專利名稱：：一種蠟圖案化硝酸纖維素膜、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生化分析產(chǎn)品開發(fā)及其應(yīng)用，特別涉及一種蠟圖案化硝酸纖維素膜、其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：硝酸纖維素膜作為一種常用的蛋白吸附、固定、反應(yīng)的基底材料已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，比如常見的斑點免疫，早孕試紙等。而相對于傳統(tǒng)的硝酸纖維素膜，本發(fā)明利用噴蠟打印的制作方法所得到的蠟圖案化硝酸纖維素膜具有蠟/硝酸纖維素交替組成、親疏水相間的結(jié)構(gòu)。微流控芯片(Microfluidics，Lab-on-a-chip)是一個跨學(xué)科的新領(lǐng)域，指的是把生化領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個系統(tǒng)，用以取代常規(guī)生物或化學(xué)實驗室的各種功能的一種技術(shù)。它是微納米技術(shù)的重要組成部分，也是系統(tǒng)生物學(xué)研究的主要技術(shù)平臺之一。微流控芯片的主要制作材料包括硅，玻璃，石英，聚合物(最常用的為聚二甲基硅氧烷和有機玻璃)。近年來，哈佛大學(xué)Whitesides小組開始使用低成本的濾紙作為芯片制作的基底材料(PatternedP即erasaPlatformforlnexpensive，Low—Volume,PortableBioassaysAndresW.Martinez,ScottT.Phillips,ManishJ.Butte，andGeorgeM.WhitesidesAngew.Chem.Int.Ed.2007,46，1318-1320)。這種以紙為基底材料的微流控芯片具有以下的優(yōu)點1、制作方法簡單、快速、成本低；2、反應(yīng)單元和驅(qū)動單元完全集成于芯片上；3、不需要軟件的控制，無需外界接口；4、不需要外動力源，適合野外分析；5、體積小、成本低、操作特別簡單。由于其具有發(fā)展便攜化、低成本診斷分析平臺的前景，因而這方面的研究也在迅速展開之中。而目前文獻報道的制作紙質(zhì)微流控芯片的基底材料主要為純纖維素組成的普通濾紙，比如Whatman公司生產(chǎn)的一號濾紙。但是這種純纖維素組成的普通濾紙蛋白吸附能力差，因而不適合作為蛋白固定的載體，不能在這樣的芯片上完成免疫分析等診斷分析操作。本發(fā)明采用由硝化纖維素組成的硝酸纖維素膜這一常用的具有很強蛋白吸附能力的材料取代普通的濾紙制作了紙質(zhì)微流控芯片，具有以下的優(yōu)點1、由硝酸纖維素膜制成的紙芯片具有很強的蛋白吸附、固定的能力，因而免疫分析可以在此芯片上很好的完成；2、與普通濾紙的平均孔徑(10到100微米)相比，硝酸纖維素膜的平均孔徑(0.45微米)更小，因而在噴蠟打印后的烘烤過程中，蠟在硝酸纖維素膜上的擴散可以得到更好的控制，因而可以得到最小100微米尺寸的微通道，同時得到的圖案的邊緣也更為均勻；3、硝酸纖維素膜的平均孔徑為0.45微米，因而微米尺寸的固體可以被截留，所以蠟圖案化硝酸纖維素膜可以用來過濾微米級別的雜質(zhì)，樣品處理能力更強；4、與普通濾紙相比硝酸纖維素的表面更為均勻，因而液體在其上面的流動更為均為和重復(fù)；5、與普通濾紙相比硝酸纖維素膜的纖維素更為致密，因而可以承受的機械強度更大。