流體流體包的流速增大時(shí)，流體容納室不提供對主流體螺槽中高速度的充分保護(hù)作用。圖7A(a)顯示較多包含分析物的水相被較高流速的油(有機(jī))相攪亂，產(chǎn)生較小的流體包701。在油(有機(jī))相的流速降低時(shí)(圖7A(b))，流體容納室被較大流體包721所占據(jù)。這些圖像中的水相為IOOnM磷酸鹽緩沖液，油相為電子氟化液。比例尺對應(yīng)于200μπι。
實(shí)施例5 用不同流體在流體容納室中產(chǎn)生流體包 可采用各種不混溶相來分散樣品。一些不混溶相包括但不限于天然油如礦物油和大豆油、硅油如AR-20和AS-4、PDMS油、氟化油如電子氟化液和全氟萘烷 (perfluorordecalin)、有機(jī)溶劑如十六烷和苯乙酮。圖8顯示采用不同不混溶相分散的一組樣品圖像。
在一個(gè)實(shí)施方式中，不含分析物的流體可包括天然油如礦物油和大豆油、硅油如 AR-20和AS-4、PDMS油、氟化油如電子氟化液和全氟萘烷、有機(jī)溶劑如十六烷和苯乙酮、或水性溶液如緩沖液或水。
圖8A顯示采用不同流體形成的流體包。用來形成如實(shí)施例1所述流體包的不含分析物的連續(xù)流體為含0.01%司盤80的輕質(zhì)礦物油(圖a)、電子氟化液(圖b)、AS-4硅酮油(圖c)、AR-20硅酮油(圖8A(d))。用來形成如實(shí)施例2所述流體包的不含分析物的連續(xù)流體為輕質(zhì)礦物油(圖8A(e))和電子氟化液油(圖8A(f))。
實(shí)施例6 用各種表面活性劑在流體容納室中產(chǎn)生流體包 在一些情況中，采用表面活性劑調(diào)整分散動(dòng)力學(xué)。圖9包括不用表面活性劑分散的樣品和采用各種表面活性劑分散的樣品的圖像。表面活性劑可用來協(xié)助從大體積樣品形成分散樣品。采用的表面活性劑不限于圖9所示的例子，可包括例如，非離子表面活性劑如脫水山梨糖醇單油酸酯(司盤80)、兩性離子表面活性劑如3-(N，N-二甲基十二烷銨)丙烷磺酸鹽(DDAPS)、陰離子表面活性劑如二辛基磺基丁二酸鈉(AOT)、陽離子表面活性劑如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，更重要的是，尤其適用于某些生物鑒定的聚乙二醇化和氟化的表面活性劑。
在某些實(shí)施方式中，將表面活性劑加入到一種或多種流體中以協(xié)助在容納室中產(chǎn)生流體包。在圖9A中，將表面活性劑如司盤80、八甘醇單癸基醚和四甘醇單癸基醚系統(tǒng)地加入到輕質(zhì)礦物油中，以研究其對流體包形成的影響。圖9A(a)顯示在純輕質(zhì)礦物油中的水性流體包的圖像。圖9A(b)顯示在含0. 01%司盤80的表面活性劑的輕質(zhì)礦物油中的水性流體包的圖像。在圖9A(b)中，流體包的形狀在此時(shí)與容納室的形狀相符。圖9B(c)為包含0.01%八甘醇單癸基醚的輕質(zhì)礦物油中的水性流體包的圖像。該情況中的流體包的形狀與容納室的形狀相符。圖9B(d)為包含0.01%四甘醇單癸基醚的輕質(zhì)礦物油中的水性流體包的圖像。在圖9B(c和d)中，流體包的形狀在此時(shí)與容納室的形狀相符。
除圖9A中采用的表面活性劑以外，也可引入其它表面活性劑用于在容納室中形成流體包的目的。其它表面活性劑包括但不限于兩性離子表面活性劑如3-(N，N- 二甲基十二烷銨)丙烷磺酸鹽(DDAPS)、陰離子表面活性劑如二辛基磺基丁二酸鈉(AOT)、陽離子表面活性劑如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，更重要的是，尤其適用于需要流體包中整體流體與周圍相/壁之間相互作用最小的情況的基于硅酮、聚乙二醇化和氟化的表面活性劑。
實(shí)施例7 用化學(xué)改性的壁在流體容納室中產(chǎn)生流體包 可對另一個(gè)參數(shù)即分散區(qū)的表面進(jìn)行改性以定義所述裝置的分散能力。圖10所示裝置為玻璃/PDMS芯片，其中在氧化兩個(gè)表面(PDMS和玻璃)并使二者接觸以形成所述裝置之后立即用含0.01%司盤80的輕質(zhì)礦物油進(jìn)行填充。在將樣品相引入該芯片然后引入更多不混溶相流體時(shí)，無分散樣品形成。相反，圖2所示裝置為與圖10中裝置類似的PDMS 芯片，但在裝置形成之后在115°C烘烤48小時(shí)。在用含0. 01%司盤80的輕質(zhì)礦物油填充圖2所示裝置時(shí)，樣品相被引入到所述芯片中，之后是更多不混溶相流體，分散樣品很容易形成。因此，可對所述裝置的表面進(jìn)行改性以控制分散是否會(huì)發(fā)生。
在某些實(shí)施方式中，流體容納室的壁可進(jìn)行化學(xué)改性以增大連續(xù)流體的表面親和力。例如，圖IOA顯示由聚二甲基硅氧烷(PDMS)和玻璃制造的流體格。在執(zhí)行實(shí)施例1所述流體方案之前用氧等離子體氧化所述流體格。該情況中的第一連續(xù)流體為含0.01%司盤 80的輕質(zhì)礦物油，第二連續(xù)流體為包含分析物的水相，第三連續(xù)流體與第一流體相同。我們注意到，在容納室的壁剛被氧化時(shí)，無流體包(圖IOA(b-c))形成。進(jìn)入流體容納室的流體不呈現(xiàn)容納室的形狀，也不與容納室的壁發(fā)生顯著的相互作用。
另一個(gè)也用氧等離子體氧化的流體格在氧化之后在115°C烘烤48小時(shí)。長時(shí)間的烘烤使容納室的壁具有疏水性(或親油性)。執(zhí)行實(shí)施例1和之前段落所述的方案。如圖 2A(b，c)所示，流體包在該情況中很容易形成。
此外，可對流體容納室的壁表面進(jìn)行化學(xué)改性，以增強(qiáng)潤濕或協(xié)助吸附所選的化學(xué)物質(zhì)、流體、細(xì)胞、顆?；蚍肿?。表面改性化學(xué)物質(zhì)可包括但不限于，硅烷如三甲基氯硅烷(TMCS)、六甲基二硅胺烷(HMDS)、1H，1H，2H，2H-全氟辛基三氯硅烷((Tridecaf luoro-Ι， 1,2, 2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane)、氯二甲基辛硅烷、十八烷基三氯硅烷(OTS) 或Y-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷；聚合物如丙烯酸、丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺 (DMA)、丙烯酸-2-羥乙酯、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯亞胺(PEI)、聚乙二醇(PEG)、環(huán)氧聚二甲基丙烯酰胺(印oxy poly (dimethylacrylamide) (EPDMA)或PEG-單甲氧基丙烯酸酯(PEG-monomethoxyl acrylate)；表面活性劑如普流羅尼克(Pluronic)表面活性劑、基于聚乙二醇(PEG)的表面活性劑、十二烷基磺酸鈉(SDQ十二烷基三甲基氯化銨(DTAC)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)或聚凝胺(PB)；纖維素衍生物如羥丙基纖維素 (HPC)或羥丙基甲基纖維素(HPMC)，胺如乙胺、二乙胺、三乙胺或三乙醇胺；含氟化合物如包含聚四氟乙烯(PTFE)或特氟隆的化合物。
制造 本文制造和描述并顯示于附圖中的示例裝置由聚二甲基硅氧烷(PDMS)或/和玻璃制成。除PDMS和玻璃以外，其它優(yōu)選的基材包括但不限于硅、熱固性聚酯(TPE)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯、聚酯(PET)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、聚對二甲苯、聚氯乙烯、氟乙基丙烯(fluoroethylpropylene)、熱塑聚碳酸酯、聚苯乙烯、環(huán)烯烴共聚物、聚氨酯、摻混聚丙烯酸酯的聚氨酯、聚酯碳酸酯、聚丙烯、25聚丁烯、聚丙烯酸酯、聚己內(nèi)酯、聚酮、聚酞酰胺、醋酸纖維素、聚丙烯腈、聚砜、環(huán)氧聚合物、熱塑性材料、含氟聚合物、聚偏氟乙烯、聚酰胺、聚酰亞胺、無機(jī)材料(玻璃、石英、硅、GaAs、氮化硅)、熔融二氧化硅、陶瓷、玻璃(有機(jī))、金屬和/或其它材料及其組合。就生物鑒定而言，優(yōu)選的基材基于聚合物材料， 使所述裝置可用后即棄供一次性使用。
幾何參數(shù) 實(shí)施例8 在各種形狀的流體容納室中產(chǎn)生流體包 為將液體引入所述裝置，根據(jù)制造所述裝置的材料和感興趣的填充方法，存在各種不同選擇。必須最少采用兩種流體以采用本裝置分散樣品。流體之間轉(zhuǎn)換的方法包括但不限于裝置內(nèi)用于不同相的內(nèi)置螺槽(圖11(a))、芯片上閥控制或離線閥控制(圖 11(b))?？烧{(diào)整離線閥以選擇引入芯片的相，芯片上閥可控制引入分散區(qū)的芯片中的流體類型?？梢来螌⒉煌南嘁胨鲅b置的分散區(qū)。在涉及多個(gè)螺槽時(shí)，可將不同溶液平行、 依次或根據(jù)某種預(yù)定順序弓I入不同螺槽，可進(jìn)行自動(dòng)操作。
分散區(qū)的尺寸具有靈活性，可進(jìn)行調(diào)整以最適合于感興趣的應(yīng)用。分散區(qū)的變化可包括但不限于圖12所示的情況。圖12(b)提供分散裝置設(shè)計(jì)中可改變的一些幾何參數(shù)的例子。圖12(c)所示的一組幾何形狀提供一些可能選擇的取樣，包括各種不同的樣品隔室形狀?？赡艿臉悠犯羰倚螤畈幌抻谒镜倪@些形狀。所述樣品隔室可與主螺槽具有相同高度或不同高度。一個(gè)實(shí)施方式中隔室具有與主螺槽不同的高度，如圖1(b)中所示。圖 12(d)顯示樣品隔室相對主螺槽的不同位置的例子?？蓛?yōu)化這些隔室的取向以適合于不同的應(yīng)用。圖13包括采用具有一組不同分散區(qū)幾何形狀的裝置分散的樣品的圖像。
可采用各種平面內(nèi)和平面外的流體容納室?guī)缀涡螤?，一些例子顯示于圖12A。例如，流體容納室可類似于菱形、五邊形、“ L ”形、“ T ”形、矩形或三角形。在流體格內(nèi)，所述流體容納室可包括多于一種的幾何形狀和多于一種的大小且無特定的重復(fù)式樣。流體容納室也可具有多種幾何亞單元形狀。
圖13A顯示在各種形狀包括菱形和T形的流體容納室中產(chǎn)生的流體包的圖像。
在一個(gè)實(shí)施方式中，流體容納室的高度可高于其連接的流體螺槽?？衫酶叨炔町惍a(chǎn)生來自不同密度或浮力的流體或具有與界面松弛相關(guān)的不同能量的流體包。在一個(gè)實(shí)施方式中，流體容納室的高度可低于其連接的流體螺槽。
