專利名稱：一種檢測(cè)嬰兒痙攣癥患兒對(duì)acth藥物敏感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及嬰兒痙攣癥患兒對(duì)ACTH藥物敏感性的檢測(cè)試劑盒，具體而言，涉及一 種能快速、有效的檢測(cè)出嬰兒痙攣癥患兒基因組MC2R啟動(dòng)子區(qū)是否含有純和TCCT單體型， 從而快速判斷患兒是否對(duì)ACTH藥物治療敏感的試劑盒。
背景技術(shù)：
癲癇是除中風(fēng)以外的第二位腦部的慢性疾病，是嬰兒期第一位腦部慢性疾病。嬰 兒痙攣癥(Infantile spasms, IS)又稱West綜合征，是嬰兒時(shí)期最常見的一種難治性癲 癇綜合征,其患病率較高,約為1/2000活產(chǎn)兒[Baram TZ, Mitchell WG, et al. Infantile Spasms Hypothe sis-Driven Therapy and Pilot HumanInfant Experiments UsingCorticotropin-Releasing Hormone Receptor Antagonists. DevNeurosci 1999 ； 21 :281-289. Lux AL, Osborne JP. A proposal for casedefinitions and outcome measures in studies of infantile spasmsand west syndrome consensus statement of the West DelphiGroup. Epilespia 2004 ；45 (11) :1416_1428]。本病通常在生后第 1 年內(nèi) 出現(xiàn)，多以3 8月齡發(fā)病，發(fā)病高峰年齡為6月，以痙攣成簇發(fā)作、高峰失律腦電圖和精神 發(fā)育遲滯三聯(lián)征為主要表現(xiàn)，預(yù)后較差，死亡率較高。大量的研究資料證實(shí)下丘腦_垂體_腎上腺(HPA)軸功能紊亂在嬰兒痙攣癥的 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。目前盡管ACTH已經(jīng)成為短期內(nèi)治療嬰兒痙攣癥的主導(dǎo)藥物， ACTH能成功地控制痙攣的發(fā)作和緩解高峰失律EEG表現(xiàn)，但到目前為止，有關(guān)ACTH治療 嬰兒痙攣的作用機(jī)制和耐藥機(jī)制尚不清楚。目前研究表明ACTH可通過以下兩種途徑下調(diào) 腦內(nèi)某些區(qū)域促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)的過度分泌和釋放，降低嬰兒痙攣患兒的 神經(jīng)元興奮性發(fā)揮臨床抗驚厥效應(yīng)(1)與MC2R結(jié)合，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)糖皮質(zhì)激素分泌， 使血漿的皮質(zhì)醇水平穩(wěn)定和持續(xù)升高；(2)通過直接刺激中樞杏仁體(ACe)的黑皮質(zhì)素2 受體(MC2R)發(fā)揮獨(dú)立于類固醇激素外的直接效應(yīng)。這兩種途徑均可通過長、短負(fù)反饋機(jī) 制最終抑制腦內(nèi)致驚厥劑CRH的合成和分泌，有效地控制痙攣發(fā)作和緩解高峰失律EEG表 現(xiàn)[Jaseja H.A plausible explanation for superiority ofadreno-cortico-trophic hormone (ACTH) over oral corticosteroids in management of infantile spasms(West syndrome). Med Hypotheses2006 ；67 :721_724· Brunson KL, Avishai-Eliner S，Baram TZ. ACTHtreatment of infantile spasms :mechanisms of its effects inmodulation of neuronal excitability. Int Rev Neurobiol2002 ；49 185-197. Baram TZ. Treatment of infantile spasms :theideal and the mundane. Epilepsia 2003;44:993-994·]。最新的癲癎藥物遺傳學(xué)研究結(jié)果表明，某些藥物受體基因常見突變，尤其是單核 苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNPs)的改變?cè)诤艽蟪潭壬吓c癲癎發(fā)生、 驚厥結(jié)果、抗癲癎藥物敏感性，抗癲癎藥物耐藥等密切相關(guān)。SNP是指在基因組上單個(gè)核苷 酸的變異，包括置換、顛換、缺失和插入。SNP在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，而且多是C轉(zhuǎn)換 為T，原因是CG中的C常為甲基化的，自發(fā)地脫氨后即成為胸腺嘧啶。一般而言，SNP是指