因此利用硝酸纖維素膜制備紙質(zhì)微流控芯片具有十分重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種蠟圖案化硝酸纖維素膜、其制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蠟圖案化硝酸纖維素膜，該硝酸纖維素膜為正面、背面與內(nèi)部均為蠟區(qū)域和硝酸纖維素區(qū)域交替出現(xiàn)、親水區(qū)域和疏水區(qū)域交替出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。這樣液體樣品就可以通過蠟的限制作用到達指定反應(yīng)區(qū)域，完成反應(yīng)分析。同時由于蠟的限制作用，各個反應(yīng)區(qū)域不會相互干擾。本發(fā)明還提供了硝酸纖維素膜的制備方法，用電腦設(shè)計所需要的圖案，然后用打印機將蠟打印到未處理的硝酸纖維素膜的表面，將打印好的硝酸纖維素膜放入高溫容器(如烘箱、熱板等)中烘烤，烘烤溫度為100攝氏度至150攝氏度之間，烘烤時間為4分鐘至1個小時之間，使蠟熔化并透過硝酸纖維素膜，形成蠟/硝酸纖維素交替組成、親疏水相間的硝酸纖維素膜，然后取出冷卻，即得到蠟圖案化的硝酸纖維素膜。整個過程可以在5-10分鐘之內(nèi)完成，操作簡便。本發(fā)明提供的硝酸纖維素膜的制作方法，所述制作工具采用商業(yè)化的噴蠟打印機和烘箱，打印操作靈活、簡便、快速，烘烤操作也同樣簡便快速。因而利用本方法可以大批量的制作低成本的蠟圖案化硝酸纖維素膜，非常適合于商業(yè)開發(fā)。本發(fā)明提供的硝酸纖維素膜的制備方法，所述高溫容器為烘箱、熱板等容器中一種；所述打印機為噴蠟打印機。本發(fā)明提供的硝酸纖維素膜可應(yīng)用于蛋白吸附、固定，蛋白圖案化等分析操作，并可有效的抑制蛋白固定中常常存在的咖啡環(huán)效應(yīng)；可應(yīng)用于免疫分析(如斑點免疫等)等分析操作；還可利用硝酸纖維素膜的亞微米的孔徑對微米尺寸的雜質(zhì)進行截留實現(xiàn)樣品純化等分析操作。也可應(yīng)用于尿液、血液、唾液、水等各種液體樣本的多指標(biāo)生化分析，如用于尿液檢測試紙、水質(zhì)監(jiān)測試紙等。本發(fā)明蠟圖案化硝酸纖維素膜可以完成尿液、血液、唾液、水等各種液體樣本的過濾，去除其中微米尺寸的雜質(zhì)(比如細(xì)胞等)，將尿液、血液、唾液、水等各種液體樣本直接應(yīng)用于生化分析中。本發(fā)明的創(chuàng)造性在于1、硝酸纖維素膜這一常用的具有很強蛋白吸附能力的材料取代普通的濾紙制作了紙質(zhì)微流控芯片，并在這種膜上完成了免疫分析操作；2、用噴蠟打印機快速、大批量制作快速蠟圖案化硝酸纖維素膜，操作簡便，制作速度快，非常適用于商業(yè)化。本發(fā)明具有制作方法簡單、快速、成本低等優(yōu)點。圖l噴蠟打印制作蠟圖案化硝酸纖維素膜的流程，其中1為硝酸纖維素膜，2為打印步驟，3為烘烤步驟，4為蠟圖案化硝酸纖維素膜，5為側(cè)面圖，6為蠟，7為硝酸纖維素。圖2打印上蠟的硝酸纖維素膜正面在烘烤前后的變化。圖3打印上蠟的硝酸纖維素膜后面在烘烤前后的變化。圖4打印上蠟的硝酸纖維素膜橫切面在烘烤前后的變化，其中1為蠟。圖5是通過蠟圖案化形成硝酸纖維素微通道在制作前后的變化，其中1為平行打印的正面，2為垂直打印的正面，3為平行打印的背面，4為垂直打印的背面，5為平行打印600微米通道，6為垂直打印600微米通道。圖6是硝酸纖維素膜的孔徑在制作前后的比較(標(biāo)尺為3微米)。圖7為蠟圖案化形成的通道的最小打印尺寸。圖8是蠟可以起到疏水間隔作用的最小尺寸，其中1為60微米。圖9為蠟圖案化形成圓形和方形圖案在硝酸纖維素膜的最小尺寸，其中1為200微米，2為1000微米，3為400微米。圖10是蠟圖案化硝酸纖維素膜蛋白吸附能力的表征及其與未處理的硝酸纖維素膜蛋白吸附結(jié)果的比較，其中1為蠟圖案化硝酸纖維素膜，2為硝酸纖維素膜。