棚列9躺艦_‘絲職麵艦鍾^ΦΡΦ艦伺ι 也可為分散室配置引導(dǎo)返回主螺槽或輔助螺槽的排出螺槽。這些排出螺槽可用來促進(jìn)樣品填充或樣品移除。圖14(a和b)顯示具有排出螺槽的樣品隔室的一些例子。所述排出螺槽可與主螺槽具有相同高度或不同高度。圖14(c和d)為在包括排出螺槽的裝置中形成的分散樣品的圖像。
在一些實(shí)施方式中，流體容納室可在多于一個(gè)位置與流體螺槽連接。例如，如圖 14A所示，流體容納室1402(或1411)可為“排出”螺槽1403(或1415)的特征，所示排出螺槽引導(dǎo)返回主流體螺槽以促進(jìn)流體容納室中流體包的產(chǎn)生或移除。盡管圖14A顯示僅與主流體螺槽具有兩處連接(例如，圖14A(a)中的1401和1403，圖14A(b)中的1412和1415) 的流體容納室，但應(yīng)考慮到流體容納室可具有任何數(shù)量的與主流體螺槽的連接。還應(yīng)考慮到流體容納室可具有任何數(shù)量的與主流體螺槽連接的排出螺槽。
與流體容納室連接的排出螺槽可與主流體螺槽具有相同高度或不同高度。圖 14A(a和b)顯示具有排出螺槽的流體容納室的一些例子。圖14A(c和d)為在具有排出螺槽的流體容納室中產(chǎn)生的流體包的圖像。
實(shí)施例10 流體容納室的排列 存在不同方法采用本裝置形成大陣列分散樣品。圖15顯示可用來達(dá)到大陣列分散樣品的裝置幾何形狀的例子。在圖15(a)中，5個(gè)平行主螺槽并排排列。在多種平行生物鑒定中，平行螺槽的數(shù)量最高可為幾百，并可能達(dá)到幾千?？蓪@些裝置依次或同時(shí)進(jìn)行填充。圖15(b)所示的一種替代形式具有包括交替樣品隔室以蜿蜒方式折疊的單個(gè)主螺槽。 圖15(c)顯示具有緊密間隔相鄰樣品隔室的蜿蜒型主螺槽的另一個(gè)例子。分散樣品的數(shù)量和間隔具有靈活性，可進(jìn)行調(diào)整以適合于特定應(yīng)用。
在某些實(shí)施方式中，流體格中可結(jié)合有具有流體容納室的多個(gè)流體螺槽。如圖 15A(a)所示，5個(gè)平行主流體螺槽并排排列，包括幾百到幾千個(gè)流體容納室。這些流體螺槽可依次(一次填充一個(gè)流體螺槽)或同時(shí)(同時(shí)填充所有螺槽)進(jìn)行填充。
在某些實(shí)施方式中，所述流體容納室可位于主流體螺槽的多于一個(gè)側(cè)面上。如圖 15A(b)所示，流體容納室以交替式樣在主流體螺槽(具有6個(gè)U形轉(zhuǎn)彎的蜿蜒狀)的兩個(gè)側(cè)面形成。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述流體容納室可在非常寬的螺槽的底板或頂板上形成二維陣列。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述流體容納室可僅在主流體螺槽的一個(gè)側(cè)面上形成。圖 15A(c)顯示僅位于主流體螺槽(具有4個(gè)U形轉(zhuǎn)彎的蜿蜒狀)一個(gè)側(cè)面上的流體容納室。
樣品操作 實(shí)施例11 混合流體容納室的成分 將樣品分散后，可實(shí)施各種操作技術(shù)用于需要進(jìn)行和監(jiān)測的鑒定和反應(yīng)。
以2D和3D方式混合隔室 由于設(shè)計(jì)的多用途性和制造的簡易性，所述分散方案可以2D和3D兩種陣列實(shí)施。 為實(shí)現(xiàn)不同樣品體積間的混合，2D陣列對彼此相鄰的具有不同成分的樣品體積進(jìn)行定位 (參見圖17和18)，從而使分隔兩個(gè)樣品體積(隔室)的分隔物(壁)的破壞引起之前包括于兩個(gè)獨(dú)立隔室的兩個(gè)樣品體積融合和混合。在3D陣列(圖16f)中，不同樣品體積在彼此之上或之下堆疊，使分隔頂-底兩個(gè)隔室的底板或頂板的破壞引起兩個(gè)不同樣品體積成分的融合和混合。各方式的示例性實(shí)施可參見圖16 (3D)以及圖17和1W2D)。
在某些實(shí)施方式中，流體容納室可與一個(gè)或多個(gè)流入容納室相鄰，由一個(gè)或多個(gè)可去除的壁分隔。破壞可去除壁后，所述流體容納室的成分可共混合。圖17A和18A顯示流體容納室的二維排列，其中同一水平平面上的兩個(gè)相鄰的容納室由可去除壁分隔。破壞所述壁后，流體包發(fā)生融合和混合。
在一個(gè)實(shí)施方式中，流體容納室可在一個(gè)或多個(gè)流入容納室之上或之下成層，由一個(gè)或多個(gè)可去除壁分隔。例如，圖16A(f)顯示流體容納室的三維排列，其中位于兩個(gè)水平平面上的流體容納室在另一個(gè)之上成層，各對相鄰的容納室由可去除壁分隔。
所述3D成層設(shè)計(jì)需要樣品隔室在彼此之上排列。圖中顯示兩層，但這可倍增形成更多層。在樣品隔室的3D或2D陣列中，成分待相互混合的隔室由薄膜或基材在隔室內(nèi)進(jìn)行空間隔離，使相鄰隔室的樣品體積在薄膜或基材被破壞或去除之前不發(fā)生混合。
分隔相鄰流體容納室的可去除壁或膜可由可采用以下方法中任一種降解的任何材料制成光誘導(dǎo)(圖17A(c)，破壞膜171 、熱誘導(dǎo)(圖17A(d)，條狀加熱器1711破壞膜 1713)、溶劑誘導(dǎo)、電場誘導(dǎo)、磁場誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)、機(jī)械誘導(dǎo)、氣動(dòng)誘導(dǎo)、溶解誘導(dǎo)或其組合。
該薄膜可由任何可降解(通過光誘導(dǎo)、熱誘導(dǎo)、溶劑誘導(dǎo)、電場誘導(dǎo)、磁場誘導(dǎo)或其組合)材料制成，所述可降解材料會(huì)作為碎片或溶解物質(zhì)分別進(jìn)入不混溶相或連續(xù)相 (或二者)。優(yōu)選來自薄膜的材料不溶解進(jìn)入水相以避免干擾在水相中進(jìn)行的鑒定。所述膜還可由在連續(xù)相中具有某種溶解度而使其成為臨時(shí)膜的材料制成，一旦樣品體積在隔室內(nèi)發(fā)生分散，所述臨時(shí)膜就在預(yù)定時(shí)間或在不混溶相進(jìn)行交換后(用一種類型的不混溶相代替另一種)發(fā)生溶解。例如，所述膜可能不溶于硅油但溶于全氟溶劑，其中所述分散過程可在硅油中進(jìn)行，所述膜溶解可采用全氟溶劑進(jìn)行，這里的硅油和全氟溶劑均不與水性溶液混溶。
在某些實(shí)施方式中，可去除壁或膜由優(yōu)先溶于連續(xù)流體中的一種的材料制成?？赡苄枰扇コ诘乃槠蝗芙膺M(jìn)入含分析物的流體，以避免干擾感興趣的分析物。
該薄膜或基材的破壞或去除可基于多種機(jī)制，包括但不限于，激光消融、激光加熱、光誘導(dǎo)膜破裂、光誘導(dǎo)分子構(gòu)象改變、光誘導(dǎo)膜在不混溶相或水相中溶解度改變、采用模式加熱墊進(jìn)行熱誘導(dǎo)膜去除、電場誘導(dǎo)膜去除、電解、膜介電擊穿、膜電穿孔、溶劑誘導(dǎo)膜去除、磁場誘導(dǎo)膜去除、超聲誘導(dǎo)膜去除、催化劑或化學(xué)誘導(dǎo)膜去除、PH誘導(dǎo)膜去除或其一些組合。
在一些實(shí)施方式中，分隔相鄰流體容納室的壁可由以下技術(shù)中任何一種去除激光消融、激光加熱、光誘導(dǎo)膜破裂、光誘導(dǎo)分子構(gòu)象改變、光誘導(dǎo)膜在不混溶有機(jī)相或水相中溶解度改變、通過模式加熱墊進(jìn)行熱誘導(dǎo)膜去除、電場誘導(dǎo)膜去除、電解、膜介電擊穿、膜電穿孔、溶劑誘導(dǎo)膜去除、磁場誘導(dǎo)膜去除、超聲誘導(dǎo)膜去除、催化劑或化學(xué)誘導(dǎo)膜去除、PH 誘導(dǎo)膜去除或其組合。
在一個(gè)實(shí)施方式中，分隔相鄰流體容納室的壁可單獨(dú)去除。
2D設(shè)計(jì)在構(gòu)造上較為簡單，僅需要在相鄰隔室之間夾入一個(gè)膜層。其一個(gè)示例性構(gòu)造可參見圖17和18，其突出了所述設(shè)計(jì)的單獨(dú)可處理性或全排可處理性。在圖17(a) 中，連同17(b)中的填充螺槽的示意圖像提供所述螺槽的3D示意圖，其中不同樣品由薄膜分隔。在圖17(a)中，為分隔圖像的清楚起見，省略分隔膜。憑借該3D設(shè)計(jì)，可如上所述采用各種方法破壞所述膜。
在某些實(shí)施方式中，分隔相鄰流體容納室的多個(gè)壁可同時(shí)去除。例如，可同時(shí)處理包含多個(gè)相鄰流體容納室的流體格的整個(gè)區(qū)域，同時(shí)去除分隔相鄰容納室的所有壁。圖18A 顯示5對相鄰流體容納室的例子，各對由可去除壁1811分隔。一條加熱元件1821橫穿所有5對容納室，同時(shí)去除5個(gè)壁，引起5組流體包成分的混合同時(shí)進(jìn)行。
除單獨(dú)處理鑒定或隔室以外，可采用相同破壞方案處理整個(gè)芯片區(qū)段或芯片的排或所選部分，能使多種樣品鑒定或反應(yīng)(可為同一類型或不同類型)在所述芯片中進(jìn)行。其一個(gè)示例性實(shí)施方法可參見圖18，其中模式化加熱元件用來破壞一行膜，使一排隔室融合。
采用輔助螺槽保持樣品條件和使用分散樣品進(jìn)行PCR 棚列12穩(wěn)淀艦白棚賴 在某些實(shí)施方式中，用輔助流體螺槽遞送的物質(zhì)能夠穩(wěn)定在流體容納室中產(chǎn)生的流體包。
作為例子，包含遺傳材料水性溶液的流體包在流體容納室中產(chǎn)生，并在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)過程中經(jīng)歷加熱步驟。流體格由氣體可滲透材料聚二甲基硅氧烷(PDMQ制成。 由于流體包被加熱，水分蒸發(fā)并從容納室中逸出，導(dǎo)致分析物濃度產(chǎn)生不受控制的變化。兩個(gè)輔助螺槽(例如，圖19A(a)中的輔助螺槽1902和1903，圖19A(c)中的輔助螺槽1922 和192 各有一個(gè)位于主流體螺槽的各側(cè)，可用來攜帶具有特定流速的水性溶液以用水使 PDMS飽和，最大程度減少流體包體積的蒸發(fā)或降低，而通過擴(kuò)散補(bǔ)充流體包的水性成分。
圖20A包括不存在(圖20A(a_e))和存在(圖20A(f-j))用流動(dòng)水填充的輔助螺槽時(shí)加熱的流體包的圖像。在如圖19A所示存在輔助螺槽時(shí)加熱時(shí)，避免或最大程度減少了流體包體積損失。圖20A中的流體包包含IOmM Tris HCl、50mM KCl和1. 5mM MgCl2W 水溶液。其它連續(xù)流體為含0.01%司盤80的輕質(zhì)礦物油。所述輔助螺槽的存在能保持流體包體積，由此可在PCR實(shí)驗(yàn)的加熱過程中穩(wěn)定流體包組分的濃度。
在某些實(shí)施方式中，不與流體容納室進(jìn)行流體交換的輔助螺槽位于流體容納室附近，以穩(wěn)定所述流體容納室的成分。在一些實(shí)施方式中，輔助螺槽攜帶可擴(kuò)散組分以注入流體容納室中流體包的組成成分。在某些實(shí)施方式中，輔助螺槽攜帶抑制流體容納室中流體包組分逃逸的組分。