3變異頻率大于的單核苷酸變異。因此，SNP成為第三代遺傳標(biāo)志，人體許多表型差異、 對(duì)藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關(guān)。SNP將提供一個(gè)強(qiáng)有力的工具，用于高危 群體的發(fā)現(xiàn)、疾病相關(guān)基因的鑒定、藥物的設(shè)計(jì)和測(cè)試以及生物學(xué)的基礎(chǔ)研究等。SNP在基 因組中分布相當(dāng)廣泛，近來的研究表明在人類基因組中每300堿基對(duì)就出現(xiàn)一次。大量存 在的SNP位點(diǎn)，使人們有機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn)與各種疾病，包括腫瘤相關(guān)的基因組突變；從實(shí)驗(yàn)操作來 看，通過SNP發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因突變要比通過家系來得容易；有些SNP并不直接導(dǎo)致疾病 基因的表達(dá)，但由于它與某些疾病基因相鄰，而成為重要的標(biāo)記。[Chen JZ, Xie XD，Wang XX, Tao Μ, Shang YP, Guo XG. Single nucleotide polymorphisms of theSCN5A gene in Han Chinese and their relation with Brugada syndrome. Chin Med J(Engl)2004 ； 117 652-656]。在我們既往研究中，我們發(fā)現(xiàn)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)的SNPs，rsl893220，rs2186944 和-2T > C的基因型和等位基因頻率分布在嬰兒痙攣病人和對(duì)照組之間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義，隨后構(gòu)件的單體型頻率分析發(fā)現(xiàn)，常見的TCCT單體型與嬰兒痙攣癥患兒的ACTH藥物 反應(yīng)性高度相關(guān)，提示MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs的改變可能很大程度上參與了嬰兒痙攣癥 的發(fā)病機(jī)制和ACTH治療的耐藥反應(yīng)。這些研究結(jié)果可能為嬰兒痙攣癥病人的ACTH治療療 效提供一定的分子生物學(xué)方面預(yù)測(cè)。人類MC2R基因的表達(dá)主要通過cAMP信號(hào)途徑受配體 ACTH的正向調(diào)控，MC2R基因啟動(dòng)子活性基礎(chǔ)調(diào)控區(qū)和cAMP反應(yīng)元件(CREs)位點(diǎn)目前已 從功能上在 MC2R 基因上被鑒定[Naville D, Jaillard C, Barjhoux L, Durand P, Begeot M. Genomic structure and promotercharacterization of the human ACTH receptor gene. Biochem BiophysRes Commun 1997;230:7-12.]。MC2R 基因編碼區(qū)突變可導(dǎo)致 cAMP 反應(yīng)受損，對(duì)ACTH刺激所引起受體敏感性喪失以及該受體ACTH結(jié)合位點(diǎn)對(duì)ACTH高度親 禾口力的喪失等[Penhoat A, Naville D, ElMourabit H, et al. Functional relationships between three novel homozygous mutationsin the ACTH receptor gene and familial glucocorticoid deficiency. J Mol Med 2002 ;80 :406_411]。我們進(jìn)一步比較了接受ACTH 治療的嬰兒痙攣癥病人TCCT單體型攜帶者和非攜帶者的ACTH治療反應(yīng)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 TCCT單體型頻率分布中嬰兒痙攣癥病人明顯低于對(duì)照組，純合子和雜合子攜帶者的ACTH 反應(yīng)性優(yōu)于非攜帶者。此外，與ACTH治療反應(yīng)性相關(guān)的TCCT單體型跨越啟動(dòng)子區(qū)上游的_2 到-853區(qū)域，該區(qū)域恰好包括影響ACTH療效發(fā)揮的CREs區(qū)域。體外單核苷酸多態(tài)性功 能研究證實(shí)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性可使該基因的啟動(dòng)子活性降低[Slawik M，Reisch N, Zwermann O, et al. Characterization of anadrenocorticotropin(ACTH) receptor promoter polymorphism leadingto decreased adrenal responsiveness to ACTH. J Clin EndocrinolMetab 2004 ；89 :3131_3137]。因此，我們推測(cè)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)TCCT單體型 可能潛在地影響啟動(dòng)子的活性，使之對(duì)細(xì)胞內(nèi)cAMP的反應(yīng)性發(fā)生變化，導(dǎo)致受體對(duì)ACTH刺 激的敏感性降低，從而最終參與嬰兒痙攣癥患兒ACTH治療的耐藥機(jī)制。