圖11為蠟圖案化硝酸纖維素膜蛋白吸附結(jié)果與加樣體積的關(guān)系(3毫米反應(yīng)尺寸)，從圖上可以看出只有當(dāng)包被體積超過4微升時，包被區(qū)域才能結(jié)果均勻。圖12為各種不同形狀的蛋白包被結(jié)果，其中1為1毫米XI毫米，2為1毫米，3為800微米，4為300微米，5為1000微米。圖13蠟圖案化硝酸纖維素膜用于人免疫球蛋白熒光免疫分析的工作曲線及50微克/毫升人免疫球蛋白免疫分析單元結(jié)果的均勻性分析，其中1為50微克/毫升的人免疫球蛋白的分析結(jié)果。圖14蠟圖案化硝酸纖維素膜用于人免疫球蛋白顯色免疫分析結(jié)果(利用膠體金作為免疫標(biāo)記并結(jié)合銀染色放大信號)，其中1為空白，2為1納克/毫升人免疫球蛋白，3為10納克/毫升人免疫球蛋白，4為100納克/毫升人免疫球蛋白，5為1000納克/毫升人免疫球蛋白，6為10000納克/毫升人免疫球蛋白。圖15蠟圖案化硝酸纖維素膜用于樣品過濾及其過濾能力與蠟圖案化的普通濾紙的比較(1微米的硅膠顆粒與小分子量的莧菜紅溶液作為測試溶液)，其中1為1微米的硅膠顆粒，2為莧菜紅溶液，3為蠟圖案化普通濾紙，4為蠟圖案化硝酸纖維素膜，5為正面圖，6為背面圖，7為50毫克/毫升，8為5毫克/毫升，9為0.5毫克/毫升。具體實施例方式下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。實施例1:蠟圖案化硝酸纖維素膜的制備方法用繪圖軟件在電腦上設(shè)計好所需要的圖案，然后用噴蠟打印機在硝酸纖維素膜上打印蠟圖案，再將表面打印有蠟的硝酸纖維素膜放入125攝氏度的烘箱中烘烤5分鐘(此過程中蠟將熔化并透過硝酸纖維素膜)，然后取出冷卻，即到了蠟圖案化的硝酸纖維素膜。具體流程如圖1所示(主要包括打印和烘烤兩步，整個流程可以在10分鐘之內(nèi)完成)。用這種制備方法制備的蠟圖案化硝酸纖維素膜的外觀，尺寸，表面形貌等表征如圖2，圖3，圖4，5，圖6，圖7，圖8，圖9所示。這種制作方法簡單、直接、成本低，制作速度非?？?，非常適合于大規(guī)模制作蠟圖案化硝酸纖維素膜，具有商業(yè)化前景。實施例2:用蠟圖案化的硝酸纖維素膜進行免疫分析，具體實施過程如下整個熒光免疫分5析過程(以人免疫球蛋白(IgG)作為模型分析物)說明如下1、在由蠟限定的3毫米尺寸的圖案化硝酸纖維素膜反應(yīng)單元中加入羊抗人免疫球蛋白溶液，由于硝酸纖維素具有較強的蛋白吸附能力，因而抗體蛋白會吸附在其表面上，蛋白在蠟圖案化硝酸纖維素膜上的包被表征如圖10，圖11，圖12所示；2、加入5毫克/毫升的牛血清白蛋白溶液(BSA)，BSA溶液對反應(yīng)區(qū)域進行封閉以降低非特異性吸附；3、加入洗滌液PBS+0.05%Tween20，洗滌反應(yīng)區(qū)域；4、加入人免疫球蛋白的樣品，樣品中的人免疫球蛋白與反應(yīng)區(qū)域中上包被的羊抗人免疫球蛋白免疫反應(yīng)；5、再加入洗滌液PBS+0.05%Tween20，洗滌反應(yīng)區(qū)域；6、加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白溶液，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白溶液與上一步反應(yīng)步驟中免疫反應(yīng)的產(chǎn)物結(jié)合，形成待檢測的免疫復(fù)合物；7、熒光檢測，得到免疫診斷結(jié)果。以上步驟中每步加入的溶液的體積為4微升。以人IgG作為模型分析物在該免疫分析系統(tǒng)上得到的人IgG的工作曲線，如圖13所示。