在一些實(shí)施方式中，用輔助流體螺槽遞送或去除的能量穩(wěn)定在流體容納室中產(chǎn)生的流體包。作為例子，輔助螺槽可攜帶加熱的流體以通過傳導(dǎo)升高流體包的溫度?；蛘?，輔助螺槽可攜帶冷卻的流體以通過傳導(dǎo)降低流體包的溫度。流體包的精確溫度控制可能是優(yōu)化PCR反應(yīng)速率必需的。
本發(fā)明所述裝置的實(shí)施方式能使分散和操作過程分離。這部分歸因于布局和構(gòu)造，以及芯片上隔室內(nèi)樣品的穩(wěn)定性。還受到通過采用輔助控制螺槽保持最佳樣品條件的能力的協(xié)助。例如，就一些應(yīng)用如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)而言，加熱分散樣品可能是必需的。如果所述裝置由氣體可滲透材料如PDMS制成，可能發(fā)生加熱中樣品蒸發(fā)的復(fù)雜問題。位置接近樣品隔室的輔助螺槽可用來用水使氣體可滲透的聚合物芯片或不混溶相飽和，以抑制加熱水性分散樣品時(shí)的體積損失?？梢宰钸m合具體應(yīng)用的方式結(jié)合這些輔助螺槽。圖19 提供輔助螺槽示意圖的例子。圖19(a)中為在分散區(qū)兩側(cè)各結(jié)合輔助螺槽的分散裝置樣式。在該實(shí)施例中，主螺槽任一側(cè)上均有兩個(gè)薄輔助螺槽。在一個(gè)替代構(gòu)型中，主螺槽任一側(cè)上可能均有一個(gè)大輔助螺槽(圖19(c))。圖20包括不存在(圖20(a_e))和存在(圖 20 (f-j))用水填充的輔助螺槽時(shí)加熱的樣品體積的圖像。在包括水性輔助螺槽的分散裝置中加熱時(shí)，避免或最大程度減少了樣品體積損失。圖像中的樣品相為IOmM Tris HCl、50mM KCl和1.5mM MgCl2。不混溶相為含0. 01%司盤(Span)80的輕質(zhì)礦物油?？汕宄乜吹?， 所述輔助螺槽的存在能保持樣品體積，由此在PCR實(shí)驗(yàn)的加熱和冷卻循環(huán)中保持濃度。
通常，位置常接近樣品隔室和分散區(qū)的這些輔助螺槽能注入和保持可部分溶于需要在實(shí)驗(yàn)之前或期間進(jìn)行飽和的基材或不混溶相的任何材料。所述輔助螺槽還能使隔室的其它局部環(huán)境參數(shù)(例如溫度)受到主動(dòng)控制。例如，由于尺寸級別小，芯片的熱擴(kuò)散系數(shù)非常大，一旦發(fā)生改變，能建立快速平衡。這使所述輔助螺槽作為分隔體積的實(shí)時(shí)環(huán)境控制發(fā)揮作用。
將分散樣品傳輸出隔室 實(shí)施例13 從流體容納室釋放流體包 在某些實(shí)施方式中，可從用來形成流體包的流體容納室釋放所述流體包。
流體包在流體容納室中產(chǎn)生之后，常需要從流體容納室移出整個(gè)或一部分流體包用于進(jìn)一步分析、處理或監(jiān)測。
分散分隔樣品之后，常需要移出一些或全部樣品用于進(jìn)一步分析或監(jiān)測。這可通過逐滴操作方式(一次移出部分分隔樣品)、采用流體轉(zhuǎn)移完全移出所述體積，或采用界面張力改性使所述樣品在流動(dòng)中更易于變形來完成。以下將描述達(dá)到移出分隔樣品的一些方法。
通過改變流速提取分隔樣品 一種提取或樣品體積移出方法是通過使不混溶相以增大的流速流過所述裝置。 該方法的實(shí)驗(yàn)可參見圖21。在該圖中，所述樣品相為InM磷酸鹽緩沖液，所述不混溶相為含0.01%司盤80的輕質(zhì)礦物油。為從隔室移出所述樣品，將不混溶相的流速設(shè)為每分鐘 3uL0所述不混溶相的流動(dòng)引起分散體積逃出隔室。通過改變不混溶相的流速，可調(diào)整提取液滴的體積，如果需要，可達(dá)到完全移出所述樣品體積。
在某些實(shí)施方式中，可通過改變流速從流體容納室釋放流體包。在某些實(shí)施方式中，可通過使另一連續(xù)流體流入流體格來從流體容納室釋放流體包。在一些實(shí)施方式中，可通過改變流體之間的相互作用來從流體容納室釋放流體包。
圖21A顯示通過改變流速從流體容納室部分釋放流體包的例子。在圖21A中，所述流體包為InM磷酸鹽緩沖液，所述另一連續(xù)流體2105為含0. 01%司盤80的輕質(zhì)礦物油。 為從用來形成流體包的流體容納室移出一部分流體包，將所述輕質(zhì)礦物油的流速增大到每分鐘3 μ L(在流體包形成之后)。所述輕質(zhì)礦物油的流動(dòng)引起所述流體包的各部分逃出容納室。
通過引入第二不混溶相提取分隔樣品 芯片設(shè)計(jì)的多用途性能實(shí)現(xiàn)結(jié)合多重分散連續(xù)相入口。移出樣品體積的一種替代方法是使具有不同粘度和/或不同密度的第二不混溶相流過所述裝置。例如，通過在樣品分散之后使粘度更大的不混溶相流過所述裝置，可以有序方式從隔室完全移出所述樣品并將其轉(zhuǎn)移到不同區(qū)域用于進(jìn)一步分析。該技術(shù)還能完全清空芯片，使其再循環(huán)供多次使用。 在采用利用樣品相和不混溶相之間浮力差異的填充方法時(shí)，與第一不混溶相具有不同密度的第二不混溶相會(huì)從樣品隔室移出分散樣品。
圖22A顯示通過使另一連續(xù)流體流入流體格而從流體容納室釋放的流體包的例子。例如，在流體容納室中產(chǎn)生流體包之后，可使粘度更高的另一連續(xù)流體流入流體格，攪亂所述流體包?？梢杂行蚍绞綇娜菁{室完全移出所述流體包，并將所述流體包轉(zhuǎn)移到不同區(qū)域用于進(jìn)一步分析。從流體容納室移出流體包的能力還能完全清空流體格，以使所述流體格再循環(huán)并將其用于形成不同流體包。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述進(jìn)行攪亂的連續(xù)流體可能比之前的連續(xù)流體粘度更大。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述進(jìn)行攪亂的流體可能比之前的流體更輕或密度更小。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述進(jìn)行調(diào)換的流體可能比之前的流體密度更大。
此外，可通過將不混溶流體轉(zhuǎn)換為包含增大或減小量的表面活性劑或僅包含不同表面活性劑的不混溶流體來進(jìn)一步調(diào)節(jié)從隔室進(jìn)行樣品提取。在該情況中，所述第二不混溶相流可以是相同的不混溶油但具有不同類型或量的表面活性劑，或可以是完全不同的不混溶油，其包含相同量或不同量或類型的表面活性劑。一旦使該具有不同表面活性劑含量的第二不混溶相流過芯片，一些表面活性劑會(huì)遷移到將樣品溶液與不混溶相分隔的界限， 由此改變界面張力并使樣品體積更易于發(fā)生界面變形和更易于從隔室移出。
在一個(gè)實(shí)施方式中，所述進(jìn)行攪亂的連續(xù)流體可與之前的連續(xù)流體類似或相同， 但與不同量的表面活性劑混合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述進(jìn)行攪亂的連續(xù)流體在化學(xué)上可不同于之前的連續(xù)流體，但與相同組成的表面活性劑混合。這兩個(gè)實(shí)施方式均改變流體包的界面張力，可使所述流體包更易于發(fā)生界面變形和更易于從用來產(chǎn)生所述流體包的流體容納室排出。
通過結(jié)合外部通道螺槽從隔室完全提取樣品體積 從分隔區(qū)提取樣品的另一種方法是通過引入外部通道螺槽。可利用外部通道螺槽以受控方式移出樣品體積(圖23)，可將這些通道螺槽結(jié)合到分散裝置中以處理和促進(jìn)單個(gè)所選分散樣品的移出。通過樣品隔室螺槽將外部通道螺槽與樣品隔室連接?？蓛?yōu)化外部通道螺槽和樣品隔室的尺寸以適合于具體應(yīng)用。圖23顯示一些可用的結(jié)合技術(shù)，整個(gè)陣列 (圖23(a，b))和區(qū)域選擇性方式(圖23(c，d))均可采用。由于分散區(qū)中的裝置具有靈活性，這些外部通道螺槽可采用之前詳述的分散幾何形狀中的任何一種。圖23(a)顯示外部通道螺槽與主螺槽平行延伸的分散裝置的例子。該外部通道螺槽與提供進(jìn)入各樣品隔室通道的樣品隔室螺槽連接?？蓪⑺鐾獠客ǖ缆莶墼O(shè)置為如所需一樣多或一樣少的樣品隔室發(fā)生相互作用，如圖23(c，d)所示具有用來獨(dú)立處理不同樣品隔室的3個(gè)外部通道螺槽的分散裝置的例子。通過向這些外部通道螺槽施加正壓力，例如，可將所述分散樣品從隔室推入不混溶相流或主螺槽中，它們可在其中被輸出用于進(jìn)一步分析。除采用流體傳輸排出或逐出的樣品體積之外，可采用施加力以移動(dòng)樣品體積的其它方法，所述力如輻射壓力、電場衍生力、表面張力衍生力、熱梯度衍生力或磁力。
在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過進(jìn)入通道螺槽的流體從流體容納室釋放流體包。圖23A 顯示結(jié)合于流體容納室旁以釋放流體包的通道螺槽，整個(gè)流體格(圖23A(a，b))和選擇性方式(圖23A(c，d))均可采用。圖23A(b)為由輪廓線2302圈出的圖23A(a)的放大視圖， 其顯示具有與主螺槽2334平行延伸的外部通道螺槽2333的流體格的例子。可將所述外部通道螺槽設(shè)置為如所需一樣多或一樣少的流體容納室發(fā)生相互作用，如圖23A(c，d)所示具有用來獨(dú)立處理不同流體容納室的3個(gè)外部通道螺槽2363、2373和2383的流體格的例子。通過向這些外部通道螺槽施加正壓力，可從流體容納室釋放流體包使其進(jìn)入主螺槽中，所述流體包可在其中被輸出用于進(jìn)一步分析。圖2 顯示通過對與各流體容納室連接的外部通道螺槽施加正壓力選擇性釋放的兩個(gè)流體包2373和2377的順序圖像。主流體螺槽2379的流速為IyL/分鐘。通過人工操作填充油的注射器來施加所述正壓力。比例尺對應(yīng)于100 μ m。圖23C顯示采用替代通道螺槽構(gòu)型的流體包釋放的順序圖像。