核酸探針作為一種序列同源性的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)在分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、細(xì)胞生 物學(xué)、分子遺傳學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域中應(yīng)用，得以飛速的發(fā)展[曹軍勝.核酸探針及其應(yīng)用.延 安大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)2005，(02)]。核酸探針是根據(jù)核酸分子之間的互補(bǔ)配對(duì)原則設(shè) 計(jì)的一種檢測(cè)目標(biāo)序列是否存在的一段核酸序列，探針與目標(biāo)序列的這種結(jié)合稱為雜交。 核酸探針不僅是研究核酸結(jié)構(gòu)和功能的重要手段，還為傳染病的診斷、流行性病的調(diào)查、食 品衛(wèi)生檢查、腫瘤和遺傳病的早期診斷等打開了一個(gè)新的突破口，并且是法醫(yī)學(xué)研究的重要技術(shù)。在遺傳診斷方面，通過檢測(cè)某一病毒基因的缺失或堿基突變的情況，疾病基因與 另一非疾病基因的非隨機(jī)關(guān)系來確定某一遺傳疾病是否存在[Mercatali L，Valenti V, Calistri D,et al. RT-PCR determination of maspin and mammagIobinB in peripheral blood of healthy donors and breast cancerpatients.Ann Oncol,2006,17 (3) 424-428.]。特別重要的是如果能夠制作一系列遺傳疾病基因的探針，就可以在胎兒出生前 檢測(cè)是否帶有某種遺傳疾病，減少患病嬰兒的出生率。各種設(shè)計(jì)巧妙、性能優(yōu)良的新型核 酸探針被開發(fā)研制，并在基因分析、疾病診斷、生物工程等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。其中， 基于熒光標(biāo)記的核酸熒光分子探針具有背景較低、檢測(cè)靈敏度高、操作簡易、活體實(shí)時(shí)分析 等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于基因突變疾病的研究、活細(xì)胞中mRNA的檢測(cè)、蛋白質(zhì)的檢測(cè)及生物 芯片研究等，越來越受到人們的關(guān)注[Nazarenkol，Lowe B, Darfler Μ, etal. Multiplex quantitative PCR using self-quenched primers labeledwith a single fluorophore. Nucleic AcidsRes. 2002,30(9) :e37.]。因此制備一種簡便的試劑盒，來檢測(cè)嬰兒痙攣癥患兒的基因組MC2R啟動(dòng)子區(qū)是 否含有純和TCCT單體型，顯得非常重要，而本發(fā)明恰好解決了這一難題。本發(fā)明用熒光標(biāo) 記探針，通過雜交檢測(cè)痙攣癥患兒MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)是否攜帶純和TCCT單體型，以判斷該 患兒是否對(duì)ACTH治療敏感。本發(fā)明所述的檢測(cè)患兒痙攣癥患兒對(duì)ACTH藥物敏感性的試劑盒能快速、有效的 檢測(cè)出嬰兒痙攣癥患兒基因組MC2R啟動(dòng)子區(qū)是否含有純和TCCT單體型，從而快速判斷患 兒是否對(duì)ACTH藥物治療敏感。如果不攜帶此單體型，可較早選用其它抗癲癇藥物，為患兒 減少了不必要的痛苦，抓住治療時(shí)機(jī)，同時(shí)減輕患兒家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。


圖1為CCT單體型攜帶者與非攜帶者ACTH反應(yīng)性結(jié)果比較圖；

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性用于評(píng)估嬰兒痙攣癥患兒對(duì) ACTH藥物治療敏感的基礎(chǔ)上，提供了一種檢測(cè)嬰兒痙攣癥患兒對(duì)ACTH藥物敏感性的試劑 盒。本發(fā)明所要解決的關(guān)鍵問題在于，快速的診斷嬰兒痙攣癥患兒是否攜帶TCCT單體型， 進(jìn)一步判斷患兒是否對(duì)ACTH藥物治療敏感，再選擇合適的藥物為患兒醫(yī)治。本試劑盒包括檢測(cè)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)rsl893220號(hào)的SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì) 以及特異性核酸探針、檢測(cè)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)rs2186944號(hào)的SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)以 及特異性核酸探針、檢測(cè)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)-2T > C號(hào)的SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)以及特 異性核酸探針、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP混合液、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶、去離 子水。