蠟圖案化的硝酸纖維素膜進行膠體金標(biāo)記免疫分析并進行銀染色放大的過程如下1、同熒光免疫分析中1-5步驟；2、加入膠體金標(biāo)記的羊抗人IgG溶液，膠體標(biāo)記的羊抗人IgG溶液與上一步反應(yīng)步驟中免疫反應(yīng)的產(chǎn)物結(jié)合，形成待檢測的免疫復(fù)合物；3、再加入洗滌液PBS+0.05%Tween20，洗滌反應(yīng)區(qū)域；4、加入雙蒸水洗滌反應(yīng)區(qū)域；5、加入現(xiàn)配制的銀染色溶液，加入到反應(yīng)區(qū)域，進行銀染色。膠體金免疫結(jié)合銀染色得到分析結(jié)果如圖14所示。實施例3:用蠟圖案化的硝酸纖維素膜去除樣品的雜質(zhì)。由于硝酸纖維素膜的孔徑很小，只有O.45微米，因而微米尺寸的雜質(zhì)都可以得到截留，如圖15所示。1微米尺寸的硅膠顆粒在蠟圖案化的硝酸纖維素膜上得到了截留，而1微米尺寸的硅膠顆粒在蠟圖案化的普通濾紙上沒有被截留。而小分子莧菜紅在兩種蠟圖案化硝酸纖維素膜和普通濾紙上都可以通過，因而蠟圖案化的硝酸纖維素膜的樣品可以用于去除各種生物液體樣本如血液、尿液中微米尺寸的雜質(zhì)如細(xì)胞等，而在背面進行小分子的反應(yīng)分析操作。權(quán)利要求一種蠟圖案化硝酸纖維素膜，其特征在于該硝酸纖維素膜為正面、背面與內(nèi)部均為蠟區(qū)域和硝酸纖維素區(qū)域交替出現(xiàn)、親水區(qū)域和疏水區(qū)域交替出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。2.權(quán)利要求l所述硝酸纖維素膜的制備方法，其特征在于用電腦設(shè)計所需要的圖案，然后用打印機將蠟打印到未處理的硝酸纖維素膜的表面，將打印好的硝酸纖維素膜放入高溫容器中烘烤，烘烤溫度為100攝氏度至150攝氏度之間，烘烤時間為4分鐘至1個小時之間，然后取出冷卻，即得到蠟圖案化的硝酸纖維素膜。3.按照權(quán)利要求2所述硝酸纖維素膜的制備方法，其特征在于所述高溫容器為烘箱、熱板一些容器中一種。4.按照權(quán)利要求2所述硝酸纖維素膜的制備方法，其特征在于所述打印機為噴蠟打印機。5.權(quán)利要求1所述硝酸纖維素膜應(yīng)用于蛋白吸附、固定，蛋白圖案化；免疫分析；對微米尺寸的雜質(zhì)進行截留實現(xiàn)樣品純化一些分析操作。全文摘要本發(fā)明提供了一種蠟圖案化硝酸纖維素膜、其制備方法及應(yīng)用，該硝酸纖維素膜為正面、背面與內(nèi)部均為蠟區(qū)域和硝酸纖維素區(qū)域交替出現(xiàn)、親水區(qū)域和疏水區(qū)域交替出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)；其制備方法是用電腦設(shè)計所需要的圖案，然后用打印機將蠟打印到未處理的硝酸纖維素膜的表面，將打印好的硝酸纖維素膜放入高溫容器中烘烤，然后取出冷卻，即得到蠟圖案化的硝酸纖維素膜；本發(fā)明應(yīng)用于蛋白吸附、固定，蛋白圖案化；免疫分析；對微米尺寸的雜質(zhì)進行截留實現(xiàn)樣品純化等分析操作；本發(fā)明制作方法簡單、直接、成本低，制作速度非?？欤浅＿m合于大規(guī)模制作蠟圖案化硝酸纖維素膜，具有商業(yè)化前景。文檔編號G01N21/64GK101726591SQ20091022059公開日2010年6月9日申請日期2009年12月9日優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日發(fā)明者施維維,林炳承,秦建華,陸瑤申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所