在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過進(jìn)入通道螺槽的流體從流體容納室釋放一部分流體包。圖23C顯示在向通道螺槽2389施加正壓力引起流體流入通道螺槽時(shí)釋放一部分 2394(之后為2391)的流體包2390的順序圖像。通過人工操作填充油的注射器來施加所述正壓力。主螺槽的流速為1 μ L/分鐘。比例尺對應(yīng)于100 μ m。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，流體包通過臨時(shí)壁與通道螺槽分隔。如圖27A所示，通道螺槽2702通過溫度或溶劑反應(yīng)性壁或膜2703與流體容納室2701分隔(圖27A(a))。在用條狀加熱器2712加熱后或通過溶劑溶解效應(yīng)，所述膜溶解/破裂，使流體容納室和通道螺槽之間發(fā)生流體交換(圖27B(b))。然后駐留在流體容納室內(nèi)的流體包可流入用于收集的通道螺槽。如果R2是流體阻力低于Rl的途徑，則所述流體包可移動(dòng)進(jìn)入通道螺槽(圖 27B(c))。一旦進(jìn)入通道螺槽，所述流體包向下游移動(dòng)以供進(jìn)一步分析(圖27B(d))。除采用條狀加熱器的直接加熱方案和壁或膜溶解以外，可采用其它壁或膜技術(shù)，如直接和/或間接光學(xué)加熱方法以啟動(dòng)壁或膜破裂。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，流體包通過可轉(zhuǎn)換閥與通道螺槽分隔。例如，如圖28A所示，可在流體容納室和通道螺槽觀01之間設(shè)置芯片上閥觀03以控制流體包觀06的釋放。 作為例子，磁珠觀05可位于流體容納室和通道螺槽之間，防止流體交換。將磁鐵條觀02置于流體格之下以控制磁珠的位置(圖^A(a))。在去除流體格下的磁鐵后，磁珠可被釋放， 使流體容納室和通道螺槽之間發(fā)生流體交換(圖^A(b))。一旦通道螺槽開放，如果R2與 Rl相比是阻力更低的途徑，則流體包可進(jìn)入通道螺槽(圖^A(C))。一旦進(jìn)入通道螺槽，所述流體包可發(fā)生融合或保持獨(dú)立，并向下游移動(dòng)以供進(jìn)一步分析(圖^B(d))。圖中顯示采用永久磁鐵，雖然也可采用電磁體，可在Rl和R2之間調(diào)節(jié)阻力以從隔室部分移出流體包。 還可采用其它直接或間接機(jī)械變形方案以實(shí)現(xiàn)閥控制，如采用小機(jī)械點(diǎn)(如來自盲文顯示器(Braille display))以使基材變形并由此將其用作閥。
通過采用熱實(shí)現(xiàn)界面張力或熱膨脹提取分隔樣品 在某些實(shí)施方式中，可通過在流體包上施加力來從流體容納室釋放流體包。力可包括但不限于，真空、氣動(dòng)壓力、聲波壓力、超聲脈沖、輻射壓力、電磁場、電潤濕、光誘導(dǎo)表面潤濕、電毛細(xì)管現(xiàn)象、表面或界面張力、熱梯度衍生力、靜電相互作用或磁力。
可通過采用溫度改變(例如降低)隔室內(nèi)樣品的界面張力(IFT)協(xié)助從隔室提取樣品。例如，降低IFT使樣品體積更易于發(fā)生界面變形并更易于通過流體從隔室移出。這樣的一種方案可參見圖對，其中在樣品-不混溶相界限處采用模式加熱墊?？烧{(diào)整這些溫度墊以使區(qū)域在不混溶相流動(dòng)時(shí)優(yōu)先并選擇性釋放樣品。例如，僅加熱預(yù)先確定的樣品隔室的界面。在從隔室釋放后，所述樣品形成堵塞物或液滴并受連續(xù)相流的驅(qū)動(dòng)沿螺槽向下流動(dòng)。除流體以外，可采用通過施加力以移動(dòng)樣品體積的其它方法，所述力如輻射壓力、電場衍生力、表面張力衍生力、熱梯度衍生力或磁力。
在某些實(shí)施方式中，可通過改變溫度從流體容納室釋放流體包。改變溫度可直接改變界面張力并可使流體包從流體容納室釋放。該實(shí)施方式的示意圖可參見圖24A，其中模式加熱墊對02位于流體容納室對03和流體格MOl的主流體螺槽的界限附近?？烧{(diào)整這些加熱墊以使區(qū)域在連續(xù)流體流動(dòng)的情況下優(yōu)先并選擇性釋放流體包。從容納室釋放后，流體包受連續(xù)流體相流的驅(qū)動(dòng)沿螺槽向下流動(dòng)。達(dá)到流體包釋放的其它方案包括但不限于采用激光點(diǎn)加熱所選流體包的界面以改變界面張力并引起流體包從流體容納室選擇性釋放。
模式加熱墊也可用來加熱不混溶相或水相以誘導(dǎo)熱啟動(dòng)體積變化而非加熱界面以實(shí)現(xiàn)IFT變化，由此從隔室逐出樣品。例如，加熱不混溶相產(chǎn)生泡沫以從隔室排出樣品體積。
在某些實(shí)施方式中，可通過相變從流體容納室釋放流體包。在一些實(shí)施方式中，可通過產(chǎn)生泡沫從流體容納室釋放流體包。在一個(gè)實(shí)施例中，模式加熱墊也可用來加熱流體包以誘導(dǎo)氣泡產(chǎn)生而非加熱流體包以實(shí)現(xiàn)界面張力變化，由此從容納室逐出流體包。如圖 25A所示，在另一個(gè)實(shí)施例中，可采用輻射源(例如具有聚焦激光)代替熱源以引起界面張力變化或誘導(dǎo)相變。通過使聚焦激光靶向流體包2502和不混溶連續(xù)流體2503之間界面界限2501，可通過光學(xué)加熱扭曲所述界面隨后引起流體包釋放。由于聚焦激光系統(tǒng)可簡單地進(jìn)行測量、改裝并具有動(dòng)態(tài)性，還可通過用激光直接加熱或通過采用在表面上成層的吸收材料來單獨(dú)處理感興趣的流體包并從容納室移出所述流體包。這樣的可單獨(dú)處理系統(tǒng)的一個(gè)例子可參見圖^A，其中在所示5個(gè)流體包中，通過將激光聚焦在界面四12，僅有流體包 2911被釋放進(jìn)入主螺槽。
以與采用模式加熱器以改變界面張力或?qū)崿F(xiàn)熱膨脹的相似方式，還可采用直接光吸收(例如用聚焦激光)或間接光學(xué)加熱(例如吸收周圍材料或模式元件)，如圖25所示。 由于聚焦激光系統(tǒng)可簡單地進(jìn)行測量并具有動(dòng)態(tài)性，還可通過用激光直接加熱液滴/堵塞物界面或通過采用在表面上成層的吸收材料來單獨(dú)處理感興趣的隔室并從所述隔室移出樣品。所述可單獨(dú)處理系統(tǒng)的一個(gè)例子可參見圖四。
如采用加熱墊進(jìn)行加熱的情況，一旦界面變形或熱膨脹發(fā)生，可采用連續(xù)相使所述樣品流出隔室，形成液滴樣品液滴/堵塞物流。類似地，除流體以外，可采用通過施加力以移動(dòng)樣品體積的其它方法，所述力如輻射壓力、電場衍生力、表面張力衍生力、熱梯度衍生力、超聲或磁力。
采用電潤濕驅(qū)動(dòng)分散體積離開隔室來提取樣品 通過將電極模式整合到所述裝置中，可采用電潤濕方案來引導(dǎo)液滴運(yùn)動(dòng)。該方案要求電極在分散隔室和由小距離分隔的主流體螺槽中形成模式(圖26(a))。采用電潤濕使樣品堵塞物移動(dòng)需要控制置于電極兩側(cè)上的電荷。通過改變它們之間的電荷，可改變一個(gè)電極上液滴的潤濕角，使樣品體積移動(dòng)并使其從隔室移出。
在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過電潤濕從流體容納室釋放流體包。通過將模式電極2604(與導(dǎo)線沈01電連接)和2602(與導(dǎo)線沈03電連接)整合到流體容納室和主流體螺槽沈05中(圖^A(a))，由于電極帶有電荷，可增大主流體螺槽的表面潤濕，由此誘導(dǎo)流體包移動(dòng)出容納室進(jìn)入主流體螺槽?？赏ㄟ^采用獨(dú)立而非串聯(lián)的導(dǎo)線連接電極來單獨(dú)處理所述流體包。圖26A顯示該方法的示意圖，其中從流體容納室同時(shí)提取出一組5個(gè)流體包進(jìn)入主流體螺槽?？赏ㄟ^光學(xué)手段控制表面潤濕，其中光照明引起所述表面的潤濕性質(zhì)改變 (例如，由于光誘導(dǎo)分子取向或表面分子排列變化)。
還可通過采用獨(dú)立而非串聯(lián)的導(dǎo)線連接電極來單獨(dú)處理分散的樣品。圖沈顯示所述技術(shù)的可能利用，其中從隔室同時(shí)提取一系列液滴進(jìn)入不混溶流體。也可將電極設(shè)置在流體螺槽內(nèi)以采用電潤濕法將樣品向下游移動(dòng)。
對外部通道螺槽采用膜分隔引起臨時(shí)封閉來提取樣品 引入外部通道螺槽可在分散之后沿不同途徑引導(dǎo)樣品流?？赏ㄟ^能進(jìn)行閥控制和將樣品隔室與通道螺槽分隔的溫度和/或溶劑可降解膜將這些螺槽與主分散隔室分隔。一個(gè)示例性實(shí)施方法可參見圖27。該分隔膜可以是溫度和/或溶劑反應(yīng)性材料，所述膜夾在樣品隔室和通道螺槽之間(圖27 (a))。在單獨(dú)加熱膜后或通過溶劑額外的溶解效應(yīng)，所述膜溶解/破裂，開放出口螺槽(圖27 (b))。一旦去除了所述膜，外部通道螺槽就可通向樣品隔室，連續(xù)或不混溶相可流動(dòng)。由于&與R1相比是阻力更低的途徑，樣品堵塞物移動(dòng)進(jìn)入出口螺槽(圖27(c))。一旦進(jìn)入外部通道螺槽，所述樣品堵塞物在進(jìn)一步注入連續(xù)相后向下游移動(dòng)以供進(jìn)一步分析(圖27(d))。雖然顯示的是直接加熱方案，但直接和/或間接光學(xué)加熱方法也可用來啟動(dòng)膜破裂。還可采用如上所述的多種其它膜破裂機(jī)制。
采用外部操作螺槽閥控制提取樣品 外部通道螺槽也可通過采用直接或間接芯片上閥控制(例如磁或用機(jī)械變形)具有調(diào)節(jié)通道用于移出分隔樣品陣列。這樣的一個(gè)示例性實(shí)施方法可參見圖28。將磁珠排列到出口螺槽之上的區(qū)域中，將磁鐵置于芯片之下，形成對磁珠的向下吸引，完全或部分密封所述出口螺槽(圖^(a))。去除芯片下的磁鐵后，磁珠釋放，開放所述外部通道螺槽(圖 ^(b))。一旦外部通道螺槽開放，連續(xù)相可流動(dòng)，由于民與R1相比是阻力更低的途徑，樣品堵塞物移動(dòng)進(jìn)入外部通道螺槽(圖^(c))。一旦進(jìn)入外部通道螺槽，樣品堵塞物在進(jìn)一步注入連續(xù)相后向下游移動(dòng)以供進(jìn)一步分析(圖^(d))。圖中顯示采用固定磁鐵，雖然也可采用電磁體，可在R1和&之間調(diào)節(jié)阻力以從隔室逐滴移出樣品。采用電磁體還會(huì)使隔室可重新密封，可實(shí)施簡單閥控制，其可用來沖洗和補(bǔ)充芯片供進(jìn)一步使用。還可采用其它直接或間接機(jī)械變形方案以實(shí)現(xiàn)閥控制，如采用小機(jī)械點(diǎn)(如來自盲文顯示器)以使基材變形并由此形成可處理的閥控制。
采用光學(xué)力效應(yīng)的單獨(dú)可處理性和樣品移出 除加熱效應(yīng)以外，可采用直接或間接光學(xué)力和/或輻射壓力，通過由光束與樣品之間的相互作用產(chǎn)生的吸引或排斥力從隔室單獨(dú)移出分散樣品。這樣的一個(gè)實(shí)施方法如圖30所示。所述激光用來在樣品上施加力，依靠光學(xué)輻射力扭曲界面和/或移動(dòng)界面(圖 30 (b, c))。采用該吸引/或排斥力(取決于介質(zhì)的折射率和所用光束的形狀和大小)，所選樣品可從隔室釋放并可沿螺槽向下自由流動(dòng)(圖30(c，d))。除流體以外，可采用通過施加力以在主螺槽中傳輸樣品體積的其它方法，所述力如輻射壓力、電場衍生力、表面張力衍生力、熱梯度衍生力、超聲或磁力。