本試劑盒中所述的特異性引物對(duì)是指對(duì)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)rs 1893220號(hào)、 rs2186944號(hào)以及-2T>C號(hào)的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出靶位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。 設(shè)計(jì)這類引物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易完成的。優(yōu)選地，試劑盒中包含具有SEQ ID NO 1 和2所示序列的引物對(duì)、SEQ ID NO 3和4所示序列的引物對(duì)以及SEQ ID NO 5和6所示 序列的引物對(duì)。特異性地引物對(duì)可以用常規(guī)地合成技術(shù)進(jìn)行合成。本領(lǐng)域地技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明地引物不限于這兩對(duì)引物。 本試劑盒中所述的特異性熒光探針是指對(duì)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)rs 1893220號(hào)、 rs2186944號(hào)以及-2T > C號(hào)的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)，能通過熒光定量PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增出靶 位點(diǎn)的DNA片段的探針。設(shè)計(jì)這類引物對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易完成的。優(yōu)選地，試劑盒 中包含具有SEQ ID NO :3和4所示序列的探針。特異性地探針可以用常規(guī)地合成技術(shù)進(jìn)行 合成。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明的引物不限于這兩對(duì)引物，所有可用于熒光定量 PCR檢測(cè)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)rsl893220、rs2186944以及_2T > C的SNP位點(diǎn)的探針均在 本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明試劑盒的一人份組分盒含量包括
1.0μ 1IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液
0.2μ 125mM dNTP
0.5 μ 125mM MgCl2 溶液
0.02 μ 15unit/y 1 Taq DNA 聚合酶
0.2μ 125 μ M特異性引物
0.1 μ 125 μ M特異性核酸探針
5.68 μ 1去離子水
本試劑羞[的保存溫度位-20°C
具體實(shí)施方案下面結(jié)合具體的實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下面實(shí)施例中未表明具體條件的試 驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)的條件。實(shí)施例1檢測(cè)試劑盒的使用方法步驟一 DNA模板的抽取抽取嬰兒痙攣癥患兒外周血，提取DNA步驟二 熒光定量PCR試驗(yàn)使用檢測(cè)痙攣癥患兒對(duì)ACTH藥物敏感性的試劑盒，其中含有下列引物對(duì)和熒光 探針(下述核苷酸序列均為5’ -3’)有義引物1:CATGTTGCGGAGGCACAC(SEQIDNO1)
反義引物1TGCTTCTCCGTCCAAAAACT(SEQIDNO2)
有義引物2:AGAAACAGCCACTGGTTTGG(SEQIDNO2)
反義引物2TGGAATTGTCATCTTGCTCTTTT(SEQIDNO4)
有義引物3TGGGGCTATTCCCTTCTTCT(SEQIDNO5)
反義引物3CAGCTCTGAAGCAGGAACTTT(SEQIDNO6)
熒光探針1CTCAGAAACAGTCGAAGTCTGG(SEQIDNO7)
熒光探針2CCCCAGCCCCAAAAACCCAGG(SEQIDNO8)
熒光探針3CTTCTTAATGAAACTAATGAGC(SEQIDNO9) 其中，有義引物1，反義引物1和熒光探針1特異性針對(duì)檢測(cè)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū) rsl893220號(hào)的SNP位點(diǎn)；有義引物2，反義引物2和熒光探針2特異性針對(duì)檢測(cè)MC2R基因 啟動(dòng)子區(qū)rs2186944號(hào)的SNP位點(diǎn)；有義引物2，反義引物2和熒光探針2特異性針對(duì)檢測(cè)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)-2T > C的SNP位點(diǎn)。熒光定量PCR反應(yīng)體系為總體積10μ 1，包含濃度25ng/l·! 