在某些實(shí)施方式中，通過光學(xué)力從流體容納室釋放流體包。作為例子，可采用直接或間接光學(xué)力或輻射壓力，通過激光束與流體包的相互作用產(chǎn)生的吸引或排斥力從流體容納室移出單獨(dú)流體包。圖30A顯示該方法的實(shí)施。激光用來在流體包3001上施加光學(xué)輻射力3011，扭曲界面3012和/或移動(dòng)所述界面(圖30A(b，c))。采用該吸引/或排斥力(取決于周圍流體相對于流體包的折射率和所用激光束的形狀和大小)，所選流體包可從流體容納室釋放(圖30A(c，d))。
對隔室采用定向壓力的單獨(dú)可處理性和樣品移出 在某些實(shí)施方式中，通過壓縮從流體容納室釋放流體包。該方法的示意圖可參見圖31A。作為例子，流體格可由彈性體材料制成，使應(yīng)用壓縮力(例如壓力)3111后，流體容納室收縮或塌陷，逐出其中的流體包3112。致動(dòng)器陣列可位于流體格之上或之下，并且這些致動(dòng)器可編入獨(dú)立的程序以在流體容納室上施加壓縮力。例如，可采用單獨(dú)可編程的機(jī)械點(diǎn)陣列如來自盲文顯示器的陣列達(dá)到本文所述流體包的釋放方法。
通過對隔室采用外部施加的直接壓力(之上、之下或在平面內(nèi))，應(yīng)可能實(shí)現(xiàn)使隔室臨時(shí)塌陷，有效逐出單獨(dú)樣品，將成分?jǐn)D出進(jìn)入主不混溶流體螺槽。該技術(shù)的示意圖可參見圖31。如果致動(dòng)器陣列與隔室對齊，該過程還允許大量釋放。例如，可采用單獨(dú)可編程的機(jī)械點(diǎn)陣列如來自盲文顯示器的陣列達(dá)到本文所述樣品體積逐出的方法。
通過穿透隔室頂部的直接注射器移出提取樣品 通過選擇可易于被具有小針尖直徑的小針穿透的基材，可完成樣品體積分散后陣列的微注射器提取，并將其傳輸?shù)酵獠績x器供進(jìn)一步分析。一種可能方案的示意圖可參見圖32，其中將針定位，在鑒定或分析之后提取隔室體積。通過現(xiàn)代機(jī)器視野和各隔室旁識(shí)別標(biāo)記的協(xié)助，可對所述針定位，采用可編程和自動(dòng)化的致動(dòng)器提取樣品。
在某些實(shí)施方式中，可通過破壞壁從流體容納室釋放流體包。如圖32A所示，流體格可由軟材料制成，使可通過穿透容納室的頂部或底部從流體容納室釋放流體包。在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過用小針3212進(jìn)行穿透來從流體容納室釋放流體包3211。通過現(xiàn)代機(jī)器視野、定位設(shè)備和各流體容納室旁識(shí)別標(biāo)記的協(xié)助，可對所述針進(jìn)行具有高度精確性的定位，可采用可編程和自動(dòng)化的致動(dòng)器提取流體包。
采用電生液滴提取樣品 已通過對不混溶相界限施加電脈沖對液滴形成過程進(jìn)行了說明。采用該方法，可從隔室內(nèi)包含的樣品內(nèi)進(jìn)行液滴電生，分隔仍位于隔室內(nèi)的樣品體積。示例性的實(shí)施方法如圖34所示，其中所述樣品被分隔為陣列(圖34(a))，在對與樣品相鄰的電極施加高電壓后，開始形成泰勒錐(圖34(b))。該高電壓供給的脈沖能實(shí)現(xiàn)從樣品孔進(jìn)行受控液滴電生， 可使其向下游流動(dòng)以供進(jìn)一步分析(圖34(c))。
在某些實(shí)施方式中，通過施加電場從流體容納室釋放流體包。作為例子(圖34A)， 可通過用高電壓電脈沖破壞流體界面從流體容納室釋放流體包。流體包可與電極3401接觸，而周圍流體可與另一個(gè)電極3403接觸。如圖34A(a，b)所示，在兩個(gè)電極之間施加電勢差后，在流體包/不混溶連續(xù)流體界面形成錐形逐出物(泰勒錐)3412，小液滴3423可與流體包分隔。施加電勢脈沖可提供受控從流體包分隔出的液滴，其可向下游流動(dòng)以供進(jìn)一步分析(圖34A(c))。
后隔室提取和進(jìn)一步操作 _仿丨丨14擺艦鍾帛-腿肺ι少后白棚本·析 一旦所述樣品從樣品隔室陣列移出，如果向主螺槽下游流動(dòng)，主螺槽下游存在多種處理方法。一種方法是將流過螺槽的堵塞物轉(zhuǎn)變?yōu)橐旱?。一旦所述堵塞物被轉(zhuǎn)移到較大流體區(qū)，其界面會(huì)松弛，由此形成液滴并能實(shí)施傳統(tǒng)的液滴操作方案，包括但不限于，分類(光學(xué)、流體動(dòng)力學(xué)、電動(dòng)學(xué))、融合(遞送或被遞送試劑)、分裂、混合、停放(docking)、 儲(chǔ)存、冷凍、加熱和用于整合到分隔螺槽中的界面融合(例如毛細(xì)管電泳或毛細(xì)管凝膠電泳)。
在某些實(shí)施方式中，在從流體容納室釋放流體包之后，對釋放的流體包進(jìn)行進(jìn)一步操作。作為例子，可對釋放的流體包進(jìn)行分類(采用光學(xué)、流體動(dòng)力學(xué)或電動(dòng)學(xué)方法)、與另一個(gè)流體包融合以進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)、分裂為較小流體包、混合、停放、冷凍、加熱或與另一流體融合用于整合其它化學(xué)分離技術(shù)(例如，毛細(xì)管電泳或毛細(xì)管凝膠電泳)。圖33A顯示可能方案的取樣，其中流體包一旦釋放就可對其進(jìn)行操作可由圖33A(c)中的側(cè)向螺槽3325 和3322和圖33A(d)中的3331和3334注射流體作為鞘流(以控制流體包軌道)、加速流 (以控制流體包速度或間隔)或作為剪切流以從流體包產(chǎn)生液滴3342(圖33A(d))?？刹捎貌僮麽尫帕黧w包的其它方案。
也可對所述流體作為一個(gè)整體作進(jìn)一步改動(dòng)，例如，以便以半連續(xù)方式進(jìn)行進(jìn)一步熱循環(huán)用于包括PCR的應(yīng)用。
在某些實(shí)施方式中，在流體包從流體容納室釋放之后，所述流體包經(jīng)歷化學(xué)反應(yīng)。 作為例子，包含遺傳材料的釋放的流體包可在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中經(jīng)歷一系列熱循環(huán)以擴(kuò)增所述遺傳材料。
圖33顯示兩種常用的堵塞物到液滴的轉(zhuǎn)移方案。一旦所述堵塞物轉(zhuǎn)移到連續(xù)/ 不混溶相流體螺槽的末端，任選引入加速流或鞘流(在圖33(c)中顯示為在主螺槽之上和之下流入)以在液滴進(jìn)入較大流體螺槽時(shí)分隔所述液滴。兩個(gè)處理步驟的示意圖可參見圖 33(d)，其中左圖顯示來自單個(gè)隔室形成一個(gè)液滴的一個(gè)堵塞物。右圖顯示通過采用鞘流將所述堵塞物分裂為多個(gè)液滴進(jìn)行分隔的來自單個(gè)隔室的樣品體積。
除以上操作以外，還可聚合水相-不混溶相界限，使樣品體積包含于界面聚合的聚合物的外殼內(nèi)。
在某些實(shí)施方式中，在流體包從流體容納室釋放之后，所述流體包可發(fā)生聚合以形成包封體積。作為例子，可將所述兩種連續(xù)流體之間的相界限交聯(lián)到鄰近的膜中以形成固體界限保護(hù)流體包成分。在另一個(gè)實(shí)施例中，可將整個(gè)流體包交聯(lián)到凝膠中。在一個(gè)實(shí)施方式中，可將流體包交聯(lián)到凝膠中而不使其從流體容納室釋放。
應(yīng)用 實(shí)施例15 流體容納室中流體包的分析 一旦樣品體積被分散，根據(jù)本發(fā)明所述的靈活性方法和裝置的實(shí)施方式對多個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用具有多用途性，包括但不限于PCR、數(shù)字PCR、實(shí)時(shí)PCR、等溫PCR、診斷學(xué)和預(yù)后學(xué)的生物鑒定、癌癥診斷或預(yù)后、疾病診斷或預(yù)后、遺傳篩選、基因分型、確定拷貝數(shù)量變化、 DNA甲基化分析、高流量篩選、單分子和單細(xì)胞反應(yīng)或鑒定、單細(xì)胞基因表達(dá)特征分析、單細(xì)胞器研究、單分子和酶動(dòng)力學(xué)、單細(xì)胞蛋白質(zhì)組和“組”研究、結(jié)晶研究和統(tǒng)計(jì)學(xué)過程、蛋白質(zhì)結(jié)晶、藥物篩選、環(huán)境測試、有機(jī)和無機(jī)分子的合成、納米顆粒和膠囊的合成以及與生物醫(yī)學(xué)鑒定和測量的多種分析檢測技術(shù)進(jìn)行結(jié)合。最小流體互相連接，簡單流動(dòng)幾何結(jié)構(gòu)使所述裝置易于使用和實(shí)施，可優(yōu)化用來形成所述裝置的材料用于分析或感興趣的讀出方法。
在某些實(shí)施方式中，流體容納室可用來進(jìn)行生化分析，包括但不限于數(shù)字PCR、 實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)、NASBA、單細(xì)胞成像、單細(xì)胞識(shí)別或計(jì)數(shù)、診斷學(xué)和預(yù)后學(xué)的生物鑒定、高流量篩選、單分子或單細(xì)胞反應(yīng)或鑒定、單分子和酶動(dòng)力學(xué)、單細(xì)胞蛋白質(zhì)組或其它“組”研究、蛋白質(zhì)或其它物質(zhì)的結(jié)晶、藥物篩選、環(huán)境測試、統(tǒng)計(jì)分析、有機(jī)和無機(jī)分子的合成以及納米顆粒和納米膠囊的合成。
同樣地，所述方法和裝置的一個(gè)具體實(shí)用性能是在分析之前將樣品分為多個(gè)獨(dú)特等份的能力。一旦與分離或分析技術(shù)結(jié)合，該方法能以100%或接近100%的效率等分小體積樣品，由此減少樣品損失并具有多個(gè)樣品等份用于平行或重復(fù)分析或同時(shí)進(jìn)行二者。
在某些實(shí)施方式中，從流體容納室釋放的流體包可與其它分析檢測技術(shù)結(jié)合用于生物醫(yī)學(xué)鑒定和測量。
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和遺傳分析 _仿丨丨16甚艦鍾^Φ白棚本働傭飾俯 可很容易地對裝置進(jìn)行熱循環(huán)以在分散樣品上進(jìn)行PCR。也可在熱循環(huán)中對所述分散樣品進(jìn)行成像，以進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。如果樣品中的模板量經(jīng)稀釋使無樣品隔室包含多于一個(gè)模板，則所述分散裝置可用來進(jìn)行數(shù)字PCR。可采用該技術(shù)形成分散樣品體積的大陣列， 所述裝置非常適合數(shù)字PCR。圖35顯示采用本發(fā)明進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR的示意圖。圖35(b)中顯示來自經(jīng)歷了 40個(gè)熱循環(huán)的分散實(shí)時(shí)PCR樣品的熒光圖像。可實(shí)施多種其它方案將本分散裝置與數(shù)字PCR結(jié)合，包括采用整合的電阻加熱器或熱電裝置進(jìn)行芯片上PCR。也可采用熱循環(huán)的其它芯片外方案，如加熱燈或其它輻射源以加熱樣品體積用于PCR應(yīng)用。
在某些實(shí)施方式中，駐留在流體容納室中的流體包可包含多個(gè)拷貝的遺傳序列 (DNA或RNA)。在一個(gè)實(shí)施方式中，駐留在流體容納室中的流體包可包含不多于一個(gè)DNA 分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，駐留在流體格的流體容納室中的至少一個(gè)流體包可不包含任何 DNA。
在一個(gè)實(shí)施例中，包含駐留在流體容納室中的流體包的流體格可進(jìn)行熱循環(huán)以進(jìn)行PCR。可在熱循環(huán)過程中對各單獨(dú)流體包進(jìn)行成像以進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。如果樣品中的模板量經(jīng)稀釋使無流體包包含多于一個(gè)模板，則該流體格可用來進(jìn)行數(shù)字PCR(或數(shù)字實(shí)時(shí)PCR)。 流體格可迅速產(chǎn)生大量流體包，所述流體包各包含不多于一個(gè)拷貝模板且根據(jù)其駐留的流體容納室各具有獨(dú)特的可識(shí)別性。圖35A顯示本發(fā)明用于進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR(或任何形式PCR) 的示意圖。圖35A(b)顯示來自包含經(jīng)歷了 40個(gè)熱循環(huán)的實(shí)時(shí)PCR試劑的流體包的熒光圖像。
在某些實(shí)施方式中，整合加熱器的流體容納室可用來進(jìn)行數(shù)字PCR。整合的加熱器可包括電阻加熱器、熱電裝置、金屬墊或基于二極管的輻射源。
在某些實(shí)施方式中，流體容納室可與加熱器接觸以進(jìn)行數(shù)字PCR。接觸的加熱器可包括加熱燈、傳導(dǎo)加熱器或輻射源。
在某些實(shí)施方式中，流體格可通過機(jī)械結(jié)構(gòu)與DNA發(fā)動(dòng)機(jī)熱循環(huán)儀連接。圖38顯示這樣的用來作為通用界面以將流體格與市售DNA發(fā)動(dòng)機(jī)熱循環(huán)儀連接的機(jī)械結(jié)構(gòu)的各種視圖。在圖38中，該機(jī)械結(jié)構(gòu)以平面視圖(3801)、反面視圖(3802)、末端視圖(3803)、傾斜視圖(3804)和側(cè)向剖面圖(3805)顯示。圖39顯示這樣的機(jī)械結(jié)構(gòu)的各組件所述結(jié)構(gòu)可由在一側(cè)的具有銅指3908的熱導(dǎo)性銅頂板3904、在另一側(cè)的支持流體格3902的芯片持夾器3903和3907以及固定所述組件的止動(dòng)螺栓3901和3905組成。通過與流體端口 3906 連接的管道將流體遞送到流體格。
圖40顯示引入閥和0環(huán)襯墊的替代機(jī)械結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。在圖40中，所述替代機(jī)械結(jié)構(gòu)以平面視圖(4001)、反面視圖(4002)、末端視圖(4003)、傾斜視圖^)04)和側(cè)面視圖 (4005)顯示。圖41顯示所述替代機(jī)械結(jié)構(gòu)的各種組件，其包括在一側(cè)的具有銅指4101的熱導(dǎo)性銅頂板4112、在另一側(cè)的支持凹進(jìn)槽4110中流體格4103的芯片持夾器4106和4107 以及固定所述組件的止動(dòng)螺栓4102和4109組成。包括閥連接4104和0環(huán)襯墊4105、4108 和4111以提供穩(wěn)固的流體密封和控制。
雖然數(shù)字PCR非常適合用所述裝置和方法進(jìn)行，但也可采用其它類型的PCR，包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)PCR、實(shí)時(shí)PCR、用于分析RNA和單細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄PCR以及各種類型的等溫 PCR。
在某些實(shí)施方式中，流體容納室可用來進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。作為例子，流體格可經(jīng)歷熱循環(huán)以在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增遺傳材料。可進(jìn)行各種形式的PCR，包括但不限于數(shù)字 PCR、分散PCR、標(biāo)準(zhǔn)PCR、實(shí)時(shí)PCR、用于分析RNA和單細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄PCR以及各種類型的等溫PCR，包括但不限于NASBA。
在標(biāo)準(zhǔn)PCR操作下，包含分散樣品的芯片進(jìn)行熱循環(huán)以擴(kuò)增感興趣的DNA序列。通常通過一個(gè)(等溫)、兩個(gè)或三個(gè)溫度區(qū)循環(huán)來擴(kuò)增包含預(yù)定數(shù)量靶DNA的各樣品體積。
在標(biāo)準(zhǔn)PCR操作下，包括流體包的流體格進(jìn)行熱循環(huán)以擴(kuò)增感興趣的遺傳序列。 可通過一個(gè)(等溫)、兩個(gè)或三個(gè)溫度循環(huán)操作擴(kuò)增包含預(yù)定數(shù)量靶遺傳序列的各流體包。
在實(shí)時(shí)PCR操作下，采用對陣列進(jìn)行大面積熒光成像或掃描熒光共聚焦成像持續(xù)監(jiān)測芯片。該成像每個(gè)循環(huán)至少進(jìn)行一次，能形成各樣品體積的閾值循環(huán)的外推和指數(shù)增長圖。通過獨(dú)立分析所有的分散體積，可記錄并定量分析樣品的不均勻性。
在實(shí)時(shí)PCR操作下，可采用對流體格進(jìn)行大面積熒光成像或共聚焦熒光掃描成像持續(xù)監(jiān)測流體格。該成像每個(gè)循環(huán)至少進(jìn)行一次，能形成各流體包的指數(shù)增長熒光圖和閾值循環(huán)的外推。通過獨(dú)立分析所有的流體包，可記錄并定量分析從連續(xù)流體形成的流體包的不均勻性。
可采用小隔室體積和/或稀釋樣品來達(dá)到在芯片中實(shí)施數(shù)字PCR。各隔室中具有少于一個(gè)拷貝的靶DNA能引起表達(dá)和待檢測序列的變化。也可通過將樣品中的全細(xì)胞和/ 或亞細(xì)胞組分轉(zhuǎn)移到分散隔室來在芯片中進(jìn)行數(shù)字PCR。用本裝置可進(jìn)行多種遺傳分析，如遺傳篩選、基因分型、確定拷貝數(shù)量變化、DNA甲基化分析，這些分析是疾病診斷或預(yù)后，特別是癌癥診斷或預(yù)后中的有用鑒定。
可采用小流體容納室和/或稀釋樣品在流體格中實(shí)施數(shù)字PCR。各容納室中具有少于一個(gè)拷貝的靶DNA能引起表達(dá)和待檢測序列的變化。也可通過將包括但不限于樣品中生物液體(例如，血液、血漿、腦脊髓液、淋巴液、唾液、尿液等)、全細(xì)胞、細(xì)胞部分和/或亞細(xì)胞組分的材料轉(zhuǎn)移到流體容納室來在流體格中進(jìn)行數(shù)字PCR。
在PCR的實(shí)施中，特別是在數(shù)字PCR中，在擴(kuò)增之后直接對產(chǎn)生的DNA測序正在成為感興趣的做法。本分隔芯片可包含大陣列樣品，其中可采用熒光探針以協(xié)助識(shí)別感興趣的靶特異性樣品隔室用于測序。其還能有序去除所有隔室。
由于本裝置簡單且易于作出設(shè)計(jì)改動(dòng)，可直接向所述裝置引入各種分析技術(shù)。這樣的一個(gè)例子可在樣品隔室下游包括凝膠電泳分隔螺槽。然后可分別、依次或平行移出所述樣品，并使其以液滴/堵塞物形式流入分隔螺槽。然后可將其與界面融合，將所述樣品有效注射到分隔螺槽中。由此可將凝膠電泳分析用于對各樣品體積/隔室中的擴(kuò)增DNA進(jìn)行測序。PCR裝置的一個(gè)例子可參見圖34，顯示結(jié)合的簡易性。圖34(b)顯示在經(jīng)歷40個(gè)熱循環(huán)之后的示例性PCR樣品隔室的圖像。
在某些實(shí)施方式中，流體容納室可用來進(jìn)行DNA甲基化分析。數(shù)字PCR可用于多種診斷、預(yù)后、生物醫(yī)學(xué)和生物鑒定。例如，所述裝置和方法可用來對來自患者血樣的甲基化DNA進(jìn)行數(shù)字PCR，因?yàn)镈NA的外遺傳改變?nèi)鏒NA超甲基化和染色質(zhì)修飾已在人癌癥中顯示和建立。在該應(yīng)用中，本裝置和方法可用來進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化DNA的PCR擴(kuò)增用于DNA 甲基化分析，或采用數(shù)字格式的傳統(tǒng)和市售的鑒定甲基化熒光(MethylLight)鑒定，因?yàn)楸狙b置和方法可有效地將樣品體積分散為大陣列。雖然這些鑒定最好是以數(shù)字格式進(jìn)行， 但本裝置和方法可以非數(shù)字格式達(dá)到同樣良好的效果，原始樣品體積分隔為多個(gè)平行分散樣品體積仍非常有利。
實(shí)施例17 流體容納室中流體包內(nèi)的結(jié)晶 在某些實(shí)施方式中，駐留在流體容納室中的流體包可用于結(jié)晶。在一些實(shí)施方式中，駐留在流體容納室中的流體包可用來進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶。在某些實(shí)施方式中，駐留在流體容納室中的流體包可用來進(jìn)行小分子結(jié)晶。
可在駐留在流體容納室中的流體包中進(jìn)行的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)包括但不限于多晶型篩選、 溶劑合物篩選、鹽篩選、共結(jié)晶、晶體染色、蛋白質(zhì)結(jié)晶、手性拆分、均相結(jié)晶、多相結(jié)晶和用 “特制”添加劑結(jié)晶。