1的DNA模板2μ1、 1. Ομ 1的IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0. 2 μ 1的25mM dNTP、0. 5μ 1的25mMMgC12溶液、 0.02 μ 1的5unit/y 1 Taq DNA聚合酶、0. 2μ 1的25 μ M特異性引物的0. 1μ 1的25 μ M特 異性核酸探針以及5.68 μ 1的去離子水。在熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，發(fā)應(yīng)條件為 52°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進(jìn)行55個(gè)循環(huán)的95°C、45秒，60°C、90秒。反應(yīng)結(jié)束后在熒光 定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟三SNP基因型分析將熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量和正常照相對(duì)比，熒光探針1熒光信 號(hào)明顯高于正常對(duì)照，說明被檢測(cè)樣品中MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)rsl893220號(hào)的SNP位點(diǎn)為 C型，為ACTH藥物治療敏感；熒光探針2熒光信號(hào)明顯高于正常對(duì)照，說明被檢測(cè)樣品中 MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)rs2186944號(hào)的SNP位點(diǎn)為C型，為ACTH藥物治療敏感；熒光探針3熒 光信號(hào)明顯高于正常對(duì)照，說明被檢測(cè)樣品中MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)-2T > C的SNP位點(diǎn)為T 型，為ACTH藥物治療敏感。實(shí)施例2 利用本發(fā)明檢測(cè)漢族嬰兒對(duì)ACTH藥物敏感性本發(fā)明的一種嬰兒痙攣癥患兒對(duì)ACTH藥物敏感性的檢測(cè)試劑盒的優(yōu)選實(shí)施例 為，我們利用檢測(cè)試劑盒，對(duì)新診斷為嬰兒痙攣癥的患兒進(jìn)行了用藥前MC2R啟動(dòng)子區(qū)的篩 選，了解了患兒是否對(duì)ACTH治療有反應(yīng)。同時(shí)檢測(cè)了 ACTH治療不敏感的嬰兒痙攣癥患兒 MC2R啟動(dòng)子區(qū)是否含有TCCT單體型。我們將所述的嬰兒痙攣癥檢測(cè)試劑盒檢測(cè)到的基因分型后，再對(duì)嬰兒進(jìn)行針對(duì)性 治療。92例患兒中，TCCT攜帶者的46例，均給與ACTH肌肉注射治療，治療4周后評(píng)價(jià)治療 效果，30例患兒發(fā)作次數(shù)減少75%以上，5例患兒發(fā)作次數(shù)減少50-75%，即有35例患兒對(duì) ACTH治療有反應(yīng)率達(dá)76% ；而TCCT/0攜帶者35例，對(duì)ACTH治療有反應(yīng)率達(dá)71% ；我們也 檢測(cè)了非攜帶者患兒對(duì)ACTH治療反應(yīng)狀況，發(fā)現(xiàn)在22例中，只有23%病例的發(fā)生了發(fā)應(yīng) (圖 1)。發(fā)作次數(shù)減少75%以上是有效，無明顯減少是無效，50-75%是好轉(zhuǎn)，發(fā)作次數(shù)減 少50%以上即認(rèn)為對(duì)ACTH治療有反應(yīng)。探針檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，說明我們?cè)O(shè)計(jì)的探 針試劑盒精確度高，產(chǎn)品成形后使用準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)；快速的診斷患兒是否攜帶TCCT單體 型，所述的嬰兒痙攣癥檢測(cè)試劑盒將為臨床選擇用藥提供了很大幫助。顯而易見，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以通過本發(fā)明方法，用各種類型多肽的制備 特異性的抗體。上述實(shí)施例僅供說明本發(fā)明之用，而并非是對(duì)本發(fā)明的限制，有關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，還可以作出各種變化和變型，因此所 有等同的技術(shù)方案也應(yīng)屬于本發(fā)明的范疇，本發(fā)明的專利保護(hù)范圍應(yīng)由各權(quán)利要求限定。一種檢測(cè)嬰兒痙攣癥患兒對(duì)ACTH藥物敏感性的試劑盒.txt<110>中國人民解放軍總醫(yī)院<120> 一種檢測(cè)嬰兒痙攣癥患兒對(duì)ACTH藥物敏感性的試劑盒<160>9<210>1
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
CAGCTCTGAAGCAGGAACTTT
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>7
CAGCTCTGAAGCAGGAACTTT
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>8
CCCCAGCCCCAAAAACCCAGG