在某些實(shí)施方式中，駐留在滲透性流體格中的流體容納室中的流體包可用來結(jié)晶。用感興趣的分析物飽和的從連續(xù)流體形成的流體包可用來產(chǎn)生滲透性流體格的流體包中的小有機(jī)分子的多晶型。滲透性流體格可由例如空氣或溶劑可滲透材料制成，所述材料包括但不限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)，使流體包的所選組分可通過流體格材料蒸發(fā)或被流體格材料吸收(或溶解)。這些所選組分可包括但不限于溶劑。經(jīng)流體格的溶劑蒸發(fā)或吸收過程可增強(qiáng)結(jié)晶過程，允許對生長的晶體類型進(jìn)行精細(xì)控制。圖36顯示在流體格中的流體容納室中晶體的圖像，所述流體格由玻璃和PDMS制成，其在將由溶于50%水性乙醇的Ix KT2M 2，5_ 二羥基苯甲酸Q，5-DHB)和Ix 1(Γ5Μ甲基紅組成的流體包置于室溫下2_3天時(shí)形成。另一連續(xù)流體是含0. 05%司盤80的輕質(zhì)礦物油。所有比例尺(圖36(a)、(b)和 (C))均為 100 μ m。
在某些實(shí)施方式中，各種尺寸的流體容納室均可用于結(jié)晶。在另一個(gè)實(shí)施方式中， 各種尺寸的流體容納室可同時(shí)用來在藥物開發(fā)中進(jìn)行多種結(jié)晶條件的平行篩選。尺寸可指大小、表面積或體積。圖36顯示用來生成不同晶體的5種尺寸的流體容納室。由于滲透性組分的蒸發(fā)/吸收速率隨流體容納室的尺寸發(fā)生變化，分析物濃度可發(fā)生變化并可引起一些其它混合物組分包括感興趣的分析物優(yōu)先結(jié)晶。結(jié)晶條件的變動(dòng)可形成多晶型現(xiàn)象，即固體材料以多于一種形式或晶體結(jié)構(gòu)存在的能力。多晶型和其它結(jié)晶形式的識(shí)別在制藥工業(yè)中極為重要，因?yàn)楸仨殞Ω鹘Y(jié)晶形式單獨(dú)進(jìn)行專利保護(hù)(包括其中有多于一種物質(zhì)存在于重復(fù)晶胞中的晶體，如溶劑合物或共晶)。因此必須在藥物開發(fā)階段識(shí)別盡可能多的結(jié)晶形式。此處，單個(gè)連續(xù)流體分隔為多個(gè)平行流體包，各流體包置于不同結(jié)晶條件下，這是非常有利的結(jié)晶篩選方法。此外，在僅合成小量潛在新藥時(shí)，小體積的流體包是感興趣的特征。
圖36顯示駐留在流體格中的流體容納室中的結(jié)晶多晶型的圖像。在圖36(圖b) 中，由3612和3613標(biāo)出的晶體界面角看來與之前在I型2，5_ 二羥基苯甲酸Q，5_DHB) 中觀察到的一致。在圖36 (圖c)中，由3623和36M標(biāo)出的界面角看來與之前在II型2， 5-DHB(與I型2，5-DHB不同的多晶型物)中觀察到的一致。此外，在圖36 (圖(b)和(c)) 中觀察到的甲基紅的顏色看來分別與之前在I型和II型2，5-DHB中觀察到的一致。流體容納室的體積在圖36(b)中比在圖36(c)中大。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，流體格可以可變速率冷卻或加熱以誘導(dǎo)結(jié)晶。在另一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)流體容納室可與另一個(gè)流體容納室具有不同的加熱或冷卻速率。通過改變所述加熱和/或冷卻速率，可在同一流體格內(nèi)同時(shí)篩選多種結(jié)晶條件。各單獨(dú)流體容納室的加熱或冷卻速率可預(yù)定或易于設(shè)定。加熱和冷卻裝置可包括但不限于電阻加熱器、熱電裝置、金屬墊、加熱燈、傳導(dǎo)加熱器或輻射源。加熱和/或冷卻裝置可受計(jì)算機(jī)控制并易于調(diào)整。
可對流體容納室中生長的晶體進(jìn)行分析的方法包括但不限于光顯微法、電子顯微法、采用偏振光的顯微法、偏振吸收光譜法、吸收光譜法、拉曼顯微光譜法、紅外顯微光譜法、X射線衍射法、熱分析法、固態(tài)NMR法、粒度分析法和熔點(diǎn)確定法。
實(shí)施例18 在流體容納室中的流體包內(nèi)講行細(xì)胞分析 在某些實(shí)施方式中，流體容納室中的流體包可包含生物顆?；蚍治鑫?。在一些實(shí)施方式中，流體容納室中的流體包可包含生物細(xì)胞。
根據(jù)某些實(shí)施方式，流體容納室中的流體包可包含稀有細(xì)胞。稀有細(xì)胞可以有核或無核。稀有細(xì)胞包括但不限于以下細(xì)胞表達(dá)惡性表型的細(xì)胞、胎兒細(xì)胞如母體外周血中的胎兒細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞如從腫瘤進(jìn)入血液或其它體液或骨髓的腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞如HIV感染細(xì)胞、用感興趣基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及存在于患自身免疫或自體反應(yīng)疾病的對象外周血中的T細(xì)胞或B細(xì)胞的異常亞型。
如果細(xì)胞濃度具有以下特征則將其視作稀有細(xì)胞(1)占流體樣品中總細(xì)胞數(shù)量少于10% ； (2)占流體樣品中總細(xì)胞數(shù)量少于；或(3)每毫升流體樣品中的細(xì)胞數(shù)量少于1百萬。
在一個(gè)實(shí)施方式中，流體容納室可用來進(jìn)行生物顆粒的分析。在另一個(gè)實(shí)施方式中，流體容納室可用來進(jìn)行稀有細(xì)胞的分析。例如，圖37(a)是在駐留在流體容納室中的流體包3703(和3704)中形成的具有稀有濃度的細(xì)胞3701 (和3702)的圖像。有序流體容納室內(nèi)部的流體包允許對這些分隔的稀有細(xì)胞進(jìn)行簡單的視覺識(shí)別、計(jì)數(shù)和生化分析。該情況中含分析物的流體由95%生長培養(yǎng)基和5% B細(xì)胞組成(以體積計(jì))。
圖37(b)是形成駐留在流體容納室中的流體包3711的由白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板和血漿組成的未稀釋人血的圖像。因此，可進(jìn)一步分析有序流體容納室內(nèi)部的流體包的生化成分，其可與人疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)或可提供診斷或預(yù)后信息。
本發(fā)明所述實(shí)施方式可用于生物和疾病診斷中的各種應(yīng)用，包括捕獲來自體液的癌癥細(xì)胞或癌癥干細(xì)胞用于癌癥預(yù)后、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞亞群、寄生蟲如鞭毛蟲或隱孢子蟲用于水質(zhì)監(jiān)測、瘧疾感染的紅細(xì)胞用于瘧疾診斷、淋巴細(xì)胞和白細(xì)胞用于HIV監(jiān)測、 母體血液中的胎兒細(xì)胞用于疾病篩選、干細(xì)胞用于治療、朊病毒感染的細(xì)胞用于朊病毒相關(guān)(例如瘋牛病)疾病篩選。
在一個(gè)實(shí)施例中，本對象物質(zhì)包括的流體格的制造材料包括但不限于聚合材料(聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯、聚酯(PET)、熱固性聚酯 (TPE)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、聚對二甲苯、聚氯乙烯、氟乙基丙烯、熱塑聚碳酸酯、 聚苯乙烯、環(huán)烯烴共聚物、聚氨酯、摻混聚丙烯酸酯的聚氨酯、聚酯碳酸酯、聚丙烯、聚丁烯、 聚丙烯酸酯、聚己內(nèi)酯、聚酮、聚酞酰胺、醋酸纖維素、聚丙烯腈、聚砜、環(huán)氧聚合物、熱塑性材料、含氟聚合物、聚偏氟乙烯、聚酰胺、聚酰亞胺)、無機(jī)材料(玻璃、石英、硅、GaAs、氮化硅)、熔融二氧化硅、陶瓷、玻璃(有機(jī))、金屬和/或其它材料及其組合。
此外，壁材料可由以下制成羊毛、金屬(例如不銹鋼或蒙耐合金(Monel))、玻璃、 紙或合成(例如，尼龍、聚丙烯、聚碳酸酯、聚對二甲苯和各種聚酯)、燒結(jié)不銹鋼和其它金屬、多孔無極材料如氧化鋁、二氧化硅或碳的多孔膜、織造或非織造纖維(如布或網(wǎng)狀物)。
可通過例如以下誘導(dǎo)流體動(dòng)力學(xué)流體壓力的方法和裝置遞送連續(xù)流體流，所述方法和裝置包括但不限于基于機(jī)械原理(例如，外部注射器泵、氣動(dòng)膜泵、振動(dòng)膜泵、真空裝置、離心力和毛細(xì)管行為)、電學(xué)或磁學(xué)原理(例如，電滲流、電動(dòng)泵、壓電/超聲泵、磁流體堵塞物、電流體力學(xué)泵和磁流體力學(xué)泵)、熱動(dòng)力學(xué)原理(例如，氣泡產(chǎn)生/相變誘導(dǎo)體積膨脹)、表面潤濕原理(例如，電潤濕、化學(xué)、熱合放射誘導(dǎo)表面張力梯度)而操作的方法和裝置。
產(chǎn)生連續(xù)流體驅(qū)動(dòng)力的其它方法可通過以下提供流體動(dòng)力學(xué)壓力、重力供給、表面張力(如毛細(xì)管行為)、靜電力(電動(dòng)流)、離心流(置于光盤上并旋轉(zhuǎn)的基材)、磁力(振蕩離子引起流)、磁流體動(dòng)力學(xué)力和真空或壓力差，以及其它連續(xù)流體驅(qū)動(dòng)力產(chǎn)生方法。
權(quán)利要求
1.一種方法，其包括提供包括以下組件的流體格具有流體軸的流體螺槽，和與所述流體螺槽存在流體交換并與所述流體軸存在偏移的多個(gè)流體容納室；使第一連續(xù)液體流過所述流體格以在所述多個(gè)流體容納室內(nèi)提供第一液體；和使第二連續(xù)液體流過所述流體格，所述第二連續(xù)液體與第一液體不混溶，從而所述第二液體將第一液體從流體螺槽移出，同時(shí)允許第一液體保留在所述多個(gè)流體容納室中。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一液體包括水性溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，使所述第二液體快速流動(dòng)以將一些第一液體從多個(gè)流體容納室中的至少一個(gè)移出。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在使第一連續(xù)液體流過之前，使起始連續(xù)液體流過流體格，其中所述起始液體與第一液體不混溶，從而使第一液體流過將至少一部分起始液體從流體螺槽和多個(gè)流體容納室中移出。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一液體包括水性溶液。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，使所述第一液體快速流動(dòng)以將少于全部的第三液體從多個(gè)流體容納室中的至少一個(gè)移出。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一液體包含分析物，所述方法還包括在多個(gè)流體容納室中的至少一個(gè)內(nèi)對第一液體進(jìn)行分析。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述分析物包括生物材料。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物材料選自細(xì)胞、病毒、朊病毒、核酸、蛋白質(zhì)、遺傳材料、遺傳材料的表達(dá)產(chǎn)物、結(jié)晶分子或顆粒。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，進(jìn)行所述分析包括進(jìn)行生化分析。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一流體包含多個(gè)核酸鏈和一定體積的流體螺槽，所述多個(gè)流體容納室的構(gòu)造使一個(gè)核酸鏈或無核酸鏈包含于多個(gè)流體容納室中的各個(gè)容納室，所述方法還包括在多個(gè)流體螺槽內(nèi)進(jìn)行數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
12.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述分析物在流體容納室中經(jīng)歷結(jié)晶。
13.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述分析物包含至少一種選自以下稀有細(xì)胞表達(dá)惡性表型的細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞、用感興趣的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、或存在于患自身免疫或自體反應(yīng)疾病的對象外周血中的T細(xì)胞或B細(xì)胞的異常亞型。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多個(gè)流體容納室中至少一個(gè)的形狀不同于球形。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述流體容納室中至少一個(gè)的橫截面是T 形、L形、三角形、矩形、圓形、橢圓形、多邊形或正方形。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多個(gè)流體容納室中至少一個(gè)在流體軸之上的垂直方向位移以保留浮力物質(zhì)。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多個(gè)流體容納室中至少一個(gè)在流體軸之下的垂直方向位移以保留稠密物質(zhì)。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對所述流體容納室中至少一個(gè)的表面進(jìn)行改性以影響其與第一液體和/或第二液體的相互作用。
19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括通過輔助螺槽向所述多個(gè)流體容納室中至少一個(gè)遞送材料或能量。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述多個(gè)流體容納室沿流體螺槽平行、串聯(lián)或同時(shí)平行并串聯(lián)排列。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括使所述多個(gè)流體容納室其中一個(gè)的內(nèi)容物與化學(xué)物質(zhì)混合。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述混合由所述多個(gè)流體容納室其中一個(gè)與包含所述化學(xué)物質(zhì)的隔室之間的壁破裂引起。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述隔室位于由流體螺槽限定的平面之外。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法還包括從所述多個(gè)流體容納室中至少一個(gè)移出包含第一液體的內(nèi)容物。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)容物通過通道螺槽移出。
26.如權(quán)利要求M所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)容物通過使另一連續(xù)液體流過流體格而移出，所述另一連續(xù)液體與所述內(nèi)容物不混溶。
27.如權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于，所述另一連續(xù)液體的粘度不同于所述內(nèi)容物的粘度。
28.如權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于，所述另一連續(xù)液體包含表面活性劑。
29.如權(quán)利要求M所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)容物通過對流體容納室中至少一個(gè)的內(nèi)容物施加力而移出。
30.如權(quán)利要求四所述的方法，其特征在于，所述力選自熱能、真空、氣動(dòng)壓力、聲波壓力、超聲脈沖、輻射壓力、電磁場、電潤濕、光誘導(dǎo)的表面潤濕、電毛細(xì)管現(xiàn)象、表面或界面張力、熱梯度衍生力、靜電相互作用、光學(xué)力或磁力中的至少一個(gè)。
31.如權(quán)利要求M所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)容物采用閥移出。
32.如權(quán)利要求M所述的方法，其特征在于，所述內(nèi)容物通過用針穿透流體格而移出。
33.如權(quán)利要求M所述的方法，其特征在于，所述方法還包括對從多個(gè)流體容納室其中一個(gè)移出的內(nèi)容物進(jìn)行進(jìn)一步操作。
34.一種設(shè)備，其包括具有流體軸的流體螺槽，所述流體螺槽與第一連續(xù)液體的來源存在選擇性流體交換， 并與不混溶于第一液體的第二連續(xù)液體的來源存在選擇性流體交換；和與所述流體螺槽存在流體交換并與所述流體軸存在偏移的多個(gè)流體容納室。
35.如權(quán)利要求34所述的設(shè)備，其特征在于，所述多個(gè)流體容納室中至少一個(gè)的形狀不同于球形。
36.如權(quán)利要求35所述的設(shè)備，其特征在于，所述流體容納室中至少一個(gè)的橫截面是T 形、L形、三角形、矩形或正方形。
37.如權(quán)利要求34所述的設(shè)備，其特征在于，所述多個(gè)流體容納室中至少一個(gè)在流體軸之上的垂直方向位移以保留第一液體內(nèi)的浮力物質(zhì)。
38.如權(quán)利要求34所述的設(shè)備，其特征在于，所述多個(gè)流體容納室中至少一個(gè)在流體軸之下的垂直方向位移以保留第一液體內(nèi)的稠密物質(zhì)。
39.如權(quán)利要求34所述的設(shè)備，其特征在于，對所述流體容納室中至少一個(gè)的表面進(jìn)行改性以影響其與第一液體和/或第二液體的相互作用。
40.如權(quán)利要求34所述的設(shè)備，其特征在于，所述多個(gè)流體容納室沿流體螺槽平行、串聯(lián)或同時(shí)平行并串聯(lián)排列。
41.如權(quán)利要求34所述的設(shè)備，其特征在于，所述設(shè)備還包括與多個(gè)流體容納室中至少一個(gè)存在流體交換的第二螺槽。
42.如權(quán)利要求34所述的設(shè)備，其特征在于，所述設(shè)備還包括構(gòu)造為將材料或能量遞送到接近多個(gè)流體容納室中至少一個(gè)的第二螺槽。
43.一種進(jìn)行數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法，所述方法包括提供包含以下組件的流體格具有流體軸的流體螺槽，和與所述流體螺槽存在流體交換并與所述流體軸存在偏移的多個(gè)流體容納室；使第一液體流過所述流體格，其中所述第一連續(xù)液體包含多個(gè)核酸鏈，使所述多個(gè)流體容納室中各容納室內(nèi)僅提供一個(gè)核酸鏈或無核酸鏈；使第二連續(xù)液體流過所述流體格，所述第二連續(xù)液體與第一液體不混溶，從而所述第二液體將第一液體從流體螺槽移出，同時(shí)允許第一液體保留在所述多個(gè)流體容納室中；在所述多個(gè)流體容納室內(nèi)對第一流體進(jìn)行多個(gè)熱循環(huán)；和檢測多個(gè)流體容納室內(nèi)的核酸鏈濃度。
全文摘要
本發(fā)明的實(shí)施方式涉及對樣品體積進(jìn)行簡單、穩(wěn)固和多用途分散和操作的方法和設(shè)備。流體裝置利用流體力之間的相互作用、界面張力、螺槽幾何形狀和形成的液滴和/或分散化體積的最終穩(wěn)定性分隔樣品。這些分隔的體積能使樣品分離并分隔為隨后可操作和分析的局部化陣列。分散化體積的分離連同所述裝置的固有便攜性使本發(fā)明具有用于多個(gè)領(lǐng)域的多種用途，包括但不限于PCR、數(shù)字PCR、診斷學(xué)和預(yù)后學(xué)的生物鑒定、癌癥診斷和預(yù)后、高流體積篩選、單分子和單細(xì)胞反應(yīng)或鑒定、結(jié)晶研究和其它統(tǒng)計(jì)學(xué)過程、蛋白質(zhì)結(jié)晶、藥物篩選、環(huán)境測試和與生物醫(yī)學(xué)鑒定和測量的多種分析檢測技術(shù)進(jìn)行結(jié)合。最小流體互相連接和簡單的流動(dòng)幾何結(jié)構(gòu)使所述裝置易于使用和實(shí)施，具有制造和操作的經(jīng)濟(jì)性，并在其運(yùn)轉(zhuǎn)中具有穩(wěn)固性。
文檔編號(hào)G01N33/48GK102187216SQ200980141619
公開日2011年9月14日 申請日期2009年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月15日
發(fā)明者D·T·趙, D·E·科恩, G·D·杰弗瑞斯 申請人:華盛頓大學(xué)