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探針
<400>9
CTTCTTAATGAAACTAATGAGC
權(quán)利要求
一種檢測(cè)痙攣癥患兒對(duì)ACTH藥物敏感性的試劑盒，包括檢測(cè)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)rs1893220號(hào)的SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)以及特異性核酸探針、檢測(cè)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)rs2186944號(hào)的SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)以及特異性核酸探針、檢測(cè)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū) 2T＞C號(hào)的SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)以及特異性核酸探針、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP混合液、MgCl2溶液、Taq DNA聚合酶、去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的異性引物對(duì)是指對(duì)MC2R基因啟 動(dòng)子區(qū)rsl893220號(hào)、rs2186944號(hào)以及-2T > C號(hào)的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出靶位 點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的特異性熒光探針是指對(duì)MC2R基 因啟動(dòng)子區(qū)rsl893220號(hào)、rs2186944號(hào)以及-2T > C號(hào)的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)，能通過熒光定量 PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增出靶位點(diǎn)的DNA片段的探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性引物對(duì)選自具有SEQID NO :1和2所示序列的引物對(duì)、SEQ ID NO 3和4所示序列的引物對(duì)以及SEQ ID NO 5和6 所示序列的引物對(duì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所含的特異性熒光探針選自具有SEQ ID NO :7、8禾Π 9所示序列的探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括濃度25ng/ μ 1的DNA模板2μ 1、1.0μ 1的IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0. 2 μ 1的25mM dNTP、 0. 5 μ 1 的 25mMMgC12 溶液、0. 02 μ 1 的 5unit/ μ ITaq DNA 聚合酶、0. 2 μ 1 的 25 μ M 特異性 引物的0. 1 μ 1的25 μ M特異性核酸探針以及5. 68 μ 1的去離子水。試劑盒供一人份檢測(cè) 使用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種嬰兒痙攣癥患兒對(duì)ACTH藥物敏感性的檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括檢測(cè)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)rs1893220號(hào)的SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)以及特異性核酸探針、檢測(cè)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)rs2186944號(hào)的SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)以及特異性核酸探針、檢測(cè)MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)-2T＞C號(hào)的SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)以及特異性核酸探針、用于熒光定量PCR檢測(cè)的常規(guī)試劑組件等。本發(fā)明的試劑盒通過同時(shí)檢測(cè)分析兒童MC2R基因啟動(dòng)子區(qū)SNP位點(diǎn)來預(yù)測(cè)嬰兒痙攣癥患兒對(duì)ACTH藥物的敏感性，為醫(yī)治嬰兒痙攣癥患兒選擇合適的藥物打下基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101906468SQ200910223428
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月16日
發(fā)明者丁瑛雪, 劉占利, 鄒麗萍 申請(qǐng)人:中國人民解放軍總醫(yī)院